用于发酵制备生物活性化合物的设施和方法

摘要

本发明涉及用于发酵制备生物活性材料的设施和方法，其中发酵罐被设置于隔离器中，该隔离器被设置于工作仓中或与工作仓接界，并且在隔离器和工作仓中相对于环境压力具有压力落差。

说明书

本发明涉及用于发酵制备生物活性材料的设施和方法，其中发酵 罐被设置于隔离器中，该隔离器被设置于工作仓中或与工作仓接界， 并且在隔离器和工作仓中相对于环境压力具有压力落差。

涉及生物活性化合物的工作，要求在制备中提高安全措施，以保 证工作人员远离可能的危险或中毒。生物活性化合物通常出于制药学 目的而制备或使用，因此特别是在制备过程中必须符合高纯度要求。 用于制备高纯度物质的设施的常规构造由对外封闭的第一内仓室和包 容它的第二仓室组成。在第二仓室中有操作生物材料的人员，而生物 材料的加工主要在第一仓室中进行。所述两个仓室通过可关闭的闸门 彼此连接。第一仓室通常是一个手套箱，由此借助手套可以由第二仓 室实施方法步骤。所述第二仓室通常是对外界封闭的，但通过可关闭 的闸门连接。在两个仓室中，理想地是无菌条件或洁净室条件。为了 避免生物活性材料被环境颗粒、微生物菌类和类似物污染，在第一仓 室内采用过压，典型地15Pa的过压。在第二仓室中相对于第一仓室 为低压，然而相对于环境是过压。经此防止了颗粒或菌类从第二仓室 进入第一仓室。所述生物活性材料由此针对环境污染受到保护。

在通过发酵方法制备生物活性化合物的情况下，具有在至少短时 间开启的设备中进行的方法步骤。这类方法步骤例如接种。该步骤通 常必须手工操作。在该过程中，在将具有起始材料(细胞库)的仪器 (容器、管形瓶)-即使短暂地-开启的情况下，可能形成浮质 (Aerosolbildung)。从预培养阶段到发酵开始的中间步骤也是这样， 其中将发酵罐的连接-即使短暂地-开启，由此可形成浮质。同样可 能的是，在发酵产品的精处理的过程中，生物活性物质形成浮质。在 此对环境构成暴露真菌、细菌或有毒物质的危险。由于相对于第一仓 室，在第二仓室中的相对低压，第一仓室中的浮质会进入第二仓室， 其可导致对第二仓室中的操作人员的危害。尽管如此，为了确保操作 安全，必须在这种情况下采取其它安全措施，例如给操作人员接种、 穿戴保护套衣等。

因此，对于可以通过发酵制备生物活性材料的方法和设施存在需 求，其中保护材料免于环境污染并同时减少或完全避免将人员暴露于 浮质中。

该任务是通过根据随附的权利要求的设施和方法根据本发明解决 的。

因此，本发明涉及借助发酵用于制备生物活性物质的设施和方法， 优选以高纯度制备，其中避免了生物材料被环境颗粒和菌类的污染并 同时减小对于操作生物材料的人员的风险可能性。优选该发酵方法包 含至少一种接种步骤。特别是该发酵方法包含至少一种手工进行的步 骤并特别优选该步骤是接种步骤。

根据本发明的方法和为此所使用的根据本发明的设施允许与浮质 形成相关或可能相关的成熟的生产技术和提纯技术的应用，而在此不 会通过浮质形成与对被委任制备和/或精处理的人员和环境的实质性 危险相关联。转而言之，根据本发明的设施和根据本发明的方法减少 了相关制备人员和环境暴露于生物活性材料、细菌和/或真菌，并同时 允许尽管与浮质形成相关的高效生产和提纯生物材料的成熟技术的应 用。

根据本发明的设施包含至少一个隔离仓(隔离器)，其被工作仓 包容或与工作仓接界。所述工作仓与环境通过一个压力闸门连接。在 隔离器和工作仓中均具有相对于环境的低压，其中在隔离器中的压力 低于工作仓中的压力。在压力闸门具有相对于环境压力的过压。所述 隔离器在此包含至少一个通过发酵制备生物活性材料的发酵罐。

在根据本发明的设施中，在隔离器中制备生物活性材料和/或精处 理。隔离器，如在此使用的，是相对于环境气密分界的体系，其原则 上与其环境存在能量交换，然而不允许与其环境的不经控制的物质输 送。其环境的经控制的物质输送，例如送入或取出器具、试剂、起始 材料、中间产物和终产物，可经一种或多种闸门、双活门容器，通过 所谓的β-端口与α-容器或α-袋的连接进行。在发酵产物或生物活性 材料的发酵和/或提纯前、期间或之后进行经控制的物质输送是可能 的。

所述隔离器可以，经适宜的装置调控，在过压或低压下操作。同 样可能的是在隔离器中制造一个惰性气体氛围。所述隔离器典型地采 用一个或多个空气输入管和空气输出管，在此，其典型地配有过滤器。 因此在隔离器中优选达到菌落数小于100，优选小于10和最优选小于 1菌落/m³。这类过滤器是技术人员已知的。这类隔离器的实例是HEPA (高效微粒空气)过滤器。

在隔离器中的仪器、设备或物件可以经外部控制地或经从工作室 操作的、在隔离器上隔离的伸入手套进行移动或操作。

所述隔离器优选完全或部分由生物惰性且易于清洁或者可以原位 去沾染或消毒的材料制备。在此优选特别是能用福尔马林、环氧乙烷 或蒸汽状的过氧化氢(VHP)消毒的材料。这类材料例如是玻璃、不锈 钢或塑料如PVC。优选隔离器如此制成，其内侧面完全或部分由玻璃 和/或不锈钢或其它适宜的材料如塑料构成。在此可以使用硬塑料和软 塑料(硬壁隔离器和软壁隔离器)。手套典型地由氯丁橡胶、氯磺化 聚乙烯(Hypalon)、乙烯或其它适宜的材料制备。

典型地给所述隔离器提供具有温度控制和调节的装置。

所述隔离器典型地设置于工作仓中或与工作仓接界。在隔离器和 工作仓之间具有压力落差。于此，隔离器中具有低于工作仓中的压力， 工作仓再度具有低于环境的压力。环境压力为101325Pa，但可以分 别根据地理位置或气候位置而变化。

典型地，隔离器中的操作压力落差是20至200Pa，优选40至100 Pa和最优选55至75Pa，其中压力落差相对于环境压力(101325Pa)。

通常，在隔离器中操作压力比在工作仓中的压力低10至100，优 选低20至80，特别优选低40至60Pa。

在本发明的实施方式中，在取决于测量技术和仪器的波动范围内， 隔离器与工作仓之间压差典型值为35至57Pa，优选约45Pa，即在 隔离器中的压力比在工作仓中的压力低约35至57Pa或约45Pa。

出入隔离器的空气输送优选通过过滤器进行，以使得在隔离器中 的菌落数最多为100，优选最多为10菌落/m³，最优选最多为1菌落/m³。

根据本发明的工作仓是气密性封闭体系，其一方面通过一个或多 个可关闭的开关气密性地连接用于进行物质交换和仪器交换与隔离 器，另一方面通过至少一个可关闭的压力闸门气密性的与环境连接用 于物质交换和仪器交换和/或进入。所述工作仓包容或接界于隔离器。 出入工作仓的空气输送优选通过过滤器进行，以使得在工作仓中的菌 落数最多为200，优选最多为100，且最优选最多为10菌落/m³。这类 过滤器例如以商品名HEPA-隔离器商购可得。

所述工作仓具有优选约19至26℃的温度，且相对空气湿度为40 至60％。第一和第二隔离器彼此独立地具有例如对于生物活性材料的 生产实施和提纯常规且适宜的温度和相对空气湿度。

在工作仓中具有高于隔离器的操作压力，然而相对于环境压力和 压力闸门具有压力落差。

典型地，在工作仓中的压力比环境压力低5至50，优选10至30， 特别优选12至18Pa。

在本发明的实施方式中，在取决于测量技术和仪器的波动范围内， 相对于环境压力的压差典型值为15Pa，即在工作仓中的压力比环境 压力低约15Pa。

所述工作仓与环境经至少一个可关闭的压力闸门连接。在闸门中 具有相对于环境压力10至100Pa的过压，优选20至80，最优选25 至35Pa。

通常，压力闸门相对于工作仓的压差为10至200，优选20至100， 特别优选40至60Pa。

在实施方式中，在取决于测量技术和仪器的波动范围内，压力闸 门与工作仓之间的压差典型值为45Pa，即在工作仓中工作压力比压 力闸门低约45Pa。

通常，压力闸门相对于隔离器的压差为10至300，优选50至200， 特别优选80至100Pa。在取决于测量技术和仪器的波动范围内，压 力闸门与隔离器之间的压差典型值为90Pa，即在隔离器中工作压力 比压力闸门低约90Pa。

在特别优选的实施方式中，本发明的设施包含至少另一个隔离器。 所述至少另一个隔离器可以如同第一隔离器存在于同一个工作仓中或 者与同一个工作仓接界并且其还可以与第一个隔离器气密性地例如经 一个或多个可关闭的闸门、双活门容器或端口连接。然而，所述隔离 器也可以不彼此相连。所述至少另一个隔离器优选具有如同第一个隔 离器一样的特性。

典型地，在本发明的隔离器中实施发酵步骤，优选产生生物活性 材料的发酵步骤。优选该发酵步骤包括一次或多次接种。因此根据本 发明的隔离器包含至少一个发酵罐。

典型地，在隔离器中还实施用于提纯生物材料所要求的措施的一 个或多个步骤。在此，发酵和提纯可以在一个且同一个隔离器中或者 也可以在不同隔离器中进行，例如在第一个隔离器中发酵，而在第二 个隔离器中提纯。

所述以生物活性材料合成为目的的发酵步骤在发酵罐中进行。在 此可选地涉及厌氧或喜氧工作的发酵罐。所述发酵罐是相应于各发酵 条件、制备工业级地构造的，如该领域技术人员已知的。发酵罐可涉 及批次发酵(Batch-Fermentation)、半批次发酵(Semi-Batch- Fermentation)、重复批次发酵(Repeated-Batch-Fermentation) 或连续发酵(kontinuierliche Fermentation)。优选涉及用于批次 发酵的发酵罐。

所述发酵步骤还可以包括用于主发酵罐的接种的前培育或初始培 育。在此所要求的不同的措施和相应方法工艺的装备是该领域技术人 员已知的并且包括尤其是一个或多个发酵罐，它们允许产生生物活性 材料的生产菌株的接种物的第一级和/或第二级扩增。由此，与其相关 的措施还包括例如工作细胞库的建立、细胞材料的第一级扩增、细胞 材料的第二级扩增和原本的发酵步骤，对于所述原本的发酵步骤的理 解特别是用于合成生物活性化合物的细胞的生长。该步骤优选在通过 各生产性有机体定义的温度或温度梯度下实施。在此，所述温度任选 地连续或不连续地与生产条件相适应。

在隔离器中，还可以实施一种或多种用于提纯生物活性材料所需 要步骤或措施。相应地，所述隔离器变化成为此所需要的装置。

生物活性材料的提纯还可以在根据本发明的设施的第二隔离器中 实施。如果在第二隔离器中仅实施用于提纯的措施的一部分，则在第 一隔离器或者一个或多个其它隔离器中实施所需要的措施的其它部 分。

某些制备生物活性材料所需要的或与设立的措施相关的步骤也可 以在隔离器之外实施，特别是，如果不与浮质形成相关的那些或者生 物活性材料预置于对制备和操作相关人员或环境不构成危险的型体或 容器中。

在产生生物活性材料的发酵下，优选涉及细菌的发酵，特别优选 菌种肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridium botulinum)。这同样适用于重 组体或基因修饰的其它异源表达体系(如E.coli)。

使用经安装的设备可以基本上合成所有生物活性物质，特别是制 备通过发酵性培育由微生物体合成的蛋白质。

所述通过发酵方法制备的生物活性物质，优选为毒素，特别是肉 毒杆菌毒素和最优选为肉毒杆菌神经毒素。

肉毒杆菌毒素由细菌肉毒梭状芽胞杆菌产生并以不同的血清型存 在：肉毒杆菌毒素A、B、C、D、E、F、G型。由肉毒梭状芽胞杆菌产 生的肉毒杆菌毒素是由肉毒杆菌神经毒素(即对于毒性效果负责的蛋 白质)和本身不具有毒性的复合蛋白组成的复合物。这些蛋白质是具 有不同摩尔质量的血细胞凝集素以及至少一种不凝集血细胞的蛋白 质。所述由肉毒杆菌神经毒素和细菌性复合蛋白组成的复合物一般称 作为肉毒杆菌毒素。其A、B和C型是商购可得的。A型例如以BOTOX^。 该复合物进一步以不同蛋白质组成的复合物加工并且纯度直至肉毒杆 菌神经毒素本身。因此在本发明的范围内，术语肉毒杆菌神经毒素是 用于描述对毒性作用负责的蛋白质，即脱离于细菌复合蛋白质的高纯 度的肉毒杆菌毒素。A型的肉毒杆菌神经毒素具有分子量为约150kDa 并且申请人以商标名Xeomin^进行商业销售。

在本发明的范围内适宜的是所有形式的“肉毒杆菌毒素”，特别 是源自肉毒杆菌神经毒素和复合蛋白的不同血清型、不同复合物、肉 毒杆菌神经毒素本身，以及经修饰或相应地重组制备的肉毒杆菌毒素 或肉毒杆菌神经毒素包括相应的突变型、缺失型等。对于适宜的突变 体，我们采用在WO 2006/027207 A1中描述的相关突变体。此外在本 发明的范围内制备不同血清型的混合物(以复合的或高纯度和/或重组 的形式)，例如A型和B型的肉毒杆菌毒素的混合物或A型和B型的 肉毒杆菌神经毒素的混合物。

A型和B型的肉毒杆菌神经毒素的制备例如描述于根据专利申请 WO 00/74703。由于，对于肉毒杆菌神经毒素复合物和复合蛋白的(经 分离的)肉毒杆菌神经毒素实质上缺失免疫性的有利特性，由此存在 特别高的提供用于肉毒杆菌神经毒素安全可靠地工业化生产的设施和 方法的需求，如本发明所做的。

取决于所生产的生物化合物，技术人员自由选择具体使用的隔离 器的挑选和/或数目。在在此详细描述的肉毒杆菌神经毒素的具体提纯 的范围内，优选使用至少两个隔离器。所述隔离器在此特别是鉴于其 中或其部分区域的主控温度而区分。因此在本发明的范围内优选，第 一隔离器在较高的温度下例如约20至约50℃运行，且第二隔离器在 较低的温度例如约-5至+25℃范围内运行。在第一隔离器中就此而言 进行那些制备以及提纯步骤，其需要相应较高的温度或可以在该温度 下实施。对此包括特别是接种、发酵和/或生产菌株的沉淀。相反在第 二隔离器中进行制备方法的那些步骤和特别是神经毒素的提纯，其需 要相应较低的温度或可以在该温度下以特别有利的方式实施。

进一步公认的是，那些在制备中的一般性步骤和发酵、提纯中的 特别步骤，它们可以在两个温度范围下并由此在两个隔离器的每一个 中实施，最后在那样的隔离器中实施，所述隔离器出于尺寸的观点和 由于尺寸导致的维持用于实施反应步骤的相应反应条件的能量消耗， 特别是温度，或者出于各个措施的可操作性或可实施性的观点是有利 的。

第二隔离器是原则上如同第一隔离器相类似地构造的，但具有用 于在第二隔离器中实施所计划的提出步骤或为此所需要的措施的装置 和装备物件或制备工艺的装备特征。所述相应的装备物件是本领域技 术人员已知的。优选在第二隔离器中进行提纯步骤是选自下组的措施， 包括沉淀、提取、离心、透析和色谱法。相应地，第二隔离器含有一 个或多个沉淀装置、提取装置、离心装置、透析装置和/或色谱装置。 优选沉淀装置包含反应容器，其中含有针对沉淀的待抽取溶液，配置 有加入沉淀所需要的化合物的输送管。此外沉淀装置原则上包含去除 剂(Entfernungsmittel)以去除上清液或沉淀。适宜的装置在此是技 术人员已知的。提取装置典型地包含反应容器，其中含有待提取的液 体、用于加入提取介质的输送管以及设备以从提取液体分离含有提取 物的液体。离心装置典型地包含离心机，以分离液-液混合物或液-固 混合物。色谱装置典型地包含色谱柱，其用色谱材料填充，以及输入 和输出以及具有适宜介质的容器，该介质用以输给色谱柱或洗脱色谱 柱。在色谱法的情形下可以例如涉及分子排阻色谱、HPLC或亲和色谱。

在本发明的范围内，对于使用两个或多个隔离器的情况下，它们 彼此相连，以使得包含两个隔离器的设施的整体仅含有一个输入和输 出管，并且两个隔离器用一个或多个中间管道相连。然而，也在本发 明的范围内第一隔离器和第二隔离器和/或每个另外的隔离器分别地 彼此独立地具有一个输入和输出管。

第一和第二隔离器优选具有相对于外压力较低的内压。在本发明 的范围内，两个隔离器具有相同的内压。然而也可以在本发明的范围 内，两个隔离器具有不同的内压。在此特别优选相对于另一个隔离器 内压较低的隔离器，内压较低的隔离器中实施的方法步骤决定的浮质 形成的可能性较高。

在使用第二隔离器的情形下，隔离器间的连接以通道的形式存在， 例如以闸门的形式，在两个隔离器之间是有利的，因为由此可以确保 经生产的或经提纯的材料向制备或提纯的不同阶段的输送，而无需打 通隔离器所构造的阻隔。设施或各个隔离器的每一个或本发明的设施 的至少一个隔离器具备灭菌设备的构造是基本上用于相同目的的。相 应的灭菌设备是本领域技术人员已知的并包括例如用于产生蒸汽状过 氧化氢的发动机。蒸汽状过氧化氢的应用在此出于在隔离器中低压条 件的视角而言是特别有利的。

在另一个方面，本发明涉及用于发酵性制备生物活性化合物的方 法，其中该方法包含用于制备生物活性化合物的发酵步骤和生物活性 化合物的提纯，在此所述发酵制备和/或提纯完全或部分地在一个或多 个隔离器中进行。优选发酵步骤和提纯的一个或多个部分在第一个隔 离器中进行并且提纯的一个或多个部分在第二个隔离器中进行。在优 选的实施方式中，发酵步骤至少包含接种步骤。优选该步骤手工操作。 也在本发明的范围内，使用其它隔离器。所述生物活性材料优选涉及 肉毒杆菌毒素，特别是涉及在此描述的肉毒杆菌神经毒素。与根据本 发明设施所公开特征相关的还有各个以及根据本发明方法的任意组合 所表现的特征。

与提纯相关的措施是离心、透析、提取、沉淀、鱼精蛋白硫酸盐 -沉淀、硫酸铵-沉淀、典型地以丸斑存在的沉淀物的溶解、透析、色 谱步骤或色谱法和过滤。色谱法优选涉及顺序进行多个的单个色谱法。 在此可分别涉及同一个色谱法、或不同的色谱法。优选在制药学活性 化合物肉毒杆菌神经毒素A型的情形下，涉及在使用适宜的柱材料下 的三个色谱法步骤。在此可以且优选将各洗脱液在加载于下一个柱之 前经过透析。

在实质性发酵和从细胞分离发酵介质之后，将发酵介质进行第一 次沉淀，目的是去除大的蛋白质。该沉淀优选在第一隔离器中进行。 如此方式获得的沉淀物的离心优选已经在第二隔离器中进行。所述沉 淀优选是柱沉淀。对这类酸性沉淀的反应条件是本领域技术人员已知 的。典型地使用3N的H₂SO₄，用以将上清液酸化至pH为3.5。所述离 心典型地在2400×g于4℃下进行20分钟。通过离心所获得的丸斑优 选在此用水清洗。

在使用梭状芽胞杆菌-菌株的情形下，优选涉及A型肉毒梭状芽 胞杆菌，其作为适宜的介质中的原培养物在确保稳定的温度下储存。 对于发酵优选采用于DasGupta B.R.等人在Toxicon，22卷，Nr.3， 414～424页，1984中所描述的方法。在此将2％的N-Z-胺A型介质于 0.5％的酵母提取物和0.6％的高压灭菌的酵母糊混合，并用4N NaOH 调节至pH为7.2，如此方式制备的介质随即高压灭菌。向该介质中加 入另外地高压灭菌的葡萄糖(20重量％每体积)，获得在介质中0.5 ％的葡萄糖终浓度。所述温育在37℃下无搅拌地进行，在此所述发酵 在96小时后中断。在本发明的范围内，除了以上所描述的批次发酵还 可以进行半批次发酵、重复批次发酵或连续发酵。为此需要的措施和 制备工艺要求是本领域技术人员已知的。

在另一个步骤中，从沉淀物的丸斑出发，再此溶解，目的是将毒 素从丸斑中释放出来。对此的措施是技术人员已知的并且尤其是 DasGupta B.R.等人(aaO)中所描述的。例如提取可以借助0.1 M的柠 檬酸-柠檬酸三钠盐，pH 5.5进行1小时。该提取与随后进一步的离 心步骤相结合，典型地在9800×g于4℃下20分钟。如此方式获得的 丸斑然后可以任选地再度如前述进行提取。提取液的上清液，和在重 复提取的情形下两个上清液，将进行鱼精蛋白硫酸盐-沉淀。该沉淀 在8℃过夜进行。之后将沉淀物再度于4℃下12000×g离心20分钟。 在鱼精蛋白硫酸盐-沉淀步骤中特别是去除了DNA。

在离心后所获得的上清液将在第一隔离器或在第二隔离器中进行 硫酸铵-沉淀，其中将其它较大的蛋白质去除。在硫酸铵-沉淀之后 将再度导入离心步骤并随后将如此方式获得的丸斑再度溶解并任选地 进行透析。优选将经透析的由丸斑获得的提取物随后再次离心并进行 目的为提纯肉毒杆菌神经毒素的连续色谱步骤，特别是直至均质的提 纯。各个色谱步骤在此特别用于去除鱼精蛋白硫酸盐、残余的DNA、 部分小蛋白质和中等大小的蛋白质以及肉毒杆菌-神经毒素-蛋白质 -复合物的血细胞凝集素。出于此目的，在优选的实施方式中顺序进 行多个色谱法步骤。然后将洗脱物过滤。所述过滤在此用于减少洗脱 物中的菌落，然后优选获得无复合蛋白的纯净的肉毒杆菌神经毒素。 任选地可以在过滤前将洗脱物稀释或可以加入适当的辅助剂。

在进一步的步骤中，在辅助剂的加入后再次进行灭菌-过滤。所述 过滤在反应容器中进行，然后，优选在分开的工艺步骤中进行冷冻干 燥。封存如此方式的冷冻干燥产物。

本领域技术人员公认在接种前以及在不同的工艺步骤(优选在第 一隔离器中的硫酸铵-沉淀和过滤)后，进行去污染或灭菌。所述灭 菌优选涉及借助蒸汽状过氧化氢(VHP)的实施。

在给出的说明书和权利要求中公开的本发明的特征可以单独也可 以以任意组合的方式对于以不同实施方式实现本发明是重要的。