一种表达猪源支气管败血波氏杆菌fhaB和prn基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌株、疫苗及应用

摘要

本发明属于动物细菌基因工程领域，涉及一种不含抗性标记的表达猪源支气管败血波氏杆菌fhaB和prn基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌株的构建、疫苗制备及应用。得到一株不含抗性标记的表达猪源支气管败血波氏杆菌fhaB和prn基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌C501(pYA－F1P2(保臧号为CCTCC NO：M207138)。该菌株缺失了猪霍乱沙门氏菌的asd基因，含有能在该菌株中表达asd、猪源支气管败血波氏杆菌fhaB和prn基因片段的质粒pYA－F1P2。公开了该重组株及疫苗的制备以及在制备猪霍乱沙门氏菌和猪源支气管败血波氏杆菌疫苗中的应用。本发明的基因工程疫苗可以刺激猪产生抵抗猪霍乱沙门氏菌和猪源支气管败血波氏杆菌野毒株的保护性免疫反应，能有效防止猪霍乱沙门氏菌和猪源支气管败血波氏杆菌的感染。

说明书

技术领域

本发明属于动物细菌基因工程技术领域，具体涉及一种不含抗性标记的表达猪源支气管败血波氏杆菌丝状粘附素基因(fhaB)的Type I片段和百日咳杆菌粘附素基因(prn)的R2片段的重组猪霍乱沙门氏菌活疫苗菌株的构建、疫苗制备及应用。

背景技术

猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)是导致2-4月龄仔猪副伤寒的主要病原，感染猪后引起以急性败血症、慢性坏死性肠炎、顽固性下痢等典型症状，常引起断奶仔猪大批发病，如伴发或继发感染其它疾病或治疗不及时，死亡率较高，造成重大损失。动物生前感染沙门氏菌或其产品受到污染，可使人发生食物中毒，因此该病原在公共卫生学上也具有重要意义。

人们最早用灭活的全菌疫苗来预防沙门氏菌引起的伤寒，由于灭活苗具有容易引起全身及局部反应、只能激发体液免疫、不能提供交叉保护、需多次加强免疫等缺点，此类疫苗的应用受到限制。随后，人们发现弱毒沙门氏菌在诱导体液和细胞免疫反应方面比灭活的或亚单位疫苗更为有效。于是，各种沙门氏菌弱毒苗在世界范围内得到了广泛应用，取得了良好的预防效果。我国在60年代初，房晓文等将抗原性良好的猪霍乱沙门氏菌强毒株接种含有醋酸铊的培养基中传数百代后，选出一株免疫原性好的弱毒株，被命名为C500(房晓文等，仔猪副伤寒弱毒菌苗的研究，畜牧兽医学报，1981(2)：29～36)。C500菌株在全国推广使用，使我国仔猪副伤寒得到有效控制(黄昌炳等，仔猪副伤寒弱毒通气培养冻干苗口服免疫研究，中国农业科学，1981(6)：89～94；康凯，仔猪副伤寒活疫苗，中国兽药杂志，2003(37)37-49。

近30年来，人们开始关注使用减毒沙门氏菌作为载体表达各种外源抗原以预防重大人、畜传染病这一研究领域。应用各种基因工程方法构建沙门氏菌减毒株和利用减毒沙门氏菌作为活载体表达外源抗原研制多价疫苗等已成为该领域的研究热点。减毒沙门氏菌作为疫苗载体具有诸多的优点：(1)产生细胞毒性T细胞的杀伤反应(CTL反应)；(2)减毒沙门氏菌因侵入淋巴系统，能更有效地激发宿主的体液和细胞免疫；(3)通过自然感染途径如口服或鼻内接种，可以激发系统和粘膜免疫反应；(4)具有免疫佐剂作用；(5)免疫具有持续性；(6)具有联合免疫作用，可以稳定表达原核和真核基因，本身不致病，而且也作为伤寒疫苗；(7)所表达的靶抗原不需提纯，制备简单可直接用于免疫保护试验，显著降低了疫苗的制作成本；(8)接种简单方便，易于操作等(Curtiss，R等，1996，Strategies for the use of live recombinantavirulent bacterial vaccines for mucosal immunization，p.499-511，In H.Kiyono and M.F.Kagnoff(ed.)，Essentials of mucosal immunology，Academic Press，San Diego等，2006.Rational design ofSalmonella-based vaccination strategies.Methods 38：133-143；Sirard J等，1999.Live attenuatedSalmonella：a paradigm ofmucosal vaccines.Immunol.Rev.171：5-26)。

重组沙门氏菌疫苗的发展常常需要使用选择标记，由于以前普遍采用携带抗性基因的表达质粒，抗性基因成为体外转化筛选转化子和质粒在体外遗传的的主要标记。但是，抗生素是临床上治疗细菌感染的主要药物，由此引起的最大恐慌是抗性基因在环境病原微生物中传播，从而减弱治疗这些病原感染的药物效果。因此，抗生素抗性质粒选择系统不被人们所接受。如今，人们已经研制出多种不含抗生素抗性标记的沙门氏菌疫苗系统，如将外源抗原稳定整合到沙门氏菌染色体，或用能筛选选择重组菌但不需要抗生素的质粒平衡系统(Balanced-lethal PlasmidStabilisation System)。其中，应用最多的系统是asd质粒载体平衡致死系统。沙门氏菌的asd基因编码天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶(aspartate L-semialdehyde dehydrogenase)，是二氨基庚二酸(diaminopimelic acid，DAP)生物合成途径中的必需酶，而DAP是革兰氏阴性菌细胞壁主要化学成分肽聚糖四肽侧链的一个组分，asd缺失株在无外源DAP条件下不能形成完好的细胞壁，最终溶菌死亡。由于哺乳动物组织中不含DAP，因此突变菌在不含DAP的培养基中或动物体内均被降解。将目的基因插入含asd的质粒，转化asd宿主菌后可形成互补，asd质粒丢失的asd沙门氏菌在体内死亡，只有含有asd质粒的沙门氏菌才能存活，并稳定的在体内体外表达外源抗原。由于用asd质粒载体平衡致死系统代替了抗生素抗性标记，因此也更加安全(Nakayama，K等，1988.Construction of an Asd⁺ expression-cloning vector：stable maintenance and high levelexpression of cloned genes in a Salmonella vaccine strain.Bio/Technology 6：693-697；Kang，H等，2002，Immune responses to recombinant pneumococcal PspA antigen delivered by live attenuatedSalmonella enterica serovar Typhimurium vaccine.Infect.Immun.，70：1739-1749)。

支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica，Bb)与百日咳波氏杆菌(Bordetella pertussis，Bp)、副百日咳波氏杆菌(Bordetellaparapertussis，Bpp)同属波氏菌属，后两者通常只感染人，主要导致人特别是婴幼儿的百日咳和副百日咳。支气管败血波氏杆菌可广泛感染多种哺乳动物，偶尔也感染人，表现为呼吸道的急慢性炎症，统称为波氏菌病(Bordetellosis)。在猪群中，支气管败血波氏杆菌单独感染可引起猪发生肺炎和萎缩性鼻炎。另外，更大的危害在于该病原菌的先期感染易于导致猪继发感染其它多种病原，如多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multicida，Pm)、猪链球菌(Streptococcus suis，S.suis)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus suis，HPS)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory Syndrome virus，PRRSV)等，从而提高呼吸道疾病的发病率并增加疾病的严重程度，造成较大的损失(Brockmeier，S等，Effects of intranasalinoculation with Bordetella bronchiseptica，porcine reproductive and respiratory syndrome virus，ora combination of both organisms on subsequent infection with Pasteurella multocida in pigs.Am.J等，1992.Enhanced adherence of Pasteurella multocida to porcine tracheal rings preinfected withBordetella bronchiseptica.Can J Vet Res.56：260-264；Vecht，U等，1992.，Virulence ofStreptococcus suis type 2 strains in newborn germfree pigs depends on phenotype，Infeet.Imm um60：550-556；Brockmeier S.L.2004.Prior infection with Bordetella bronchiseptica increases nasalcolonization by Haemophilus parasuis in swine.Vet Microbiol.99：75-78；De Jong M.F.1999.Progressive and nonprogressive atrophic rhinitis.In Straw B.E.，d’Allaire S.，Mengeling W.L.andTaylor D.J.(eds.)，Diseases of swine.Ames，IA：Iowa State University Press，p.355-384)。直到现在，人们才逐渐意识到支气管败血波氏杆菌对猪群造成的危害远远被低估了(Borckmeier S.Therole of Bordetella bronchiseptica in respiratory diseases of swine：atrophic rhinitis and beyond.PigProgress(special).2003，6：20-21)。同时，人们也发现该菌可在免疫功能缺陷或低下的人群(如AIDS患者体内)形成严重感染，因此引起了高度关注(Valencia M.E.，Enriquez A.，Camino N.，etal.Bordetella bronchiseptica pneumonia in patients with HIV.Enferm Infecc Microbiol Clin，2004，22：502-503)。

支气管败血波氏杆菌与百日咳波氏杆菌、副百日咳波氏杆菌亲缘关系较近，许多毒力因子为3种病原菌所共有，包括粘附素和毒素两大类。粘附素包括丝状血凝素(filamentoushemagglutinin，FHA)、百日咳杆菌粘附素(pertactin，PRN)、气管粘附因子(tracheal colonizationfactor，TcfA)、菌毛(fimbriae，FIM)等；毒素包括皮肤坏死毒素(dermonecrotic toxin，DNT)、气管细胞毒素(tracheal cytotoxin)、腺苷环化酶溶血素(adenylate cyclase-hemolisin，AC-Hly)等。这些毒力因子的表达与病原所处的环境具有紧密的相关性，均由BvgA/S双因子调节系统调节表达。FHA和PRN被认为是最重要的粘附因子和抗原成分，是已经广泛使用的商品化百日咳疫苗的主要成分(Greco，D，Salmaso，S，Mastrantonio，P.，Giuliano，M.，Tozzi，A.，Anemona，A.，Ciofi degliAtti，M.L.，Giammanco，A，Panei，P.，Blackwelder，W.C.，Klein，D.L，Wwassilak，S.G.F.，andProgetto Pertosse Working Group.1996.A controlled trial of two acellular vaccines and onewhole-cell against pertussis.New Engl.J. Med.334：341-348；Gustafsson，L.，Hallander，H.O.，Olin，P.，Reizenstein，E.and Storsaeter，J.1996.A controlled trial of a two component acellular，afive-component acellular，and a whole-cell vaccine against pertussis vaccine.New Engl.J.Med 334：349-355)。FHA是是由fhaB基因编码的一种介导细菌粘附到宿主细胞的分泌型大蛋白，在细菌粘附宿主细胞的过程中起到关键作用，可以直接粘附作为宿主受体的纤毛膜甘氨酸鞘脂。同时，FHA介导的粘膜定殖功能对于细菌抵抗粘膜纤毛的自动清除也有很大作用。FHA具有良好的抗原保护性，含有C端的TypeI和N端的TypeII两个保护性抗原区域，而TypeI较TypeII包含了更多的抗原表位从而具有更好的抗原保护性(Leininger E.，Bowen S.，Renauld-Mongenie G.，RouseJ.H.，Menozzi F.D.，Locht C.，Heron I.，Brennan M.J.1997.Immunodominant domains presen onthe Bordetella pertussis vaccine component filamentous hemagglutinin.J Infect Dis.175：1423-1431；Piatti G.1999.Idenitification of immunodominant epitopes in the filamentoushemagglutinin of Bordetella pertussis.FEMS Immunol Med Microbiol.23：235-241；J.B.Knight，YY.Huang，S.A.Halperin，R.Anderson，A.Morris，A.MacMillan，T.Jones，D.S.Burt，G.Van Nest，S.F.Lee.2006.Immunogenicity and protective efficacy of a recombinant filamentoushaemagglutinin from Bordetella pertussis.Clinical & Experimental Immunology 144：543-551)。PRN是由prn基因编码的一种具有抗原保护性的支气管败血波氏杆菌外膜蛋白成分，也是其重要的黏附因子。在猪的感染试验中，猪群的保护率与PRN抗体水平呈线性关系，被认为是支气管败血波氏杆菌最主要的保护性抗原。PRN包括R1(GGXXP_n)和R1(PQP_n)两个氨基酸重复序列区域。R1区靠近一个RGD序列，而RGD序列主要具有粘附真核细胞的功能，因此推测R1区可能与粘附功能相关(Leininger E.，Ewanowich C.A.，Bhargava A.，Peppler M.S.，KemmerJ.G.，Brennan M.J.1992.Comparative roles of the Arg-Gly-Asp sequence present in the Bordetellcpertussis adhesins pertactin and filamentous hemagglutinin.Infect Immun 60：2380-2385)。R2区被鉴定为PRN的主要保护性抗原表位(Charles，I.G.，J.Li，M.Roberts，K.Beesley，M.Romanos，D.J.Pickard，M.Francis，D.Campbell，G.Dougan，M.J.Brennan，C.R.Manclark，M.Au Jensen，I.Heron，A.Chubb，P.Novotny，and N.F.Fairweather.1991.Identification and characterization of aprotective immunodominant B cell epitope of pertactin(P.69)from Bordetella pertussis.Eur.J.Immunol.21：1147-1153)。

目前商品化各种支气管败血波氏杆菌疫苗(主要是佐剂灭活苗)已在世界范围内广泛应用，但免疫效果普遍较差，由支气管败血波氏杆菌所引起的萎缩性鼻炎和肺炎仍然是危害养猪业一个非常重要的问题(Backstrom L.1999.Present uses of and experiences with swine vaccines.In：Veterinary vaccines and diagnostics.San Diego：Academic Press；United States Department ofAgriculture.2001.Part I：reference of swine health and management in the United States，2000.CO：National Animal Health Monitoring System，Fort Collins，#N338.0801：2001：39；United StatesDepartment of Agriculture.2002.Part II：reference of swine health and health management in theUnited States，2000.CO：USDA：APHIS：VS，CEAH，National Animal Health Monitoring System，Fort Collins，#N355.0202：2002：29)。因此，开发更加安全、高效、廉价的新型疫苗是世界养猪业的迫切需要。

与灭活疫苗和单纯的亚单位疫苗不同，重组沙门氏菌活疫苗自然感染或试验感染诱导抗仔何异源血清型沙门氏菌保护的同时，沙门氏菌因侵入淋巴系统，能更有效地激发宿主产生针剂异源抗原的体液和细胞免疫反应等优点。这样，重组弱毒活疫苗也许是解决当前支气管败血波氏杆菌商品化疫苗不足的一种可行方法。构建沙门氏菌重组菌株的传统方法存在很多缺陷。如以往普遍采用携带抗性基因的表达质粒，因存在生物安全问题而不被人们所接受。asd质粒载体平衡致死系统具有表达量高、外源基因表达稳定、不需纯化无抗生素抗性标记等优点，同时鉴于猪霍乱沙门氏菌C500的良好免疫原性，将其开发为表达猪源支气管败血波氏杆菌抗原保护性基因的重组活疫苗具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，获得一种免疫原性更好和安全性更强的表达猪源支气管败血波氏杆菌fhaB和prn基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌株；

本发明的第二个目的是利用表达猪源支气管败血波氏杆菌fhaB和prn基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌株制备猪霍乱沙门氏菌和猪源支气管败血波氏杆菌二价基因工程疫苗；

本发明的第三个目的是表达猪源支气管败血波氏杆菌fhaB和prn基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌株在制备猪霍乱沙门氏菌和猪源支气管败血波氏杆菌二价基因工程疫苗中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

一种不含抗性标记的表达猪源支气管败血波氏杆菌fha和prn基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌株(分类命名：Salmonella choleraesuis)C501(pYA-F1P2)，2007年9月6日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为：CCTCC NO：M207138。

所述的不含抗性标记的表达猪源支气管败血波氏杆菌fhaB和prn基因的重组猪霍乱沙门氏菌株缺失了沙门氏菌株基因组中必需的细胞壁形成相关基因asd基因(需要含asd基因的质粒存在于菌体内或外源添加DAP的培养基上才能正常生长、繁殖)，同时该重组菌株含有外源质粒pYA-F1P2(含有asd基因)，该重组菌株保留了亲本菌株C500作为猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株的免疫特性。质粒pYA-F1P2能在该菌株中表达asd基因与猪源支气管败血波氏杆菌免疫原性基因fhaB的TypeI区域(本发明命名为F1)和prn的R2区域(本发明命名为P2)片段。

其中，asd基因表达产物提供沙门氏菌株必需的细胞壁形成相关成份。fhaB基因F1片段和prn基因P2片段的表达产物提供良好的针对猪源支气管败血波氏杆菌的免疫原性。

本发明的不含抗性标记的表达猪源支气管败血波氏杆菌fhaB和prn基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌株，其基因工程菌株衍生于在中国已经使用了多年的商品化猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500(购自中国兽医药品监察所国家兽医微生物保藏中心商业菌株；黄昌炳等，仔猪副伤寒弱毒通气培养冻干苗口服免疫研究，中国农业科学，1981(6)：89～94；康凯，仔猪副伤寒活疫苗，中国兽药杂志，2003(37)，37：49)。所述的重组猪霍乱沙门氏菌株，缺失了C500菌株基因组中的asd基因，同时插入了含有asd基因和猪源支气管败血波氏杆菌fhaB基因F1片段和prn基因P2片段的质粒pYA-F1P2。由于需要pYA-F1P2的存在重组菌株才能存活，因此大大提高了质粒pYA-F1P2(也就是fhaB基因F1片段和prn基因P2片段)在重组菌株中的稳定性。fhaB基因F1片段和prn基因P2片段在重组菌株中的稳定表达，使之具有针对猪源支气管败血波氏杆菌很好的免疫保护力。

本发明的基本构建方法是：利用基因工程技术使猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500(简称C500，下同)必需的细胞壁形成相关基因asd基因缺失从而构建成新菌株，我们将该新菌株命名为C501。同时构建含有asd基因和猪源支气管败血波氏杆菌fhaB基因F1片段和prn某因P2片段的质粒pYA-F1P2。将该质粒pYA-F1P2转入C501 asd基因缺失株中，由于生长的需要质粒pYA-F1P2与C500 asd基因缺失株互补而稳定共存，形成我们发明的不含抗性标记的表达猪源支气管败血波氏杆菌fhaB和prn基因片段的重组C501(pYA-F1P2)菌株。通过大量的生物学实验数据证明本发明制备的重组菌株可用于制备针对猪霍乱沙门氏菌和猪源支气管败血波氏杆菌的二价疫苗。

本发明的主要优点是：

1、本发明制备的基因工程菌株表达的猪源支气管败血波氏杆菌fhaB基因F1片段和prn基因P2片段为猪源支气管败血波氏杆菌重要的免疫原性基因片段，具有良好的免疫保护性。由于猪源支气管败血波氏杆菌危害日益严重，而目前市场上各种商品化猪支气管败血波氏杆菌疫苗(主要是佐剂灭活苗)免疫效果普遍较差。因此，用本发明的基因工程菌株制成的疫苗具有广阔的市场应用前景。

2、本发明制备的基因工程菌株衍生于在中国已经使用了多年的商品化猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500，完全保留了C500针对猪霍乱沙门氏菌的免疫效力。而且，本发明的基因工程菌株毒力比C500稍弱，因而具有更好的生物安全性。

3、本发明制备的基因工程菌株可以同时提供针对猪霍乱沙门氏菌和支气管败血波氏杆菌两种病原的保护。

4、本发明制备的基因工程菌株不含抗性标记，完全符合疫苗生物安全性要求。

附图说明

图1：是本发明制备的转移质粒pREasd12的物理图谱。

图2：是本发明制备的转移质粒pREasd12的酶切鉴定结果。

图中M：DNA marker(DL 15,000)1：pREasd12/Xba I+Kpn I

图3：是本发明制备的转移质粒pREasd12构建的流程图。

图4：是本发明中不含抗性标记的猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗菌株C500 asd基因缺失突变菌株的PCR检测电泳图谱。

图4A：asd缺失菌株PCR鉴定图(Pa5/Pa6)，图中M1：DNA marker(DL 2,000)；M2：DNA marker(DL 15,000)；1-6为筛选的asd缺失菌株；7-12为亲本菌株C500对照；13为pREasd12质粒对照；14为H₂O对照。

图4B：asd缺失菌株PCR鉴定图(Pa7/Pa6)，图中M1：DNA marker (DL 2,000)；M2：DNA marker(DL 15,000)；1-4为筛选的asd缺失菌株；5为亲本菌株C500对照；6为pREasd12质粒对照；7为H₂O对照

图5：是本发明制备的重组质粒pYA-F1P2的物理图谱。

图6：是本发明制备的重组质粒pYA-F1P2的酶切鉴定结果。

图中M：DNA marker(DL 15,000)1：pYA-F1P2/EcoR I+HindIII

图7：是本发明制备的重组质粒pYA-F1P2构建的流程图。

图8：是本发明中一种不含抗性标记的表达猪源支气管败血波氏杆菌fhaB和prn片段的重组猪霍乱沙门氏菌活疫苗菌株C501(pYA-F1P2)的PCR鉴定电泳图谱。

图8A：是重组菌株asd缺失PCR鉴定图，图中M：DNAmarker(DL 15,000)；1和2为重组菌株；3为亲本菌株C500对照。

图8B：是该重组菌中fhaB基因F1片段的PCR鉴定图，图中M：DNA marker(DL 2,000)；1为亲本菌株C500对照；2为重组菌株

图8C：是该重组菌中prn基因P2片段的PCR鉴定图，图中M：DNA marker (DL2,000)；1为亲本菌株C500对照；2为重组菌株

图9：是本发明中一种不含抗性标记的表达猪源支气管败血波氏杆菌fhaB和prn片段的重组猪霍乱沙门氏菌活疫苗菌株C501(pYA-F1P2)的SDS-PAGE和Western-blot分析结果。

图9A：是用SDS-PAGE方法检测fhaB基因F1片段和prn基因P2片段融合蛋白rF1P2，图中1为重组菌株；2为亲本菌株C500对照；箭头所示为融合表达蛋白rF1P2。

图9B：是用Western-blot方法检测fhaB基因F1片段和prn基因P2片段融合蛋白rF1P2，图中1为重组菌株；2为亲本菌株C500对照

图10：是本发明中一种不含抗性标记的表达猪源支气管败血波氏杆菌fhaB和prn片段的重组猪霍乱沙门氏菌活疫苗菌株的遗传稳定性实验结果。

图10A：该重组菌中fhaB基因片段的PCR鉴定图，图中M：DNA marker(DL 2,000)；1为亲本菌株C500对照；2-7为1-50代重组菌株

图10B：该重组菌中prn基因片段的PCR鉴定图，图中M：DNA marker(DL 2,000)；1-6为1-50代重组菌株；7为亲本菌株C500对照

具体实施方式

以下结合说明书附图对本发明作进一步的说明。

实施例1 猪霍乱沙门氏菌C500asd基因缺失菌株的构建

1、引物设计(用于基因克隆和分子检测)

参照已报道的鼠伤寒沙门氏菌LT2株asd基因序列(GenBank No：AE008863)设计2对引物(pa1/pa2和pa3/pa4，见表1)，从猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500(购自中国兽医药品监察所国家兽医微生物保藏中心商业菌株)基因组中分别扩增asd基因上下游片段asd1(上臂)和asd2(下臂)，扩增片段大小分别为2112 bp和2069 bp，上臂两端分别引入XbaI和BamH I酶切位点，下臂两端分别引入BamH I和Kpn I酶切位点。另设计2对引物(pa5/pa6和pa7/pa6，见表1)进行C500亲本菌株和asd缺失菌株的鉴定。引物均由上海生物工程公司合成。

表1：PCR引物

  基因  名称  引物  名称  引物序列(5’-3’) 目的片段 长度(bp)  酶切位点  (下划线)  asd1上臂  pa1  pa2  TTTCTAGACGCTTTGAGCACGACTAA  TTGGATCCTGCGTTAGGAAGGGAATC  2112  Xba  BamH  asd2下臂  pa3  pa4  TTGGATCCAGGGTAGCTTAATCCCAC  TTGGTACCACCGAGCGTTCATTGTCA  2069  BamH  Kpn  asd/asd^-  pa5  pa6  TTGCTTTCCAACTGCTGAGC  TCCTATCTGCGTCGTCCTAC  1803(wt)  315(asd-)  /  asd/asd^-  pa7  pa6  TTGGACAATGTTACCGATAA  TCCTATCTGCGTCGTCCTAC  3717(wt)  2229(asd-)  /

2、猪霍乱沙门氏菌C500asd基因上下游片段asd1(上臂)与asd2(下臂)的克隆

将冻干的猪霍乱沙门氏菌C500在LB固体平板上划线，37℃培养16h。挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37℃、200r/min振摇培养16h。按细菌基因组提取试剂盒(购自北京TIANGEN公司)说明书提取基因组为PCR模板。

asd1和asd2扩增反应均在25μL的体系中进行，反应体系(PCR相关试剂均购自大连宝生物工程有限公司)如下：模板DNA1μL，10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/LMgCl₂2μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，2mmol/L dNTPs1μL，2U/μL Taqase 0.5μL，ddH₂O 16μL。

asd1和asd2扩增条件为：95℃变性5min后进入循环，循环参数为94℃1min，57℃1min，72℃ 2.5min。30个循环后，72℃延伸10min。扩增的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增2个片段大小与预期大小相当，分别为2112bp和2069bp。将得到的目的基因克隆到pMD18-T载体(购自大连宝生物工程有限公司)，送大连宝生物工程有限公司进行外源基因序列的测定。

3、pREasd12转移质粒的构建

用XbaI和BamHI双酶切asd1和pBluescriptSK(+)载体(购自美国Stratagene公司)，回收纯化后用T₄ DNA ligase(购自大连宝生物工程有限公司)连接，16℃水浴12h，转化DH5_α感受态细菌(购自大连宝生物工程有限公司)，37℃在固体LB培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母浸膏，5g氯化钠，15g琼脂粉，蒸馏水定容至1000mL，121℃高压25min)培养12h，挑菌到液体LB培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母浸膏，5g氯化钠，蒸馏水定容至1000mL，121℃高压25min)，37℃、225r/min振摇培养12h，使用质粒提取试剂盒(购自北京TIANGEN公司)小量制备质粒从而获得质粒pSKasd1。再用BamHI和KpnI双酶切asd2与质粒pSKasd1。回收后用T₄ DNA ligase连接，转化DH5α感受态细菌，37℃培养12h，挑菌到液体LB培养基，37℃、225r/min振摇培养12h，小量制备质粒从而获得质粒pSKasd12。用XbaI和KpnI双酶切转移质粒pSKasd12与自杀性质粒pRE112(由美国华盛顿大学Dr.Roy Curtiss III教授惠赠；Miller，V.L.，Mekalanos J.J.1988.A novel suicide vector and its use in construction oninsertion mutations：osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants inVibrio cholerae requires toxR.J.Bacteriol.170：2575-2583)，回收asd1+asd2片段和质粒pRE112，用T₄ DNA ligase连接，16℃水浴12h，电转化(黄培堂等译.萨姆布鲁克J，拉塞尔D W著.分子克隆实验指南(第三版).北京：科学出版社，2002)大肠杆菌x7213 (由美国华盛顿大学Dr.Roy Curtiss III教授惠赠；Edwards，R.A.，L.H.Keller，and D.M.Schifferli.1998.Improved allelicexchange vectors and their use to analyze 987P fimbria gene expression.Gene 207：149-157)构建重组菌株x213(pREasd12)，37℃培养12h挑菌到液体LB培养基，37℃、225r/min振摇培养12h，小量制备质粒从而获得pREasd12转移质粒，其物理图谱见图1。鉴定结果证实构建的转移质粒pREasd12是正确的(见图2)，转移质粒pREasd12构建流程如图3所示。

4、asd基因缺失株C501的构建

以x7213(pREasd12)为供体菌，C500为受体菌进行接合转移。供体菌和受体菌分别在LB培养基中培养过夜，无菌磷酸盐缓冲液(PBS，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄.12H₂O 2.9g，KH₂PO₄ 0.2g，蒸馏水加至1000mL，经121℃高压灭菌30min)洗两遍，调整菌浓度至OD₆₀₀为0.8，各取100μL菌悬液混合。将无菌硝酸纤维滤膜贴于含二氨基庚二酸(diaminopimelic acid，DAP，购自美国Sigma公司)的固体LB平板上，将混合菌液滴于滤膜上，37℃培养12h，同时做供体和受体对照。洗下滤膜上菌液，无菌PBS洗两遍，涂布含氯霉素(Cm，终浓度30μg/ml)的固体LB平板，37℃培养12h，将Cm抗性菌落同时转接含Cm和5％蔗糖的LB平板，筛选Cm抗性(Cm^r)接合子，提取基因组，用引物pa5/pa6(见表1)扩增鉴定(见图4A)。阳性接合子在无抗性无NaCl的LB液体培养基中培养12h，连续10倍稀释，涂布含5％蔗糖的无NaCl的固体LB平板，挑取单菌落复制在含Cm和5％蔗糖的固体平板，筛选Cm敏感(Cm^s)菌落。提取基因组，再次用引物pa5/pa6扩增鉴定，asd缺失株进一步用引物pa6/pa7(表1)鉴定(见图4B)。C500的asd基因缺失株由于缺失asd基因而失去合成DAP的能力，所以不能在无外源DAP的培养基上生长。结果表明，所构建的asd基因缺失株asd-C500是正确的，我们将其命名为C501。

实施例2重组质粒pYA-F1P2的构建

1、引物设计

参照已报道的支气管败血波氏杆菌fhaB(GenBank No：NC002927)和prn(GenBank No：AJ245927)基因序列设计2对引物，分别从猪源支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)HH0809(该菌株于2007年9月18日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M207148)的基因组中扩增fhaB基因的F1片段和prn基因的P2片段。扩增片段大小分别为465bp和300bp，pf1和pf2分别引入EcoR I和Sal I酶切位点，pp1和pp2分别引入SalI和HindIII酶切位点。引物序列如下：

pf1：5’TTTAAGAATTCCTGACTGCCCTGGACAAT-3’(EcoRI)

pf2：5’TTTAAGTCGACTCGCAGATCCGCGGCAAA-3’(SalI)F1片段465bp

pp1：5’TAATTGTCGACAACACCATGCTGCTGGTG-3’(SalI)

pp2：5’TTTAACTGCAGGGCGGACAACTCCCTGCC-3(Hind III)P2片段300bp

2、猪源支气管败血波氏杆菌F1和P2基因片段的克隆

将猪源支气管败血波氏杆菌HH0809株在含有15％脱纤绵羊血的鲍-姜氏(购自美国Difco公司)平板上培养48h，无菌PBS洗下，按细菌基因组提取试剂盒说明书提取基因组为PCR模板。

F1和P2基因片段扩增反应均在25μL的体系中进行，反应体系如下：模板DNA 1μL，10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/L MgCl₂2μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，2mmol/LdNTPs 1μL，2U/μL Taq 0.5μL，ddH₂O 16μL。

F1和P2基因片段扩增条件为：95℃变性5min后进入循环，循环参数为94℃30s，58℃30s，72℃ 30s。30个循环后，72℃延伸10min。扩增的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增2个片段大小与预期大小相当，分别为465bp和300bp。

3、重组质粒pYA-F1P2的构建与鉴定

用EcoRI和SalI双酶切F1与pMD18-T载体，回收纯化后用T₄ DNA ligase连接，16℃水浴12h，转化DH5_α感受态细菌，37℃培养12h，挑菌到液体LB培养基，37℃、225r/min振摇培养12h，小量制备质粒从而获得质粒pMD18-F1。再用SalI和HindIII双酶切P2与转移质粒pMD18-F1，回收纯化后用T₄ DNA ligase连接，16℃水浴12h，转化DH5_α感受态细菌，37℃培养12h，挑菌到液体LB培养基，37℃、225r/min振摇培养12h，小量制备质粒从而获得质粒pMD18-F1P2。用EcoR I和Hind III双酶切质粒pMD1 8-F1P2中的F1P2片段与穿梭质粒pYA3493(由美国华盛顿大学Dr.Roy Curtiss III教授惠赠；Kang，H.Y.，J.Srinivasan，and R.Curtiss III.2002.Immune responses to recombinant pneumococcal PspA antigen delivered by liveattenuated Salmonella enterica serovar Typhimurium vaccine.Infect.Immun.70：1739-1749)，回收纯化后用T₄ DNA ligase连接，16℃水浴12h，电转化大肠杆菌x6097(由美国华盛顿大学Dr.Roy Curtiss III教授惠赠；Nakayama，K.，S.M.Kelly，and R.Curtiss III.1988.Construction ofan Asd⁺expression-cloning vector：stable maintenance and high level expression of cloned genes ina Salmonella vaccine strain.Bio/Technology 6：693-697)感受态细胞，37℃培养12h，挑菌到液体LB培养基，37℃、225r/min振摇培养12h，小量制备质粒从而获得质粒pYA-F1P2，其物理图谱见图5。鉴定结果证实构建的重组质粒pYA-F1P2是正确的(见图6)，重组质粒pYA-F1P2构建流程如图7所示。

实施例3表达F1和P2基因片段的重组菌株的构建

C500的asd基因缺失株C501由于缺失asd基因而失去合成DAP的能力，所以不能在无外源DAP的培养基上生长，但是当其获得含有asd基因的重组质粒pYA-F1P2后将获得合成DAP的能力，恢复在不含DAP培养基上生长的能力。将重组穿梭质粒pYA-F1P2电转化C500的asd基因缺失株C501，在DAP阴性平板上进行筛选阳性克隆，挑取单菌落进行培养，并用引物pa7/pa6、pf1/pf2和pp1/pp2进行PCR鉴定(分别见图8A、图8B和图8C)。结果表明获得含有pYA-F1P2质粒的C501重组菌株是正确的，我们将其命名为C501(pYA-F1P2)。

实施例4表达F1和P2基因片段的重组菌株的生物学特性

1、F1和P2基因片段大肠杆菌表达产物兔抗血清的制备

用EcoR I和HindIII双酶切质粒pMD18-F1P2中的F1P2片段和pET-28a，回收纯化后用T₄ DNA ligase连接，转化大肠杆菌DH5_α感受态细菌，37℃在固体LB平板上培养12h，挑菌小量制备质粒从而获得表达质粒pET28a-F1P2。将pET28a-F1P2质粒进行序列测定，证实克隆正确后，转化大肠杆菌BL21(购自大连宝生物工程有限公司)，在含有卡那霉素(Kan，终浓度50μg/mL)固体LB平板上挑取阳性转化子到液体LB培养基，37℃、200r/min培养至对数生长期(吸光值OD₆₀₀＝0.6～1.0)加入IPTG(终浓度1mM)进行诱导表达4h，使用组氨酸融合蛋白提取试剂盒HIS-BindPurificationKit(购自美国Qiagen公司)按该公司提供的操作说明书，对表达产物纯化，获得浓度为320μg/mL的融合表达蛋白，命名为HIS-F1P2。将100μg表达产物HIS-F1P2与等体积弗氏完全佐剂(购自美国Sigma公司)均匀混合，皮下注射新两兰大白兔(购自湖北省预防医学科学院实验动物中心)，分别在3周(二免)和5周(三免)后各加强免疫1次(使用弗氏不完全佐剂，购自美国Sigma公司)。在3免后10d采血，提取血清，0.22μm滤膜过滤除菌，置-20℃备用。

2、C501(pYA-F1P2)重组菌株的表达特性分析

挑取重组菌株C501(pYA-F1P2)的单菌落在LB液体培养基中，37℃、200r/min 培养16h.8,000r/min离心收集菌体，进行聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，黄培堂等译.萨姆布鲁克J.拉塞尔D W著.分子克隆实验指南(第三版).北京：科学出版社，2002)，并使用兔抗HIS-F1P2血清进行Western-blotting分析(黄培堂等译.萨姆布鲁克J，拉塞尔D W著.分子克隆实验指南(第三版).北京：科学出版社，2002)。结果表明C501(pYA-F1P2)能表达大小为29.5 kDa的重组蛋白(命名为rF1P2)，且表达的重组蛋白具有良好的免疫学反应原性(见图9)。

3、C501(pYA-F1P2)重组菌株的表型鉴定

将C501(pYA-F1P2)重组菌株与亲本株C500划线接种固体LB平板，然后转接葡萄糖、乳糖、蔗糖、鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、卫矛醇、尿素等碳源及H₂S等生化鉴定管(购自杭州天和公司)进行生化反应。按血清因子(购自中国兽药监察所)说明书并进行O和H抗原鉴定。结果表明重组菌株C501(pYA-F1P2)的生化特性与亲本株C500一致。两者均不能产生H₂S，不能利用乳糖、蔗糖、阿拉伯糖、半乳糖醇和尿素，但是能够利用麦芽糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖和木糖为唯一炭源。重组菌株C501(pYA-F1P2)的血清型为6，7：C：1，5。与亲本株C500一致。这些结果表明重组菌株C501(pYA-F1P2)的生化特性与亲本菌株C500一致，符合猪霍乱沙门氏菌的典型表型特征。

4、C501(pYA-F1P2)重组菌株的生长特性分析

C501(pYA-F1P2)重组菌株在LB平板37℃培养12h，菌落其直径约为1.7mm，较亲本比C500株(2mm)稍小。亲本株C500与C501(pYA-F1P2)重组菌株从10⁶CFU/ml开始培养，每1h取样，并进行活菌计数。结果显示，C501(pYA-F1P2)重组菌株生长速度稍慢于亲本株C500，其平均世代间隔(Mean generation time)为30.7min，较亲本株(27.9min)延长2.8mm。

5、C501(pYA-F1P2)重组菌株的遗传稳定性

将本发明制备的C501(pYA-F1P2)重组菌株在固体LB平板上划线培养，挑取单菌落到液体LB培养基中，37℃、200r/min培养16h，按体积1∶1,000的比例转接到LB液体培养基中培养12h，再次按体积1∶1,000的比例转接到LB液体培养基中，连续进行10次转接。用引物pf1/pf2和pp1/pp2进行PCR扩增，扩增质粒在重组菌中的遗传情况见图10。图10表明，每次扩增的结果均无可见差别，表明本发明制备的C501(pYA-F1P2)重组菌株能够稳定遗传。

实施例5 C501(pYA-F1P2)重组菌株疫苗的制备

将获得的C501(pYA-F1P2)重组菌株进行鉴定，每代接种于LB培养基上，利用引物pya/pf2进行PCR检测鉴定重组细菌的遗传稳定性，经20次传代后发现仍然能扩增出大小分别为645bp片段，其遗传性能稳定。通过Western-blotting检测发现，rF1P2重组蛋白可以在重组菌株中稳定表达，并具有良好的免疫学反应原性。该C501(pYA-F1P2)重组菌株在LB固体培养基上培养，挑取单菌落于LB液体培养基中培养，直到活菌浓度达到1×10¹⁰CFU/mL。按细菌液：明胶保护剂(体积∶体积)为7∶1的比例加入明胶保护剂(该明胶保护剂配制方法是：每100mL去离子水中加蔗糖40g，明胶8g，充分融化后，置121℃下灭菌30min后保存备用)，于灭菌冻干瓶中按2.0mL/瓶分装，置-50℃冷冻干燥机中冻干，冻干36-40h后压盖，用10％铝胶生理盐溶解并进行活菌计数(CFU)，并确定没有杂菌污染，置-20℃保存备用，作为研制重组疫苗的疫苗菌株。

实施例6 C501(pYA-F1P2)重组菌株疫苗的安全性评价

1、小鼠腹腔感染途径的安全评价

为测定构建的重组菌株C501(pYA-F1P2)对BALB/c小鼠的安全性，将32只Bab/C小鼠平均分为2个大组，每大组分为4小组。第1大组小鼠进行腹腔途径感染C501(pYA-F1P2)，每小组每只分别注射2.1×10⁵CFU、2.1×10⁶CFU、2.1×10⁷CFU和2.1×10⁸CFU；第2大组进行腹腔接种亲本菌C500，每小组每只分别注射2.1×10⁵CFU、2.1×10⁶CFU、2.1×10⁷CFU和2.1×10⁸CFU。记录死亡情况并按照Reed and Muench法进行计算小鼠半数致死剂量(LD₅₀)。评价C501(pYA-F1P2)重组菌株与亲本菌株C500相比毒力是否减弱以及对小鼠是否安全。试验结果见表2：显示C501(pYA-F1P2)重组菌株和亲本菌株C500的LD₅₀分别为1.5×10⁷CFU和3.3×10⁶。

表2本发明的双基因缺失疫苗菌株与亲本株毒力比较试验

 试验菌株    感染剂量    死亡数量/    试验总数    半数致死量    LD₅₀(CFU) C500亲本菌 (对照1)    2.1×10⁵    0/5    3.3×10⁶    2.1×10⁶    3/5    2.1×10⁷    4/6    2.1×10⁸    5/5 C501(pYA-F1P2) 重组菌 (对照2)    2.2×10⁵    0/5    1.5×10⁷    2.2×10⁶    1/5    2.2×10⁷    3/6    2.2×10⁸    5/5

CFU，计算可知重组菌株的毒力较亲本菌株C500降低了4.5倍。这说明本发明的C501(pYA-F1P2)重组菌株与已被证明安全的弱毒疫苗亲本株C500相比，毒力更低，对猪应该更加安全。

2、本发明的重组菌株C501(pYA-F1P2)对猪的安全性评价

以亲本菌株C500的免疫剂量(3×10⁹CFU)为参考数据，分别通过颈部肌肉注射4周龄断奶仔猪和怀孕母猪(结果见表x)。本发明制备的C501(pYA-F1P2)重组菌株按每头猪注射2mL(含5×10⁹CFU活菌数)接种4周龄的断奶仔猪10头，所有仔猪的精神食欲正常，未见异常变化，免疫2周后均可以检测到沙门氏菌抗体和rF1P2重组蛋白的特异性抗体。亲本菌株C500接种的仔猪(即对照1)，也没有异常临床表现。本发明的C501(pYA-F1P2)重组菌株按每头猪注射4mL(含1×10¹⁰CFU活菌数)接种妊娠母猪5头，所有妊娠母猪的精神食欲正常，未见异常变化，免疫2周后均可以检测到沙门氏菌抗体和rF1P2重组蛋白的特异性抗体；和未接种的妊娠母猪比较，窝产仔数基本相当，均没有出现死胎、木乃伊胎等。这两个试验证实本发明制备的C501(pYA-F1P2)重组菌株对妊娠母猪也是安全的。

实施例7本发明的重组菌株C501(pYA-F1P2)在小鼠体内的免疫效力检测

1、小鼠的免疫程序：

使用5-6周龄的BALB/c小鼠作为免疫效力评价，根据试验要求分为3组，分别为本发明制备的C501(pYA-F1P2)重组菌株疫苗组、C500亲本菌株疫苗组和非免疫空白对照组。免疫途径为背部皮下注射0.2mL(含1.2×10⁸CFU活菌量)细菌液或LB培养基，14天后加强免疫1次。分别于免疫前0天、首免后14天和28天检测沙门氏菌血清抗体(标准ELISA方法，参照Covone，M.G.，M.Brocchi，E.Palla，W.Dias，da，Silveira，R.Rappuoli，and C.L.Galeotti.1998.Levels of expression and immunogenicity of attenuated Salmonella enterica serovar Typhimuriumstrains expressing Escherichia coli mutant heat-labile enterotoxin.Infect.Immun.66：224-231)。同时以实施例4中制备的组氨酸融合表达产物HIS-F1P2为抗原(100ng/孔)包被ELISA板，按间接ELISA方法(方法参照柳忠辉等，免疫学常用实验技术，北京：科学出版社，2002)检测rF1P2重组蛋白抗体水平。

2、免疫小鼠体液免疫抗体水平检测

小鼠免疫前采血，第二、三次采血分别在首免后14、28天进行，每组选取5只经尾静脉负压采血，分离血清，分别检测抗沙门氏菌血清抗体、rF1P2特异性抗体效价，取平均值。结果见表3。从表3中可以看出，首免后第2周本发明的C501(pYA-F1P2)重组菌疫苗组和C500亲本菌疫苗组沙门氏菌抗体为1∶384和1∶448，二免后2周(即首免后4周)，本发明的C501(pYA-F1P2)重组菌疫苗组和C500亲本菌疫苗组沙门氏菌抗体效价分别升至在1∶3584和1∶：4096。而同步进行的LB对照均为阴性(＜1∶10)。首免2周本发明的C501(pYA-F1P2)重组菌疫苗组rF1P2特异性抗体效价为1∶512，二免后2周，本发明的C501(pYA-F1P2)重组菌疫苗组rF1P2抗体效价上升到1∶3328。而同步进行的对照亲本菌株C500和PBS对照均为阴性(＜1∶10)。二免后2周(即首免后4周)，本发明制备的C501(pYA-F1P2)重组菌疫苗组和C500亲本菌疫苗免疫组产生的ELISA抗体均有一定程度的上升，且效价接近。本发明制备的C501(pYA-F1P2)重组菌疫苗组能产生rF1P2特异性抗体，抗体效价平均水平为1∶3328，LB对照组抗体检测仍为阴性(＜1∶10)。上述结果表明本发明制备的C501(pYA-F1P2)重组菌疫苗免疫小鼠后能诱导机体产生特异性的抗沙门氏菌和支气管败血波氏杆菌的体液免疫应答。

表3本发明制备的重组菌C501(pYA-F1P2)疫苗免疫小鼠血清抗体检测(ELISA法)

    试验分组    沙门氏菌抗体效价    rF1P2抗体效价    首免2周    首免4周    首免2周    首免4周    本发明的重组菌    C501(pYA-F1P2)疫苗组    1∶384    1∶3584    1∶512    1∶3328    亲本菌    C500疫苗组    1∶448    1∶4096    ＜1∶10    ＜1∶10    LB    对照组    ＜1∶10    ＜1∶10    ＜1∶10    ＜1∶10

3、C501(pYA-F1P2)重组菌疫苗免疫BALB/c小鼠的保护性试验：

将5-6周龄沙门氏菌阴性BALB/c小鼠90只，平均分为三组，即本发明制备的C501(pYA-F1P2)重组菌疫苗组、C500亲本菌疫苗组对照组、LB对照组。本发明制备的C501(pYA-F1P2)重组菌疫苗组和C500亲本菌疫苗组对照组以0.2mL(活菌含量1.2×108CFU)培养液通过背部皮下注射BALB/c小鼠；LB对照组每只背部皮下注射0.2mL LB培养基。14天后加强免疫1次。

二免后第2周(首免后4周)，从各组小鼠随机选取10只，均使用100×LD₅₀(含有2.6×10⁶CFU)猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-1(弱毒疫苗菌株C500的亲本菌株，购自中国兽医药品监察所国家兽医微生物保藏中心商业菌株)对小鼠口服攻毒，观察30天。LB对照组小鼠攻毒后6h开始呈现精神沉郁、不食、扎堆；第2天开始出现死亡，死亡高峰出现第5天，到第8天全部死亡。本发明制备的C501(pYA-F1P2)重组疫苗组与攻毒后没有出现明显的发病症状，没有死亡情况发生。C500亲本菌疫苗对照组情况与C501(pYA-F1P2)重组菌疫苗组相似。这说明本发明制备的C501(pYA-F1P2)重组菌疫苗组能够抵御100×LD₅₀猪霍乱沙门氏菌强度株C78-1的攻击。攻毒后保护率情况见表4所示。

表4本发明制备的重组菌C501(pYA-F1P2)疫苗对猪霍乱沙门氏菌C78-1强毒株攻击BALB/c小白鼠的保护性评价

  试验分组    皮下免疫剂    量(CFU)    口服攻毒剂    量(CFU)   存活数/总数    保护率    (％)  本发明的重组菌  C501(pYA-F1P2)疫苗组    1.2×10⁸    2.6×10⁶   10/10    100  亲本菌  C500疫苗组    1.2×10⁸    2.6×10⁶   10/10    100  PBS  对照组    200μL    2.6×10⁶   0/10    0

二免后16天(首免后30天)，将各组剩余小鼠(每组剩余20只)用于猪源支气管败血波氏杆菌的攻击。将支气管败血波氏杆菌强毒株HH0809在含有15％脱纤绵羊血的鲍-姜氏平板上培养48h后，用含有1％水解酪蛋白氨基酸的PBS洗下，调整到合适的攻毒浓度(30μL含有5.2×10⁶CFU活菌)。每只小鼠通过腹腔注射0.2mL麻醉药品(含有0.25mg 甲苯噻嗪和1.25mg氯胺酮)麻醉小鼠，将其仰卧，然后用30μL含有5.2×10⁶CFU活菌的溶液注射到小鼠的鼻孔中，让其完全吸收。观察30天。C500亲本菌疫苗对照组和LB空白对照组小鼠攻毒后均表现精神萎靡，不食，8h后开始出现死亡，死亡高峰出现在3-4 d，7d后死亡停止。死亡小鼠剖检可见肺有明显的坏死、出血，渗出液增多、变稠；肝、肠脏器出血、坏死，表面多附有一层伪膜，易剥离；从死亡小鼠心血、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏均能分离到感染菌。本发明的C501(pYA-F1P2)重组菌疫苗组20只小鼠全部存活，且在攻毒后没有出现任何发病情况，保护率为100％(20/20)。而C500亲本菌疫苗对照组(20只)和LB空白对照组小鼠(20只)分别存活3只和4只。这说明本发明制备的重组菌C501(pYA-F1P2)疫苗组能够抵御4×LD₅₀猪源支气管败血波氏杆菌强度株HH0809的攻击。攻毒后保护率情况见表5所示。

表5本发明制备的重组疫苗C501(pYA-F1P2)对猪源支气管败血波氏杆菌野生型强毒株HH0809攻击RALB/c小白鼠的保护性

  试验分组    皮下免疫剂    量(CFU)    鼻腔攻毒剂    量(CFU)   存活数/总数    存活率    (％)  本发明的重组菌  C501(pYA-F1P2)疫苗组    1.2×10⁸    5.2×10⁵   20/20    100  亲本菌  C500疫苗组    1.2×10⁸    5.2×10⁵   3/20    15  PBS  对照组    200μL    5.2×10⁵   4/20    5

实施例8本发明制备的重组菌疫苗C501(pYA-F1P2)在猪体内的免疫效力检测

1、猪的免疫程序：

选择20-25日龄、沙门氏菌和支气管败血波氏杆菌阴性的仔猪24头，试验分3组，第1组为LB对照组，编号1-8，第2组为C500亲本菌疫苗对照组，编号9～16，第3组为本发明的C501(pYA-F1P2)重组菌疫苗组，编号17～24。

LB对照组每头猪注射1mL LB培养基，C500亲本菌疫苗对照组和本发明的重组菌疫苗C501(pYA-F1P2)组每只猪颈部肌肉注射1mL培养物(活菌含量4×10⁹CFU)，免疫2次，间隔2周。在一免后2周和二免后2周各采血一次，分别用ELISA方法检测沙门氏菌血清抗体(标准ELISA方法，参照Covone，M.G.，M.Brocchi，E.Palla，W.Dias，da，Silveira，R.Rappuoli，and C.L.Galeotti.1998.Levels of expression and immunogenicity of attenuated Salmonella entericaserovar Typhimurium strains expressing Escherichia coli mutant heat-labile enterotoxin.Infect.Immun.66：224-231)和rF1P2重组蛋白抗体水平(方法同实施例7)。试验分组、免疫途径和免疫剂量详细情况见表6。

2、免疫仔猪ELISA抗体水平检测

分别在第一次免疫后2周和第二次免疫后2周前腔静脉采血，分离血清，采用间接ELISA方法分别检测沙门氏菌血清抗体、rF1P2特异性抗体效价，取平均值。结果见表6：首免后第2周本发明的重组菌疫苗C501(pYA-F1P2)组和C500亲本菌疫苗组沙门氏菌抗体均为1∶320，二免后2周(即首免后4周)，本发明的)重组菌疫苗C501(pYA-F1P2组和C500亲本菌疫苗组沙门氏菌抗体效价分别升至在1∶2816和1∶3072。而同步进行的LB对照均为阴性(＜1∶5)。首免2周本发明的重组菌疫苗C501(pYA-F1P2)组rF1P2特异性抗体效价为1∶288，二免后2周，rF1P2抗体效价上升到1∶1920。而同步进行的C500亲本菌株对照组和LB对照组均为阴性(＜1∶5)。上述结果表明本发明制备的C501(pYA-F1P2)重组菌疫苗免疫仔猪后能诱导机体产生特异性的抗沙门氏菌和rF1P2特异性抗体的体液免疫应答。

表6本发明制备的重组菌疫苗C501(pYA-F1P2)免疫仔猪血清抗体检测(ELISA法)

    试验分组    沙门氏菌抗体效价    rF1P2抗体效价    首免2周    首免4周    首免2周    首免4周    本发明的重组菌    C501(pYA-F1P2)疫苗组    1∶320    1∶2816    1∶288    1∶1920    亲本菌    C500疫苗组    1∶320    1∶3072    ＜1∶5    ＜1∶5    LB    对照组    ＜1∶5    ＜1∶5    ＜1∶5    ＜1∶5

3、本发明制备的重组菌疫苗C501(pYA-F1P2)免疫仔猪的保护性试验：

二免后第16天，(首免后30天)，从第1、2和3组中每组选取4头，每头猪耳静脉注射1mL C78-1强毒株菌液(含有约5×LD₅₀，约2×10⁹CFU活菌)进行攻毒，观察30天。LB对照组仔猪攻毒后表现为体温升高至41-42℃，精神不振，伏卧，食欲减退或废绝，呼吸因难，步行摇晃，呕吐与腹泻。四肢末端及腹部发绀。攻毒后3天开始死亡，7天内全部死亡。本发明的重组菌疫苗C501(pYA-F1P2)组和C500亲本菌疫苗组仔猪攻毒后无明显发病症状，全部存活。这说明C501(pYA-F1P2)重组疫苗保留了C500亲本菌疫苗的抵抗猪霍乱沙门氏菌感染的能力，能够抵御5×LD₅₀猪霍乱沙门氏菌强度株C78-1的攻击。攻毒后保护率情况见表8所示。

表8本发明制备的重组疫苗C501(pYA-F1P2)对猪霍乱沙门氏菌C78-1野生型强毒株攻击仔猪的保护件

  试验分组  皮下免疫剂  量(CFU)  耳静脉攻毒  剂量(CFU)    存活数/总数    保护率    (％)  本发明的重组菌  C501(pYA-F1P2)疫苗组  4×10⁹  2×10⁹    4/4    100  亲本菌  C500疫苗组  4×10⁹  2×10⁹    4/4    100  PBS  对照组  1mL  2×10⁹    0/4    0

二免后第16天，(首免后30天)，将各组剩余仔猪(每组剩余4头)用于猪源支气管败血波氏杆菌的攻击。将支气管败血波氏杆菌强毒株HH0809在含有15％脱纤绵羊血的鲍-姜氏平板上培养48h后，用含有1％水解酪蛋白氨基酸的PBS洗下，调整到合适的攻毒浓度(2×10¹¹CFU/mL活菌)。每头仔猪通过颈部气管注射2 mL含有4×10¹¹CFU活菌的溶液注射到呼吸道中，让其完全吸收。攻毒后连续观察一周。亲本菌C500疫苗对照组和LB空白对照组仔猪攻毒后均表现体温升高，咳嗽，呼吸困难，不食，流鼻涕，发病率为100％。本发明的重组菌C501(pYA-F1P2)疫苗组4头仔猪在攻毒后没有出现任何明显发病情况发病率为0。攻毒后一天所有仔猪解剖观察病理变化。攻毒后保护情况见表9

表9本发明制备的重组疫苗C501(pYA-F1P2)对支气管败血波氏杆菌野生型强毒株HH0809攻击仔猪的保护结果

  组别    编号    临床症状和细菌分离情况    肺炎^a    气管炎^b   呼吸频率^c   呼吸困难^d   食欲^f  发病率 细菌分离^g  LB对照组    1    2    3    4    +++    +++    +++    +++    +++    ++    +++    +++   22   23   26   25   3   3   3   3   1   1   1   1  100％ + + + +  亲本菌  C500疫苗组    9    10    11    12    +++    ++    +++    +++    +++    ++    ++    +++   25   21   25   24   3   2   3   3   1   0   1   1  100％ + + + +  本发明的重组菌  C501(pYA-F1P2)  疫苗组    21    22    23    24    -    -    -    +    -    -    -    +   8   9   8   10   0   0   0   1   0   0   0   0  0％ - - - -

a，b肺炎和气管炎的病变程度：-，无；+，轻微；++，中等程度；+++，严重

c呼吸频率：每15秒的呼吸次数

d呼吸困难：0，正常；1，轻微；2，中等程度；3，严重

e嗜睡程度：0，正常；1，轻微；2，中等程度；3，严重

f食欲情况(36h内)：0，吃食；1，不吃食

g细菌分离：+，从肺部能分离；-，不能分离

本发明实施例的试验结果都明确显示，本发明的一种不含抗性标记的表达猪源支气管败曲波氏杆菌fhaB和prn基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌株C501(pYA-F1P2)疫苗能激发机体产生高效价的猪霍乱沙门氏菌抗体，以及产生高效价的针对猪支气管败血波氏杆菌FHA和PRN免疫性抗原的特异性抗体，对小鼠和猪毒性很低，安全性好。在免疫保护力试验中，对猪霍乱沙门氏菌和猪源支气管败血波氏杆菌都具有很高的攻毒保护率。