一种大黄欧文氏菌及其在制备异麦芽酮糖中的应用

摘要

本发明公开一种大黄欧文氏菌(Erwiniarhapontici)NX－5及利用该菌生产蔗糖异构酶进而制备异麦芽酮糖的方法。将该菌株CGMCC No.2222接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中进行好气培养，离心或超滤获得含蔗糖异构酶的细胞，进而直接采用游离的含蔗糖异构酶的细胞转化蔗糖生成异麦芽酮糖或固定化含蔗糖异构酶的细胞后转化蔗糖生成异麦芽酮糖。采用该菌株使蔗糖转化率高达99.5％(w/w)，异麦芽酮糖转化率达90％，转化液中异麦芽酮糖浓度达500g/L，无水解副反应，转化液中几乎不含葡萄糖和果糖，随着反应进行也不会使产物异麦芽酮糖转化为其他成分，对工业化生产异麦芽酮糖十分有益。

说明书

技术领域

本发明属于发酵工程和酶工程技术领域，涉及一种产蔗糖异构酶的微生物菌株大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)NX-5，以及将它用于异麦芽酮糖的生产。

背景技术

异麦芽酮糖(6-O-α-D-吡喃葡糖基-D-果糖，Isomaltulose)是一种还原性糖，在天然蜂蜜和甜菜汁中少量存在，具有与蔗糖最为类似的物理性质和口感。作为蔗糖的替代品它具有如下优点：(1)由于它被人体食用后在血液中释放单糖的速度比蔗糖慢且不刺激胰岛素分泌，可供糖尿病人群和减肥人士食用；(2)不被导致龋齿的口腔链球菌代谢，不腐蚀牙齿；(3)在人肠的微生物群区中，选择性刺激双歧杆菌的生长；(4)性能食用安全性高，被美国FDA给予食品安全最高等级“GRAS(公认安全)”，对其每日摄入量不作限制，不会令人产生腹胀、肠鸣等不良反应。(5)拥有极低的吸湿性，用它做的硬糖不会像用普通的糖或其他糖替代品一样变粘，甚至可以被松散地包装。因为吸湿性小，所以稳定性强，货架期也更长。这是木糖醇和麦芽糖醇等功能糖醇难实现的。(6)异麦芽酮糖醇被市场认可的另一主要优点是口味纯正，它几乎可以代替蔗糖的任何用途，消费者分辨不出与有糖食品的区别，使无糖食品“美味不打折”。由于这些特点，异麦芽酮糖(醇)成为目前最受欢迎的蔗糖替代品。

异麦芽酮糖由蔗糖异构酶EC 5.4.99.11(Sucrose isomerase)，或叫异麦芽酮糖合成酶(Isomaltulose syntheses)，蔗糖葡萄糖基变位酶(Sucrose glucosylmutase)，α-葡糖基转移酶(α-glucosyltransferase)催化蔗糖转变而成，已知有一些菌种能产生该酶。美国专利4,359,531采用大黄欧文氏菌转化蔗糖，大约70-95％的蔗糖转变成异麦芽酮糖。美国专利4,390,627描述了从Protaminobacter rubrum(红色精朊杆菌)固定蔗糖变位酶生产异麦芽酮糖的方法。美国专利4,670,387描述了使用Erwinia rhapontici，Protaminobacter rubrum，Serratia plymuthica(粘质沙雷氏菌)的固定化菌体生产异麦芽酮糖的过程，大约可以转化70-95％蔗糖。美国专利4,857,461公开了从Protaminobacterrubrum，Serratia plymuthica和Erwinia carotovora菌得到的固定化粗酶连续生产异麦芽酮糖的过程。美国专利No.5,229,276和No.5,336,617描述了用Agrobacteriumradiobacter(放射性土壤杆菌)的固定化菌体生产海藻酮糖和异麦芽酮糖的过程，异麦芽酮糖占10％以下。虽然上述几种细菌能够把蔗糖转变成异麦芽酮糖，但产量很不稳定，转化率为8～86％。而且，这些生产异麦芽酮糖的菌株在催化蔗糖转化过程中，除了主产物外，酶转化液中还存在海藻酮糖、异麦芽糖、异松三糖及由于蔗糖水解而生成的葡萄糖、果糖副产物，产物特异性不高，一方面降低了目的产物的收率，另一方面使下游过程变得十分困难，生产成本大大增加。我们对不同来源的异麦芽酮糖生产菌进行对比分析。发现大黄欧文氏菌NX-5 CGMCC No.2222转化所生成的副产物少，更利于进一步工业化生产，如表1所示。

近来专利CN1434861涉及两个新菌株，新加坡克雷伯氏菌(Klebsiellasingaporensis)LX3及LX21，有较高的酶活，异麦芽酮糖的含量超过87％，公开了新型蔗糖异构酶的核苷酸序列以及该基因克隆表达于甘蔗、玉米、甜菜等植物使其生成异麦芽酮糖。筛选能够高效生产异麦芽酮糖的菌株，进一步理解酶的催化作用机制仍是十分有意义的。

发明内容

本发明的目的是提供一种高产蔗糖异构酶的大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)。

本发明的另一个目的是提供利用上述大黄欧文氏菌制备异麦芽酮糖的方法。

本发明目的可以通过下列措施来达到：

本发明人实验室选育并保藏的微生物菌株大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)NX-5，目前该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，登记入册的编号是CGMCC No.2222，保藏日期是：2007年10月22日。以此菌作为生产菌株。

CGMCC No.2222菌株具有下述性质：

(1)菌落形态学特征：

在营养琼脂上，30℃培养24h出现淡黄色小菌落，菌落呈圆形，表面光滑，粘状，中央凸起，不透明。适当延长培养，菌落增大，细胞的尺寸和形状变化很小。

(2)生理与生化特性：

a.培养温度：25～35℃，最适温度为30℃；

b.在pH 5～8范围内生长；

c.色素产生：产黄色素；

d.耐NaCl浓度：在5％浓度可以生长。

(3)营养特征：

大黄欧文氏菌NX-5的培养基中不需要添加生长因子。有机氮或无机氮都可以作为氮源使用。

本发明利用大黄欧文氏菌CGMCC No.2222生产蔗糖异构酶进而生成异麦芽酮糖的方法是将该菌株接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中进行好气培养，离心或超滤获得含蔗糖异构酶的细胞，进而直接采用游离的含蔗糖异构酶的细胞转化蔗糖生成异麦芽酮糖或固定化含蔗糖异构酶的细胞后转化蔗糖生成异麦芽酮糖。

产酶条件：

将大黄欧文氏菌NX-5 CGMCC No.2222斜面活化一天后(斜面培养基成分除含有碳源、氮源、无机盐等之外，还含有2％的琼脂)，接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中。培养基中各组分的含量均为重量体积百分比，即g/100ml培养基，以下同。碳源用量与培养基之比2～10g/100ml，氮源用量与培养基之比0.2～5g/100ml，无机盐用量与培养基之比0.01～1g/100ml，其余为水。培养基的碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、淀粉水解液中的一种或多种；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH₄)₂SO₄、NH₄Cl中的一种或多种；无机盐为钠盐、磷酸盐、磷酸二氢盐中的一种或多种。培养基的初始pH范围为6.0～8.0，发酵温度25～35℃，摇床转速100～200r/min，培养8～20h，细胞湿重达20g/L，发酵液酶活达2.5～5.0U/ml，然后离心或超滤获得含蔗糖异构酶的细胞，离心条件：室温条件下，5000～10000r/min，10～30min。采用超滤法所用超滤膜孔径0.01～0.1μm，操作压力0.1～0.6Mpa，超滤膜截流分子量为10⁵～10⁶道尔顿。

蔗糖异构酶酶活测定方法：

用0.1M的磷酸钾缓冲液(pH7.0)配制含40％(w/v)蔗糖和75g/L细胞悬浮液的混合物，取该混合物1ml于30℃的水浴内反应60min后，置于100℃的沸水中10min以终止酶反应，然后用自来水冷却至室温。反应混合物经过离心和过滤后用HPLC法测定异麦芽酮糖生成量。一个单位的蔗糖异构酶酶活定义为在30℃下，pH为7.0的条件下每分钟生成1μmol的异麦芽酮糖的酶量。

酶法转化：

将含蔗糖异构酶的细胞进行固定化，固定化方法为：配制1～3％(即1～3g/100ml)浓度的海藻酸钠，加入10～25％的细胞(即每100ml海藻酸钠溶液中加入10～25克的细胞)，并添加5～10％硅藻土(即每100ml海藻酸钠溶液中加入5～10克的硅藻土)，再用浓度为1～4％的CaCl₂溶液(g/100ml)将包埋材料海藻酸钠固定成型，以此作为酶源进行反应。除了海藻酸钠作为固定化载体包埋外，还可以用卡拉胶、甲壳素等载体包埋细胞。

具体地说：将游离含蔗糖异构酶的细胞或固定化后含蔗糖异构酶的细胞填充至反应罐中，加入450～600g/L的蔗糖溶液，或者将按照上述固定化方法制得的固定化细胞装入填充式柱反应器中，柱的体积不限。该反应器可以0.5～5ml/min单向流加或循环连续流加450～600g/L的蔗糖溶液，在25～35℃的条件下进行酶转化反应，反应时间10～15h，通过调整流速，控制蔗糖的转化率在90～100％之间，收集流出液，浓缩结晶得到异麦芽酮糖。

本发明的有益效果：

本发明筛选到一种能够高效转化蔗糖生成异麦芽酮糖的菌株，蔗糖转化率最高可达99.5％(w/w)，异麦芽酮糖转化率可达90％，转化液中异麦芽酮糖浓度可达500g/L，异麦芽酮糖/海藻酮糖比率近10∶1，最主要的没有水解副反应，转化液中几乎不含葡萄糖和果糖，另外随着反应进行也不会从产物异麦芽酮糖转化为其他成分，这些性质是以往报道的菌株所不具有的，这对工业化生产异麦芽酮糖十分有益。

参考背景技术文献材料对不同异麦芽酮糖生产菌进行对比分析，结果如表1所示：

                         表1.不同异麦芽酮糖生产菌的比较

    菌株最适pH最适温度(℃)异麦芽酮糖/海藻酮糖比率  副产物比率  (％)  E.rhapontici  S.plymuthica  Klebsiella sp.LX3  CGMCC No.2222    7.0    6.0    6.0    7.0    30    30    35    30    5∶1～8∶1    8∶1    8∶1    10∶1    10.5    11.7    9.4    3.6

结果发现大黄欧文氏菌NX-5 CGMCC No.2222转化所生成的副产物少，更利于进一步工业化生产。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步说明，但对本发明没有限制。

实施例1

斜面培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl5g/L，琼脂20g/L，pH7.0。

摇瓶培养基：蔗糖50g/L，酵母膏10g/L，Na₃PO₄·12H₂O 5g/L，pH7.0。

把大黄欧文氏菌NX-5 CGMCC No.2222在斜面培养基上30℃培养24h，然后接一环此菌于摇瓶培养基中，30℃培养10h，摇瓶转速200r/min，得到的发酵液中菌体的含量为20g/L，产酶达2.5～5.0U/ml，以游离细胞转化，称取10g的细胞加入100ml450g/L的蔗糖溶液中(细胞添加量按每100g细胞转化1L55％的蔗糖溶液计)，在30℃的条件下，于摇瓶中振荡转化生产异麦芽酮糖，反应时间8h，反应中止后测底物转化率和产物浓度。蔗糖转化率为99.5％，异麦芽酮糖转化率达90％。

实施例2

以50g/L麦芽糖为碳源，5g/L豆饼粉为氮源，培养基其它成分和菌体培养条件同实施例1，配制1.5％的海藻酸钠胶体溶液，与生理盐水调制的菌悬液混合均匀后，加入8％的硅藻土吸附后，用注射器滴入2％的CaCl₂溶液中固化，制成直径约为3～4mm的球状固定化细胞，于4℃冰箱中静置数小时，然后倾去上清液，经蒸馏水洗涤2次，将10g湿细胞以海藻酸钠包埋得到20g固定化细胞，在30℃的条件下，在摇瓶中以此转化100ml550g/L的蔗糖溶液，每批转化时间10h，转化40批次，得到蔗糖的平均转化率为99.5％，异麦芽酮糖的平均转化率为88％。

实施例3

将葡萄糖225g，玉米浆45g，NaCl22.5g，pH6.0，用水定容到4.5L，配成培养基，装入一个7.5升玻璃搅拌发酵罐中，121℃蒸汽灭菌15min。配制种子培养基：蔗糖50g/L，酵母膏10g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 5g/L，pH6.0。将大黄欧文氏菌NX-5 CGMCC No.2222接一环于种子培养基中，30℃培养8h得种子液，将种子液按发酵液体积3％的接种量接入冷却后的发酵培养基中，30℃培养(通风量1vvm，搅拌转速为600r/min)12h。将发酵液在超滤器内进行滤菌处理，超滤膜截流分子量为10⁶道尔顿，操作压力为0.2MPa，控制温度50℃，膜面速度4m/s，将截流得到的90g菌体按实施例2的方法固定化后，装入2L的反应罐中，加入550g/L的蔗糖溶液900ml，反应温度30℃，搅拌转速50r/min，反应时间13h，蔗糖转化率为99％，异麦芽酮糖转化率达85％。

实施例4

以50g/L淀粉水解液为碳源，20g/L尿素为氮源，培养基其它成分和菌体培养条件同实施例1，称取160g湿菌体，加无菌水100mL，于30℃水浴保温；称取10g卡拉胶，加无菌水200mL，充分浸泡，加热溶解。将两者迅速混合，铺平板，于4℃冰箱放置30min，凝固后切成2*2*2左右大小的颗粒，再于2mol/LKC1溶液中浸泡30min，使其充分凝固。滤出颗粒用生理盐水洗涤2-3次，4℃保存备用。所得菌体形成固定化细胞350g，装入φ4×45cm的填充床式柱反应器中，(两根串联的夹套式固定化柱)，固定化细胞的装柱量为80％(v/v)，以1ml/min的流速单向流加550g/L的蔗糖溶液，30℃的条件下进行酶转化，15h为一个批次。该装置连续运行30天，转化蔗糖溶液55L，得到蔗糖的平均转化率为99.5％，异麦芽酮糖的平均转化率为88％。

实施例5

菌体培养同实施例1，称取过30目筛的甲壳素，用40％NaOH在80℃下脱乙酰基，然后按湿菌体含量2％配成水溶液，用NaOH调节pH至微酸性；把菌体细胞与等量生理盐水混匀；用注射针筒把上述混合物滴入3％的Na₃PO₄溶液中，在磷酸缓冲溶液中浸泡固化24h，即成直径为2mm的小球。将400g固定化小球装入至反应罐中，加入2L600g/L的蔗糖溶液，按实施例3的条件进行酶转化反应，转化42批次，得到蔗糖的平均转化率为99％，异麦芽酮糖的平均转化率为85％。