一种快速定量线虫死亡率的新方法

摘要

本发明涉及一种快速定量线虫死亡率的新方法，以及这种方法在药物筛选、农药筛选、环境评价、水质评价等方面的应用。本发明在传统线虫死亡率的判断方法上做了改进，在线虫染色后，由于死亡线虫着色，而活线虫不着色，线虫碱解后，释放染料，应用染料在一定波长有吸收的性质，用吸收值来反映线虫的死亡率，从而反映药物的药效、毒性；农药的药效、毒性，以及环境的变化等。从而减轻在显微镜下计数死亡线虫的工作量，结果快速准确，可以进行高通量筛选。此外，本发明在操作上简单易行，对设备要求不高，成本低廉，具有很高的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速定量线虫死亡率的新方法，以及这种方法在药物筛选、农药筛选、环境评价、水质评价等方面的应用，属于模式生物的应用领域。

背景技术

秀丽隐杆线虫(C.elegans)是一种生长在土壤中的线虫，以细菌为食，很容易在实验室培养。成虫体长1mm，且通体透明，在显微镜下易于观察。L₃～L₄期对外界敏感。从一个受精卵发育成可以产卵的成虫，它只需要3天。在自然状态下，秀丽隐杆线虫绝大部分个体为雌雄同体，其一生能产生约300个受精卵，如果在一个培养皿上放上几只线虫，几天之后就可得到大量的后代^[1]。上述这些特点使得秀丽隐杆线虫在很多方面都有应用^[2]。

厦门大学柯翎等人^[3]以秀丽隐杆线虫作为重金属污染的指示生物，研究了Cu²⁺，Cd²⁺，Pb²⁺，Zn²⁺等4种重金属离子对秀丽隐杆线虫的毒性，发现重金属离子浓度越高，毒性越强，线虫死亡率越高。在高浓度组中线虫的中毒反应较迅速，短期内就出现死亡；而在低浓度组，中毒反应较缓慢，经较长时间才出现死亡，对照组相对其他各组，存活时间最长。北京师范大学的鄢雯等人^[4]将秀丽隐杆线虫用于环境水质的监测，同样发现秀丽隐杆线虫存活率与水样毒性之间存在紧密的关系，水样毒性越大，线虫死亡率越高，因此可用秀丽隐杆线虫的存活率评价饮用水源水和水厂工艺水水样毒性。王晓等人^[5]也将秀丽隐杆线虫用于对造纸厂废水中酸碱类毒物的追踪。实验显示，用秀丽隐杆线虫指示重金属危害、水样毒性大小等既降低了实验成本，又提高了检测效率，所以利用其作为环境评价、水质评价的指示生物具有可观的应用前景。

万树青等人^[6]用秀丽隐杆线虫的死亡率来评价棉酚，克线磷，甲基异柳磷，氧乐果，灭多威，硫酸铜等多种农药的杀虫效果，取得了理想的效果。实验显示：棉酚对秀丽隐杆线虫的击倒率强于其他几种杀线剂，克线磷次之，其它几种农药对秀丽隐杆线虫的击倒率都从实验结果上可以清楚的看到。这个结果与运用蚕蛾作为实验对象的研究结果是一致的^[7]。国外将秀丽隐杆线虫用于体内驱虫药物药效筛选的研究已有相关的文章发表^[8]，为驱虫药的体外研究提供了可行方法，并且呈现良好的选择性、准确度及重复性，而且成本低廉。这些研究表明，线虫死亡率的大小反应了的供试物的药效和毒性的大小，因此，线虫死活的判断就成为这类研究的重要实验指标。

判断线虫死活的传统方法是体态法。即死的线虫多呈僵直状态，而活的体态弯曲，一般盘卷或蠕动。但是这种方法对呈不活跃和麻痹状态的线虫是不适用的，此时只能用铂丝来触拔线虫以引起线虫运动来鉴别其死活，因此这种方法费时、费力，工作量极大。为了改变这种状况，万树青等人^[6]试图通过染色方法来区分死活线虫从而测定被测物杀线剂的活性，他们比较了中性红，甲基蓝，番红花红，曙红等4种染料的染色效果，发现这4种染料都能使死亡线虫着色，而活线虫不着色，番红花红效果最好。但是这种方法仍然需要在显微镜下一一计数，工作量依然很大。

美国专利(专利号为20060191023)公开了一种应用荧光染色剂法来鉴别死活线虫的染色方法。这种方法已用于驱虫药物的筛选研究，由于染色后活的线虫无荧光，而死亡的线虫有荧光，利用测试荧光强度的大小来确定线虫的死亡率，这样为高通量筛选提供了保证，但此法对设备要求依然较高，难以在普通实验室得以推广和应用。

由于线虫自身有重量，在水溶液中很快下沉，所以上面所提的荧光高通量筛选方法存在另一个限制点：即多孔板中每一个孔中供试线虫的数量难以掌握。美国专利(专利号20030154501)用一定浓度的PEG8000、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甘油溶液，可使线虫均匀分布于溶液中，以保证线虫均匀加入多孔板，使供试线虫数量可控。但是上述药品价格偏高且对线虫具有一定的毒性。

鉴于现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种简单易行、成本低廉的快速定量线虫死亡率的新方法，可以方便地应用于新药筛选、农药筛选、环境评价水质评价等方面。

参考文献：

1.庞林海等，秀丽隐杆线虫的培养与保存方法，浙江农业学报，2007，19(1)：34～36.

2.秦峰松，杨崇林，小线虫大发现：caenorhabditis elegans在生命科学研究中的重要贡献，生命科学，2006，18(5)：419～424.

3.柯翎4种重金属离子对秀丽小杆线虫急性毒性研究厦门大学学报2004，43(6)：133～135.

4.鄢雯等线虫存活率指标对水样相对毒性的初步分析北京师范大学学报2005，41(6)：616～619.

5.王晓等，利用模式动物线虫追踪造纸厂废水中酸碱类毒物的研究，环境科学，2007，28(4)：876～880.

6.万树青，周青春等，杀线虫剂活性测定线虫死活染色鉴别的研究，农药，1993，32(1)：18～19.

7.王胜宝，何曼莉等，几种药剂对银杏大蚕蛾的药效试验，西北农业学报，2000，9(3)：43～46.

8.Charlemagne Gnoula et al.，5(6)～carboxyfluorescein diacetate as anindicator of caenorhabditis elegans viability for the development of an in vitroanthelmintic drug assay，sciencedirect 2007，71(5)：1886～1892..

发明内容

本发明主要提供了一种简单易行、成本低廉的快速定量线虫死亡率的新方法，可以方便地应用新药筛选、农药筛选、环境评价、水质评价等方面。具体内容如下：

以经过同步化的秀丽隐杆线虫为实验材料，配置10％～30％浓度的蔗糖线虫液，优选18％的蔗糖溶液。吸取等量的均匀分布的线虫液，加入多孔板，然后加入供试品，待供试品作用后，线虫用生物染色剂染色，这里的生物染色剂指中性红，甲基蓝，番红花红，曙红。染色后，水洗或缓冲液洗至溶液澄清，然后用2.5mol/l的氢氧化钠碱解线虫，再用等摩尔的盐酸中和，使溶液显中性，分别在染料的最大波长处测定每个孔吸收度。中性红在530nm处有最大吸收，甲基蓝在668nm处，番红花红在365nm处，曙红的最大吸收在513nm处。测定结果表明线虫的死亡率与所测得的OD值的大小呈正比，线性关系良好，OD值的大小反映了线虫的死亡率。

制备某供试品浓度梯度，然后用18％的蔗糖溶液配置一定浓度的线虫液，转移线虫于多孔板中，离心去蔗糖，水洗2～3遍，作为备用的供试线虫，将供试品加入含有线虫的多孔板中，放置4～48小时后离心处理，去掉剩余供试品，然后每管各加100微升0.5％的中性红溶液，染色5～10分钟，水洗，至溶液澄清透明，用2.5mol/L氢氧化钠溶液碱解线虫5～10分钟，然后用等摩尔浓度的盐酸溶液中和，用紫外可见分光光度计在530nm处测定吸收度，利用标准曲线和回归方程，计算半数致死量，从而评价供试品急性毒性。

本发明所提供的方法是一种用于急性毒性实验的高通量筛选方法，其操作简便，设备要求简单等优点，在普通实验室就可应用，该法可以应用于环境评价，农药及医药等方面。

同以前的方法相比，本发明存在以下优势：

(1)对设备要求简单，操作简便，结果客观准确。

(2)实验的高通量，节省人力物力和时间。

(3)费用低廉，具有很好的经济效益。

具体实施方式：

实施例一、线虫同步化

具体方法如下：将在培养皿中培养了7～8d的线虫用K溶液(50mmol NaCl，30mmol KCl，10mmol NaAc)冲洗到小指管中，在每个小指管中分装1mL线虫液，分别加入0.5mL碱性次氯酸钠溶液(2～4％漂白粉，0.4M氢氧化钠)，充分混匀后，3500rpm离心4min；弃上清后，用K液冲洗3次，弃去冲洗液后，将线虫均匀的铺在培养基表面。置于16℃培养；培养2.5d后，线虫基本上发育到L3～L4期，这时基本上完成了线虫的同步化。

实施例二、线虫的均匀度

表1.线虫在蔗糖溶液中的均匀度

  孔1  孔2  孔3 孔4 孔5 孔6  蔗糖浓度10％  15条  10条  6条 9条 3条 5条  蔗糖浓度15％  10条  9条  15条 8条 7条 6条  蔗糖浓度18％  8条  9条  8条 9条 9条 9条  蔗糖浓度20％  15条  8条  10条 9条 9条 7条  蔗糖浓度30％  12条  3条  2条 5条 4条 3条

表2.18％蔗糖溶液中线虫的分布情况

  孔1  孔2 孔3  孔4  孔5  孔6 A组  6条  11条 8条  7条  6条  7条 B组  9条  7条 7条  8条  10条  11条 C组  11条  8条 9条  9条  8条  9条 D组  9条  8条 9条  10条  8条  11条 E组  11条  7条 9条  10条  10条  9条

在10％～30％的蔗糖溶液中，取其中的5个浓度即10％，15％，18％，20％，30％使线虫分布其中，5分钟后取样100微升于96孔板中，记数每孔线虫数，结果如表1，最后优选18％作为可使线虫均匀分布于溶液的优选浓度(表2)。统计结果显示，18％蔗糖溶液中，各组间的F值＝1.295，P值＝0.299，按照d＝0.05，接受H₀认为各组之间的均数差别没有统计学意义，故而认为我们所配制的线虫是均匀的。

实施例三、标准曲线的建立

线虫的浓度是400条/500微升，作为供试定量线虫，把此溶液分成两部分，一部分用热处理法处死线虫(溶液1)，另一部分为未处理的线虫溶液(溶液2)。分别加水200微升，在3000转/分钟离心5分钟，水洗两次，继续离心，用0.5％的中性红溶液染色8分钟，水洗离心去掉多余染料，用2.5mol/L氢氧化钠溶液碱解线虫9分钟，然后用等摩尔浓度的盐酸溶液中和，然后离心3分钟，取上清，在530nm处测定吸收度，得到标准曲线表3。如下图所示：标准曲线图，求得线性回归方程。

表3.标准曲线

  孔1  孔2  孔3  孔4  孔5  孔6  溶液1(μl)  100  300  500  700  900  1000  溶液2(μl)  900  700  500条  300  100  0  染色后  OD₅₃₀  0.225  0.482  0.576  0.721  0.892  0.999

以死亡线虫的数的对数值为横坐标，以530nm处的吸收值为纵坐标，所得的回归方程为Y＝0.001X+0.180 R²＝0.9854

实施例四、农药杀虫效果筛选

染色剂：中性红，用水配置成0.5％的染色液备用。

供试线虫：秀丽隐干线虫用18％的蔗糖溶液配置成800条/500微升的线虫液

药品的配置：福美双，取本品，用丙酮溶解，然后用吐温～80乳化，加水配置成15微克/毫升，10微克/毫升，5微克/毫升的溶液备用。

取线虫液500微升于eppendorf管中，加水离心后，再水洗两遍，加药100微升，然后放置4小时，离心后水洗2遍，用染色液染色8分钟，然后用碱处理，用酸中和，在530nm处测定吸收度。结果见下表：

表4.农药杀虫效果筛选

 药物浓度(ppm)  20  15  10  5  0 OD值  0.315  0.208  0.122  0.068  0.005

回归方程为Y＝0.0152X～0.0084 R²＝0.9804

令Y＝0.576，X＝38.44ppm，即半数致死浓度为38.44ppm(1ppm＝1μl/ml)。

实施例五、环境毒性检测

秀丽隐杆线虫在培养液条件下也可以生存，因此也可以作为水生毒理学、水体污染方面的研究，但少有对其作为污染物的生物指标种的研究报道。用其进行高通量的实验方法的建立具有很高的开发价值。目前重金属污染方面的研究常用水生生物来测试，用以下3种重金属离子对C.elegans的急性毒性试验(表5)，以了解重金属离子对其存活率的影响。通过本试验，为重金属对C.elegans的毒理学研究提供以线虫作为重金属污染的高通量测试方法的实践依据。

表5.环境毒性检测

  离子类型  浓度(mg/l)  OD₅₃₀  铜离子(Cu²⁺)  18.1  0.417  9.02  0.218  铅离子(Pb²⁺)  51.8  0.389  26.2  0.215  锌离子(Zn²⁺)  218  0.526  109  0.216

从吸收值的大小来看，得出三种金属离子的毒性顺序，Cu²⁺＞Pb²⁺＞Zn²⁺，结果和文献报道一致。

实施例六、驱虫剂阿苯达唑片的药效检测

阿苯达唑片生产厂家：中美天津史克制药有限公司；规格：0.2g/片。

染色剂：中性红，用水配置成0.5％的染色液备用。

供试线虫：秀丽隐杆线虫用18％的蔗糖溶液配置成400条/500微升的线虫液。

药品的配置：取本品，用冰醋酸溶解，然后稀释成不同的浓度备用，取线虫液500微升于eppendorf管，加水离心后，再水洗两遍，加供试液100微升，放置4小时，离心后水洗2遍，用染色液染色8分钟，然后用碱处理，用酸中和，在530nm处测定吸收度。结果见表6：

表6.驱虫剂阿苯达唑片的急性毒性检测

  药物浓度(ppm)  400.0  200.0  100.0  50.0  0.00  OD值  0.7524  0.326  0.247  0.058  0.012

回归方程为Y＝0.0018X+0.0024 R²＝0.9791用以推算药物的半数致死量，对药物的优化和筛选提供的理论依据。令Y＝0.576，得X＝310.9ppm，即该药物的半致死浓度为310.9ppm。

实施例七四环素片的毒性实验

四环素片生产厂家：兰州制药厂；规格：0.25g/片。

染色剂：中性红，用水配置成0.5％的染色液备用。

供试线虫：秀丽隐杆线虫用18％的蔗糖溶液配置成400条/500微升的线虫液。

药品的配置：取本品，加水溶解，然后稀释成不同的浓度备用，取线虫液500微升于eppendorf管，加水离心后，再水洗两遍，加一定浓度的盐酸四环素溶液100微升，放置4小时，离心后水洗2遍，用染色液染色8分钟，然后用碱处理，用酸中和，在530nm处测定吸收度。结果见表7：

表7.四环素片的毒性实验

  药物浓度(g/ml)  0.250  0.125  0.0500  0.025  0.0125  OD值  0.566  0.441  0.343  0.267  0.245

得回归方程为：Y＝1.3276X+0.2496 R²＝0.9671。

令Y＝0.576，得X＝0.246g/ml，即该半致死浓度为0.246g/ml。