H3型流感病毒血凝素空间构象模拟抗原表位及其应用

摘要

本发明属于多肽生物技术领域，公开了H3型流感病毒血凝素空间构象模拟抗原表位及其应用。该H3型流感病毒血凝素空间构象模拟抗原表位肽的序列为SEQ ID No.1。本发明利用抗重组HA1兔血清IgG筛选噬菌体12肽库，用噬菌体ELISA、DNA测序、免疫印迹、软件分析等方法对挑取的克隆进行分析，最终在随机噬菌体12肽库中筛选到能够与抗重组HA1兔血清IgG特异性结合的小肽。本发明提供的空间构象模拟抗原表位可制备H3型流感病毒感染的诊断试剂盒。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种H3型流感病毒血凝素空间构象模拟抗原表位及其应用。

背景技术

流感病毒属正粘病毒科，为单股负链、分节段RNA病毒，基因组由8个节段组成，编码10种病毒蛋白，根据流感病毒内部蛋白抗原型的不同分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，又根据流感病毒表面蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶抗原性的不同将A型流感病毒分为不同的血清亚型，现已发现15种不同的HA亚型(H1-H15)。H3型流感病毒可感染人、禽、猪、马等多种哺乳动物，1968年H3N2型流感病毒曾造成突发性流感大流行，严重危害公共安全。

血凝素是流感病毒最主要的表面抗原，它能够诱导机体产生相应的中和抗体以中和病毒的感染。血凝素以三聚体的形式镶嵌在病毒包膜上，每个单体由两个经二硫键连接的蛋白亚单位组成，它们来自于一条前体链(HA0)，经蛋白水解酶的切割而形成，分别命名为HA1和HA2，HA1负责病毒与宿主细胞受体的结合与吸附，病毒吸附完成以后，病毒粒子通过宿主细胞的内吞作用进入细胞，在体内酸性环境中，HA2的疏水性融合多肽转移到内体膜的靶位上，介导内体膜与病毒包膜的融合。每个HA单体都由球形的头部和颈部组成，其中球部在HA1亚单位内，颈部由全部HA2和部分HA1亚单位组成。

随着多肽疫苗研究的进展，H3型流感病毒HA的抗原表位逐渐成为研究的热点。抗原表位的定位常规方法是首先对抗原进行化学降解、修饰获得多肽片段，或合成一系列来源于抗原的多肽片段，通过检测这些多肽片段与相关抗体的结合活性而得到。这些方法比较费时费力并且只能寻找到序列表位。也有人用化学合成肽库的方法筛选抗原表位，但筛选难度较大，目的肽段不易富集，并且也不能筛选到空间构象表位。

目前对H3亚型流感病毒血凝素序列表位的研究已取得很大进展，已发现并经证实的T细胞表位(HA127-133)和B细胞表位(HA91-108)等。对B细胞表位而言，空间构象表位的意义远大于序列表位。然而至今仍未有对H3型流感病毒HA空间构象表位的报道。

噬菌体展示技术产生于1985年，Missouri大学的Smith博士首先在Science上报道了利用丝状噬菌体在体外表达外源基因，并使外源基因表达产物融合在噬菌体的外壳蛋白中形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面。目前能用于蛋白质/多肽展示的噬菌体系统除丝状噬菌体展示系统外还有λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统和T7噬菌体展示系统。

噬菌体展示技术的要点是在噬菌体衣壳蛋白基因中插入外源基因，形成融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，并使表达产物保持良好的空间构象；利用靶分子，采用适当的淘洗方法(亲和-洗脱-扩增-亲和的循环步骤)，洗去非特异型结合的噬菌体，使特异性结合的噬菌体富集，最终从文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体；外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，其编码基因作为重组噬菌体基因组中的一部分可通过噬菌体DNA序列测序得到，这样就使表达蛋白(表现型)和编码基因(基因型)之间完美地结合起来，使研究者可以在基因分子克隆的基础上有效的实现蛋白质构象的体外控制，从而在体外获得具有良好生物学活性的表达产物。

常规的抗原表位定位方法费时费力且不能获得空间构象表位。而通过将抗原的基因片段进行随机降解后与噬菌体的外壳蛋白基因融合表达而构成一个展示于噬菌体表面的表位库或直接用商业化的噬菌体肽库，以抗原特异性抗体来进行筛选，然后分析能与特异性抗体结合的噬菌体肽的序列，再将其与天然抗原序列相比较，就很容易确定抗原表位的位置及序列。噬菌体展示技术更是确定空间构象类抗原表位的有效方法。以固定化的抗体为筛选分子，可获得与抗体高亲和力的肽段，肽段核心序列很可能是和抗体互补决定区相结合的特异性天然抗原表位序列相同或类似，即模拟了天然蛋白质的连续表位。若筛选到与抗体高特异性结合的肽段完全不同于天然抗原序列，则称这些肽段为模拟表型(mimotype)，它模拟天然蛋白一级结构上不连续的氨基酸经过空间折叠而形成的表位结构。

发明内容

本发明的目的是提供一种H3型流感病毒血凝素空间构象模拟抗原表位。该抗原表位是一种用噬菌体展示肽库与抗重组HA1兔血清IgG结合，筛选得到的由12个氨基酸残基构成的短肽。

本发明的另一目的是提供上述H3型流感病毒血凝素空间构象模拟抗原表位在制备H3型流感病毒的诊断试剂中的应用。

本发明的目的是通过下列技术措施实现的：

一种H3型流感病毒血凝素空间构象模拟抗原表位，该抗原表位是由12个氨基酸残基构成的短肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述H3型流感病毒血凝素空间构象模拟抗原表位的融合蛋白。

编码所述H3型流感病毒血凝素空间构象模拟抗原表位的核苷酸序列。

所述的H3型流感病毒血凝素空间构象模拟抗原表位，是模拟H3型流感病毒血凝素HA1亚基膜外球状区的一种空间构象抗原表位。

所述的H3型流感病毒血凝素空间构象模拟抗原表位在制备H3型流感病毒的诊断试剂中的应用。

本发明提供的H3型流感病毒HA空间构象模拟抗原表位是采用抗重组流感病毒HA1兔血清IgG与肽库结合筛选得到。原核表达流感病毒HA1，制备抗重组流感病毒HA1的兔血清IgG，通过逐渐减少包被的抗重组HA1兔血清IgG的浓度并提高漂洗液中吐温-20的浓度，逐渐加大筛选压力使洗脱下的噬菌体与靶分子结合的亲和力越来越高，特异性越来越强，最终得到与抗重组HA1兔血清IgG高特异性紧密结合的噬菌体克隆。

本发明的技术途经是首先用分子生物学方法扩增流感病毒血凝素片段HA1的基因ha1进行原核表达，纯化重组HA1，免疫新西兰兔，分离抗血清制备抗重组HA1兔血清IgG。以纯化的抗重组HA1兔血清IgG包被酶标板，用噬菌体12肽库进行筛选，通过调整包被浓度和漂洗液逐渐加大筛选压力，经过4轮筛选和ELISA鉴定获得亲和力强、特异性高的噬菌体克隆，DNA测序并进行序列分析。通过免疫印迹鉴定、生物软件DNAstar比对和swiss-model数据库同源模建等方法，确定H3型流感病毒HA空间构象模拟抗原表位序列。

制备本发明H3型流感病毒HA空间构象模拟抗原表位的技术解决方案详述如下：

用含10％新生牛血清的DEME培养液培养MDCK细胞，当培养瓶中贴壁的MDCK细胞长满培养瓶底部面积的70～80％时，接种流感病毒A/Swine/Guangdong/6/2004(H3N2)株进行扩增，经反复冻融，取含病毒上清，抽提总RNA，设计特异性引物，运用分子生物学方法克隆得到流感病毒血凝素片段HA1基因ha1，导入原核表达质粒，转化宿主菌，构建成工程菌，通过对含此质粒的工程菌诱导表达，获得目的蛋白并进行纯化即为重组H3型流感病毒HA1。将纯化的重组HA1加佐剂乳化，三次免疫新西兰兔，分离抗血清，经过硫酸铵分级沉淀和DEAE纤维素层析法纯化抗重组HA1的兔血清IgG。

以纯化的抗重组HA1兔血清IgG包被酶标板，用噬菌体十二肽库进行淘筛。将抗重组HA1兔IgG以100μg/mL的浓度包被酶标板，4℃过夜，加入封闭液，用TBST冲洗，每孔加入稀释的噬菌体随机肽库与抗重组HA1兔IgG结合，室温孵育1小时，甩掉液体，用含0.1％tween-20(v/v)的TBST缓冲液漂洗，最后用洗脱液洗下特异性结合的噬菌体，取少量进行噬菌体滴度测定，其余的转入新鲜菌液(ER2738)中进行扩增，收获扩增的噬菌体，滴定后投入下一轮筛选。后面三轮筛选中，包被的抗重组HA1兔血清IgG浓度逐渐降低，同时逐渐减少噬菌体与包被蛋白作用的时间，并且漂洗液中tween的浓度提高到0.5％(v/v)。

经过4轮结合-洗脱-扩增的淘筛，挑取第四轮洗脱物单克隆噬菌体用间接ELISA法进行特异性检测挑取单个蓝色噬菌体克隆接种到含E.coli ER2738的LB培养液中扩增，PEG沉淀回收噬菌体。以空的M13噬菌体作对照，将噬菌体单克隆扩增上清，加入到包被有抗重组HA1兔血清IgG的酶标板上，以HRP标记的鼠抗M13抗体为二抗，OPD为底物进行显色。用竞争ELISA法进一步鉴定噬菌体克隆特异性。将纯化的重组HA1与等体积的噬菌体培养上清混合，加入包被抗重组HA1兔血清IgG的酶标板中，以HRP标记的鼠抗M13抗体为二抗，OPD为底物进行显色，酶标仪检测，计算竞争率。

斑点杂交法排除融合PET32a载体硫氧还蛋白的干扰。将纯化的重组HA1和纯化的PET32a空载体硫氧还蛋白分别点于硝酸纤维素膜上，将不同稀释度的阳性噬菌体上清与等体积1∶100倍稀释的兔抗重组HA1血清IgG混合与硝酸纤维素膜共孵育，加HRP标记的羊抗兔抗体，DAB显色，观察结果。

将与抗重组HA1兔血清IgG特异性结合的噬菌体克隆进行扩增，提取单链噬菌体DNA模板，测序鉴定。对DNA测序结果进行分析，根据噬菌体密码子表翻译出插入噬菌体载体中的12氨基酸序列，即与抗重组HA1兔血清IgG特异性结合的十二肽。经过同源模建和生物软件分析确定该十二肽为H3型流感病毒血凝素的一个新的空间构象表位。该模拟表位的8个保守氨基酸残基用ds viewer软件标出。

利用常规免疫学方法(如噬菌体ELISA法或免疫斑点等方法)，直接以展示H3型流感病毒血凝素空间构象模拟抗原表位的噬菌体作为抗原，通过测定该模拟抗原表位与H3型流感病毒血凝素抗体的结合能力，检测H3型流感病毒感染者或实验动物血清、体液、组织中的抗H3型流感病毒血凝素抗体。

本发明筛选到一个新的H3型流感病毒血凝素空间构象模拟抗原表位，它模拟了位于H3型流感病毒HA1膜外区的空间构象表位，它具有如下氨基酸序列：

H-P-V-T-Y-Q-F-Q-I-Y-T-T(SEQ ID NO.1)，能模拟重组HA1与抗重组HA1兔血清IgG特异性结合。用生物软件DNAstar比对该短肽与9个H3型流感病毒HA多肽序列的同源性，该12肽中有8个氨基酸残基在H3型流感病毒血凝素HA1亚基球状区中相对保守但并不连续。以此确定该12肽为模拟的空间构象表位。

本发明有益效果：

本发明首次将噬菌体肽库技术用于H3型流感病毒的空间构象表位筛选。本发明将HA1进行原核表达，制备纯化的抗重组HA1兔血清IgG，包被酶标板，进行数轮优化的生物淘筛过程和特异性鉴定，通过对特异性噬菌体单链模板进行DNA测序，根据Ph.D.-12 Phage Display Peptide Library试剂盒中提供的噬菌体专用密码子表翻译出展示于噬菌体表面的12肽氨基酸残基序列。经过生物学软件DNAstar比对和Swiss-model蛋白质数据库同源模建分析，获得模拟H3型流感病毒血凝素膜外球状区的空间构象抗原表位。该模拟抗原表位可用于制备H3型流感病毒的诊断试剂。

附图说明

图1：纯化原核表达的流感病毒血凝素片段HA1 SDS-PAGE电泳：M，低分子量蛋白marker；1～7，Ni⁺柱亲和层析纯化的各收集管中H3型IV血凝素HA1。

图2：纯化的抗重组HA1兔血清IgG SDS-PAGE电泳：M，低分子量蛋白marker；1，硫酸铵结合纤维素层析法纯化后的抗重组HA1兔血清IgG。

图3：生物淘筛流程图。

图4：阳性噬菌体克隆单链模板的DNA电泳分析：M，DNAmarker DL 2000；1～20，第四轮淘筛后20个蓝色噬菌体克隆单链模板。

图5：免疫印迹检测阳性噬菌体克隆的特异性。

1.PBS+等体积1∶50倍稀释的抗重组HA1兔血清IgG；

2.10⁵CFU/mL阳性噬菌体克隆+等体积1∶50倍稀释的抗重组HA1兔血清IgG；

3.10¹⁰CFU/mL阳性噬菌体克隆+等体积1∶50倍稀释的抗重组HA1兔血清IgG；

4.10¹⁵CFU/mL阳性噬菌体克隆+等体积1∶50倍稀释的抗重组HA1兔血清IgG。

图6：H3型流感病毒血凝素氨基酸序列与阳性噬菌体克隆12肽序列比对。

图7：组HA1同源模建与分子结构预测。

(a)1Ha0A的三维空间构象结构图；

(b)重组HA1的三维空间构象结构图；

(c)12肽模拟空间构象抗原表位在重组HA1球状区的标记与定位。

具体实施方式

结合附图说明本发明的具体实施方法如下：

实施例1、流感病毒血凝素片段HA1的原核表达

1)流感病毒血凝素片段HA1基因ha1的克隆：在长成单层的MDCK细胞上，接种H3型流感病毒A/Swine/Guangdong/6/2004(H3N2)株，37℃5％CO₂培养箱中培养48小时，当出现明显细胞病变时，收集细胞，反复冻融裂解细胞，离心去沉淀，取上清。用Trizol试剂(invitrogen公司产品)抽提总RNA，根据流感病毒A/Swine/Guangdong/6/2004(H3N2)株血凝素基因序列(Gene ID：AY852277)设计一对引物，依次在反转录酶(Invitrogen公司产品)和Taq酶(Takara公司产品)的作用下进行RT-PCR，获得ha1基因，DNA测序鉴定。两条引物序列分别为

5’-AGCGAATTCTTATGTCTGGCTTTCGC-3’ (SEQ ID NO.2)

5’-CTTCTCGAGAACCGTCCATCATTCCCTC-3’(SEQ ID NO.3)。

2)重组流感病毒血凝素片段HA1的原核表达：将克隆获得并经测序鉴定的ha1基因片段用EcoR I和Xhol I进行双酶切，酶切体系为50μl(EcoR I 2.5μl，Xhol I 2.5μl，TAKARA公司10×H缓冲液5μl，ha1基因片段25μl，灭菌超纯水15μl)，37℃反应3h，将酶切产物进行1.0％低熔点琼脂糖(熔点65℃)凝胶电泳，长波紫外灯下对照DNA分子量标准，迅速切下1066bp条带，按胶回收试剂盒(申能博彩公司产品)说明书回收酶切产物。将原核表达载体PET32(Novagen公司产品)同样用EcoR I和Xhol I进行双酶切，回收5880bp的线性化片段。将纯化回收的ha1基因片段和回收的线性化的PET32连接，连接体系为10μl(连接酶1μl，10×连接缓冲液1μl，线性化PET32 2μl，ha1基因4μl，灭菌超纯水2μl)，ha1基因片段和线性化PET32载体的比例为2～5∶1，16℃连接16h。连接产物命名为PET32-ha1。转化至克隆宿主菌DH5α感受态中，测序鉴定。提取质粒PET32-ha1，转化入表达宿主菌ROSSETTA中，涂LB平板(Amp⁺)。

3)重组流感病毒血凝素片段重组HA1的纯化：将含有PET32-ha1重组质粒的ROSSETTA工程菌，接种LB(Amp⁺)培养液，37℃摇床200rpm至对数生长期(OD₆₀₀＝0.4-0.5)，加入终浓度0.8mM的IPTG 37℃摇床200rpm诱导3小时，10,000rpm离心10min收获菌体，用原菌液体积1/10的1×binding buffer重悬，超声破碎(400W，工作2s，间隔2s，10min/100mL菌体)，10,000rpm离心10min去沉淀。上清过Ni⁺亲和层析柱，分步收集洗脱液1.5mL/管，SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白纯度及含量(见图1)。经灰度扫描定量，亲和层析后重组HA1的纯度达到95％以上。

实施例2、抗重组HA1兔血清IgG的纯化与鉴定

1)纯化的重组HA1免疫新西兰兔：纯化的重组HA1用0.01M，pH7.4的PBS调整浓度至200μg/mL，与等体积的弗氏佐剂混合，乳化，背部皮下多点注射法免疫新西兰兔，首免后两周进行二免，二免后两周进行三免。二免和三免使用等体积的弗氏不完全佐剂进行乳化，同样进行背部皮下多点注射。经三次免疫后测抗体琼扩效价，当效价达到1∶32时，心脏采血，分离血清。

2)抗重组HA1兔血清IgG的纯化：用饱和硫酸铵分级沉淀(硫酸铵饱和度分别为50％、33％和33％)结合DEAE纤维素层析法纯化兔血清IgG，SDS-PAGE电泳鉴定IgG纯度，紫外分光确定IgG浓度，纯化后抗重组HA1兔血清IgG电泳图上仅有约25kD的轻链和约50kD的重链(见图2)。

实施例3、噬菌体随机肽库筛选

1)噬菌体随机肽库是BioLabs公司商品化的M13噬菌体十二肽库(Ph.D.-12TMPhage Display Peptide Library Kit)

2)筛选方法：将稀释于包被液(pH 9.6的碳酸盐缓冲液)中的抗重组HA1兔血清IgG(100μg/mL)包被酶标板，4℃过夜，加入封闭液(3％BSA)4℃2-3小时，用TBST洗涤，甩干洗涤液。每孔加入稀释的噬菌体随机肽库，每轮加入的噬菌体数量均应在2×10^10-11CFU，室温孵育1小时，甩掉液体，用含0.1％tween-20(v/v)的TBST缓冲液漂洗，最后用100μl pH 2.2甘氨酸缓冲液洗脱与抗重组HA1兔血清IgG特异性结合的噬菌体，并立即用10μl pH 9.8 Tris缓冲液中和，取10μl进行噬菌体滴度测定，其余噬菌体转入新鲜菌液(ER2738 OD＝0.2～0.4)中进行扩增，37℃ 4-5小时后，4℃，10,000rpm离心10min，取上清重复离心一次，用PEG沉淀收获噬菌体，经梯度稀释滴定后投入下一轮筛选(见图3)。第二轮筛选时抗抗重组HA1兔IgG的包被浓度为50μg/mL，TBST漂洗液中吐温-20浓度为0.5％(v/v)。第三轮筛选时抗抗重组HA1兔IgG的包被浓度为20μg/mL，TBST漂洗液中吐温-20浓度为0.5％(v/v)。第四轮筛选时抗抗重组HA1兔IgG的包被浓度为10μg/mL，TBST漂洗液中吐温浓度为0.5％(v/v)。

实施例4、噬菌体滴度的测定

每轮筛选都必需对投入和洗脱下来的噬菌体进行滴定，计算产率。将待测噬菌体梯度(1∶10-1∶10¹²)稀释，加到含有E.coli ER2738(OD为0.2～0.4)的LB中，孵育1-5分钟，加入熔化的45℃顶层琼脂中，立即均匀铺于含X-gal和IPTG的底层LB琼脂板上。37℃过夜，计数蓝色克隆数并计算噬菌体滴度。生物淘筛的产率根据该公式进行计算：产率＝洗出噬菌体数/投入噬菌体数。随着淘筛的进行，洗脱下来的噬菌体与抗重组HA1兔血清IgG的亲和力越来越高，产率也逐渐升高，与重组HA1结合阳性的噬菌体克隆得到富集(表1)。

表1

克隆形成单位  第一轮  第二轮  第三轮    第四轮投入噬菌体数洗出噬菌体数洗出/投入  4×10¹⁰  9×10⁴  2.25×10^-6  2.4×10¹⁰  1.8×10⁵  7.5×10^-6  1.5×10¹¹  1.15×10⁷  7.66×10^-5    1×10¹¹    1.4×10⁶    1.4×10^-5

实施例5、噬菌斑的扩增及噬菌体阳性克隆的鉴定

挑取在LB(Tet/IPTG/X-gal)平板上生长的ER2738单克隆于LB(Tet抗性)培养液中，37℃摇床250rpm扩增至OD₆₀₀＝0.4～0.5，用LB(Tet抗性)培养液1∶10稀释，每个试管中加入2mL。第四轮淘筛后的洗脱产物经梯度稀释滴定，挑取在LB平板(Tet/IPTG/X-gal)上生长的单个蓝色噬菌体克隆接种到含2mL E.coli ER2738的LB培养液中，37℃摇床250rpm 4-5h。离心弃沉淀，上清用PEG沉淀噬菌体，并用等体积TBS重悬。将扩增重悬于TBS的噬菌体加入到包被抗重组HA1兔血清IgG的酶标板(10μg/mL)上，以空的M13KE噬菌体作对照，37℃孵育1h，TBST漂洗三次，加入1∶5000倍稀释的HRP标记的鼠抗M13抗体，37℃孵育1h，漂洗后加OPD底物显色，酶标仪检测OD490。以P/N＞2.1者判为阳性，将获得的20个阳性克隆进行数据统计(表2)。

实施例6、阳性噬菌体克隆DNA序列的测定与分析

参照Ph.D.-12TM Phage Display Peptide Library Kit的噬菌体单链DNA模板抽提方法提取ssDNA。用大肠杆菌ER2738对20个阳性噬菌体克隆进行扩增，当含有四环素的LB培养液中的大肠杆菌ER2738株处于对数生长初期(OD₆₀₀＝0.4～0.5)时，取5mL该菌液加入50μl单克隆噬菌体上清，37℃，250rpm摇4.5-5h；培养液4℃，10,000rpm，离心5min，取上清重复离心一次，再取80％上清。取1mL噬菌体上清加入400μl PEG，4℃10min沉淀噬菌体；4℃，12,000rpm离心10min，获得噬菌体沉淀；加入200μl LoddieBuffer(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA，4M NaI，常温避光保存)，重悬噬菌体；加入500μl无水乙醇，混匀室温放置10min，12,000rpm离心10min，弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀，室温干燥5min，将沉淀溶于30μl灭菌超纯水中，取5μl进行电泳分析(见图4)，剩余的噬菌体单链模板用M13-96gIII测序引物进行sanger双脱氧法核酸序列自动测序，M13-96gIII测序引物序列为5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’(SEQ ID NO.4)。结果显示挑取的20个阳性噬菌体克隆插入的核酸序列完全一致，编码链序列均为5’-CATCCTACGACTTATCAGTATACGATTTATGTTACT-3’(SEQ ID NO.5)，根据噬菌体肽库说明书中提供的M13噬菌体密码子表，翻译出展示于阳性噬菌体表面的12肽为NH₂-His-Pro-Thr-Thr-Tyr-Gln-Tyr-Thr-Ile-Tyr-Val-Thr-COOH(SEQ ID NO.1)。

实施例7、阳性噬菌体克隆的特异性检测

1)竞争ELISA：将稀释于包被液(pH 9.6的碳酸盐缓冲液)中的抗重组HA1兔血清IgG(100μg/ml)包被96孔酶标板，4℃过夜，封闭。纯化的重组HA1或抗重组HA1兔血清IgG与等体积的噬菌体培养上清混合，加入酶标板中37℃孵育1h。TBST漂洗三次，加入HRP标记的鼠抗M13单克隆抗体，37℃孵育1h，漂洗后加底物OPD显色15分钟，显色结束后用2M硫酸终止显色反应，酶标仪检测OD490。按如下公式计算竞争抑制率：[(A1-A2)/A1]×100，A1为无抑制物竞争时的OD490，A2为有抑制物竞争时的OD490。阳性噬菌体克隆与重组HA1之间的特异性结合可被兔抗重组HA1血清IgG和重组HA1所抑制，竞争抑制率分别为43.0％和40.8％(如表2)。

表2

噬菌体上清夹心ELISA  IgG竞争抑制  HA1竞争抑制挑取噬菌体克隆M13KE0.635±0.063^a0.137±0.033  0.362(43.0％)^b  0.116(-)  0.376(40.8％)  0.159(-)

a A490平均值±标准差(样本数＝20)

b竞争抑制率

2)免疫印迹：分别将纯化的重组HA1和PET32a载体硫氧还蛋白(PET32a载体转入大肠杆菌ROSSETTA中，以0.8M IPTG诱导，超声破碎，上清过Ni⁺亲和柱纯化)点于硝酸纤维素膜上，37℃干燥10min，用5％脱脂奶粉室温封闭1h，PBS洗膜三次，分别用PBS、1×10⁵CFU/mL、1×10¹⁰CFU/mL和1×10¹⁵CFU/mL的阳性噬菌体与等体积的1∶100倍稀释的兔抗重组HA1血清IgG混合，孵育硝酸纤维素膜4℃过夜，洗膜后，加HRP标记的羊抗兔抗体，温育1h，PBS洗膜三次，加DAB显色，观察结果(见图5)。

实施例8、序列比对和同源模建分析

从Genebank上搜索不同来源的H3型流感病毒血凝素氨基酸序列，用DNAstar软件包中的MegAlign，将重组HA1和另外8个H3型IV HA的氨基酸序列与噬菌体阳性克隆的12肽序列进行比对。结果发现12肽中的8个氨基酸残基与包括A/Swine/Guangdong/6/2004(H3N2)株在内的9个不同来源的H3型IV HA序列一致，但并不连续(图6)。以A/Swine/Guangdong/6/2004(H3N2)株流感病毒血凝素氨基酸序列为例，这8个保守的氨基酸分别是HIS(192)、PRO(193)、THR(195)、TYR(203)、GLN(218)、ILE(240)、TYR(241)、THR(243)。虽然8个保守的氨基酸残基中包含了HP-T和IY-T两个基序，但由于一级结构上不连续性且距离较远(大约在50个氨基酸残基的范围内)，因此不能确定为序列表位。

将重组HA1的氨基酸序列递交到Swiss-model数据库中，寻找已知空间构象的同源蛋白。理论上，当靶蛋白与同源蛋白一级结构相似性高于35％时，可进行同源模建，一级结构相似性越高，同源模建所得的空间构像结果越可靠。通过Swiss-model数据库中的搜索，蛋白1Ha0A与重组HA1的序列同源性高达84％，1Ha0A的空间构象已经由X-射线晶体衍射法确定，根据1Ha0A的三维空间构象结构图，对重组HA1进行同源模建，得到重组HA1的三维结构图像文件，用Rasmol打开，并用ds viewer进行氨基酸分析，标记出8个保守的氨基酸残基，确定淘筛到的12肽序列模拟了H3型流感病毒血凝素HA1一级结构上不连续的氨基酸经过空间折叠而形成的表位结构，并确定该空间构象表位位于HA1球状区(见图7)。

实施例9、衣壳蛋白gIII融合了HA 12肽空间构象模拟抗原表位的噬菌体的扩增

噬菌体12肽库是通过把随机12肽与噬菌体表面的gIII蛋白融合，将12肽表达在噬菌体衣壳蛋白gIII的N末端形成12肽-gIII融合蛋白，再经过噬菌体衣壳蛋白的装配，将12肽展示于噬菌体颗粒的表面。

用大肠杆菌ER2738对展示H3型流感病毒血凝素12肽空间构象模拟抗原表位的噬菌体克隆进行扩增，当含有四环素的LB培养液中的大肠杆菌ER2738株处于对数生长初期(OD₆₀₀＝0.4～0.5)时，取20mL该菌液加入200μl单克隆噬菌体上清，37℃，250rpm摇4.5-5h；培养液4℃，10,000rpm，离心5min，取上清重复离心一次，再取80％上清。每毫升噬菌体上清加入400μl PEG，4℃10min沉淀噬菌体；4℃，12,000rpm离心10min，获得噬菌体沉淀，用4ml生理盐水悬起。每个噬菌体衣壳蛋白gIII的N端都融合了H3型流感病毒血凝素12肽空间构象模拟抗原表位。

实施例10、H3型流感病毒感染的诊断试剂盒的构建

直接以人工合成的SEQ ID No.1所示的模拟抗原表位12肽作为抗原，包被96孔酶标板，37℃2小时，PBST洗板三次，用5％脱脂奶粉4℃封闭过夜；弃封闭液，PBST洗板3次，每孔加入100μl 1∶400倍稀释的经H3型流感病毒HA1蛋白免疫的兔血清，同时以等量1∶400倍稀释的免疫前兔血清做阴性对照，免疫血清和阴性对照血清各做3个重复孔，37℃孵育2小时，PBST洗板3次，每孔加入100μl 1∶1000倍稀释的HRP标记的羊抗兔抗体，37℃温育1h，PBST洗板三次，以TMB显色试剂盒进行显色，酶标仪检测各孔OD₄₅₀。免疫兔血清平均OD₄₅₀为0.352，阴性对照血清平均OD₄₅₀为0.083，符合P/N＞2.1的判断标准。

序列表

<110>中国药科大学

<120>H3型流感病毒血凝素空间构象模拟抗原表位及其应用

<160>5

<210>1

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>H3型流感病毒血凝素空间构象模拟抗原表位

<400>1

His Pro Thr Thr Tyr Gln Tyr Thr Ile Tyr Val Thr

1               5                   10

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工引物序列

<400>2

agcgaattct tatgtctggc tttcgc   26

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工引物序列

<400>3

cttctcgaga accgtccatc attccctc 28

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工引物序列

<400>4

ccctcatagt tagcgtaacg                    20

<210>5

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>H3型流感病毒血凝素空间构象模拟抗原表位编码序列

<400>5

catc ctacga cttatcagta tacgatttat gttact 36