公开/公告号CN101151300A
专利类型发明专利
公开/公告日2008-03-26
原文格式PDF
申请/专利权人 格利达股份公司;
申请/专利号CN200680009917.1
申请日2006-05-31
分类号C08H1/06(20060101);C08L89/06(20060101);C12P21/06(20060101);
代理机构11219 中原信达知识产权代理有限责任公司;
代理人樊卫民;郭国清
地址 德国埃伯巴赫
入库时间 2023-12-17 19:58:27
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-12-14
专利权人的姓名或者名称、地址的变更 IPC(主分类):C12P21/06 变更前: 变更后: 申请日:20060531
专利权人的姓名或者名称、地址的变更
2011-05-25
授权
授权
2008-05-21
实质审查的生效
实质审查的生效
2008-03-26
公开
公开
发明领域
本申请要求2005年5月31日提交的USSN 11/140,863的优先权，该申请的全部内容被纳入本文以供参考。
本发明一般涉及明胶水解产物、用于制备该明胶水解产物的方法、和包括该明胶水解产物的组合物。更具体地，本发明提供了具有高伯胺含量的低分子量明胶水解产物、用于制备该明胶水解产物的方法、和包括该明胶水解产物的明胶组合物。
发明背景
通过使材料如猪皮、牛皮或皮革、和动物骨头中所含的胶原变性来制造明胶。像其母体蛋白质胶原一样，明胶也由包括独特氨基酸掺混物的不同结构来定义。天然胶原是基于多肽链的硬蛋白，包含约1050个氨基酸。三种所述多肽链结合起来形成三股螺旋。几种所述三股螺旋叠加产生通过交联而稳定的胶原细丝，从而形成三维网络结构。这种特别的结构使得胶原是不可溶的；然后通过部分水解为明胶或明胶水解产物将其变成可溶形式。胶原以及因此明胶的氨基酸含量为约三分之一甘氨酸和另外22％脯氨酸和4-羟基脯氨酸；剩余45％包括17种不同的氨基酸。明胶具有极高含量的酸性和碱性氨基酸。对于酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)，各种数量作为谷氨酰胺和天冬酰胺的酰氨基形式存在，这取决于在明胶制造过程中所用的加工条件。完全不存在半胱氨酸；对于含硫氨基酸，唯一存在的是甲硫氨酸。
家禽和鱼胶原的数据稍有不同，但本发明可类似地用于源自家禽和鱼胶原的明胶和/或明胶水解产物。
明胶能够用于广泛的应用，这取决于其原材料和制造方法。这是因为明胶的物理和化学行为一方面取决于其氨基酸含量与所得空间结构的组合，另一方面取决于各种条件如pH、离子强度和与其它分子的反应。例如，不同种类的明胶可用于不同的应用，例如食品、照相、化妆品和制药。
在制药工业中，明胶特别用于制造硬胶囊和软胶囊。明胶胶囊提供了方便有效的方法来口服施用药物，因为胶囊在暴露于胃的酸性内容物后会迅速崩解，从而将药物释放到体内。尽管明胶胶囊提供了一流的药学手段来施用药物，但风险在于明胶胶囊可能遭遇由称为交联的过程所致的崩解和溶解延迟。据信，当明胶中的羰基、胶囊中包含羰基的填充成分、或填充成分分解成的羰基与明胶所含的伯胺和其它含氮化合物反应以形成交联时，会发生交联。
尤其是，交联可能对明胶胶囊在长期贮存和暴露于极端高热和高湿时的行为具有不利的结果。胶囊剂型内的广泛明胶交联可以导致形成非常薄弱、坚硬和水不溶性的膜，通常称为薄皮。薄皮作为橡胶状的水不溶性层，能够限制或防止胶囊内容物的释放。
一种广泛报道的用于防止明胶胶囊内部交联的手段关注作为羰基清除剂的产品，它们可以防止羰基如醛基与明胶胶囊壳相互作用，从而防止明胶交联。这些方法通常全都建议将产品添加到明胶胶囊所含的药物组合物中。例如，已经显示将氨基酸甘氨酸和柠檬酸组合添加到包封在硬明胶胶囊内的剂型中，能够改进硬胶囊的溶解曲线(3)。证实单独添加氨基酸甘氨酸不能获得满意的结果。但是以减少明胶胶囊内部交联所需的量添加羰基清除剂如甘氨酸、和羧酸如柠檬酸盐，这显然受到成本的限制。这样的话，将这些产品添加到明胶中并不是解决明胶胶囊交联的实用方案。
发明概述
本发明提供了一种实用的、成本有效的手段来减少明胶的交联。简言之，本发明包括低分子量的明胶水解产物，当其与较高分子量的明胶掺混时，通过增加掺混明胶产物中游离甘氨酸、其它氨基酸和小肽的量，该产物可减少明胶的交联并改进溶解性质。有益地，因为本发明的明胶水解产物和掺混的明胶组合物具有减少的交联性质，而不用将产品如甘氨酸作为独立化合物与柠檬酸混合，所以所述明胶仍然可以作为天然产物出售。
因此，在本发明的几个方面，提供了用于制备明胶水解产物的方法，该水解产物的平均分子量为约100至约2000Da，优选约1500Da，平均伯胺含量为约1.0×10-3至约1.0×10-2μMol伯胺/μg明胶水解产物。该方法包括：使明胶原材料与至少一种具有内肽酶活性的蛋白水解酶接触，以形成经内肽酶消化的明胶产物。然后典型地使经内肽酶消化的明胶产物与至少一种具有外肽酶活性的蛋白水解酶接触。通常，内肽酶和外肽酶的蛋白水解消化过程进行足够长的时间，所实施的反应条件可形成明胶水解产物。
本发明的另一方面包括用于制备明胶水解产物的方法。该方法包括：使明胶原材料与一系列至少三种具有内肽酶活性的蛋白水解酶接触，以形成经内肽酶消化的明胶产物。典型地，所述三种蛋白水解酶由来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的内肽酶(例如Corolase7089)、菠萝蛋白酶(例如Enzeco菠萝蛋白酶浓缩物)和木瓜蛋白酶(例如木瓜蛋白酶6000L)组成。然后使经内肽酶消化的明胶产物与一系列至少两种具有外肽酶活性的蛋白水解酶接触。通常，所述两种蛋白水解酶由来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的外肽酶(例如ValidaseFPII)和来自豆曲霉(Aspergillus sojae)的外肽酶(例如CorolaseLAP)组成。
本发明的还一方面提供了明胶水解产物。所述明胶水解产物的平均分子量典型地为约100至约2000Da，优选约1500Da，平均伯胺含量典型地为约1.0×10-3至约1.0×10-2/μMol伯胺/μg明胶水解产物。在一个实施方案中，通过如下方法制备所述明胶水解产物，该方法包括：使明胶原材料与一系列至少三种具有内肽酶活性的蛋白水解酶接触，以形成经内肽酶消化的明胶产物。典型地，所述三种蛋白水解酶选自：来自枯草芽孢杆菌的内肽酶(例如Corolase7089)、菠萝蛋白酶(例如Enzeco菠萝蛋白酶浓缩物)和木瓜蛋白酶(例如木瓜蛋白酶6000L)。然后使经内肽酶消化的明胶产物与一系列至少两种具有外肽酶活性的蛋白水解酶接触。通常，所述两种蛋白水解酶选自：来自米曲霉的外肽酶(例如ValidaseFPII)和来自豆曲霉的外肽酶(例如CorolaseLAP)。
本发明的附加方面涉及明胶组合物。该组合物包括明胶水解产物和明胶。典型地，所述组合物将包括约1wt％至约20wt％明胶水解产物和约80wt％至约99wt％明胶。
对于本发明的其它目的和特征，一部分是显而易见的，一部分将在下文中指出。
附图简述
图1显示了：通过涡旋硬化程序测量，经添加2种不同的明胶水解产物BH-3型和LHSH型，减少了由甲醛诱导的石灰鞣革明胶LH-1的交联。BH-3型水解产物为低分子量石灰鞣革水解产物，LHSH型为本发明的石灰鞣革水解产物。
优选实施方案描述
本发明提供了新型明胶水解产物、用于制备所述明胶水解产物的方法和包括所述明胶水解产物的明胶组合物。已经发现，将低分子量的明胶水解产物、尤其是本发明的明胶水解产物与明胶掺混，可以通过增加掺混明胶产物中游离甘氨酸、其它氨基酸和小肽的量来减少明胶交联的趋势，并改进溶解性质。有益地，本发明提供了成本有效的手段来减少明胶交联，并且有益地保留了明胶的初始氨基酸成分，而不需要添加非明胶来源的化合物如柠檬酸。这样的话，本发明的明胶水解产物组合物仍然能够作为天然产物出售。
I.用于制备明胶水解产物的方法
本发明的一个方面包括用于制备明胶水解产物的方法，该水解产物的平均分子量为约100至约2000Da，优选约1500Da，平均伯胺含量为约1.0×10-3至约1.0×10-2μMol伯胺/μg明胶水解产物。该方法包括使明胶原材料与至少一种具有内肽酶活性的蛋白水解酶接触，以形成经内肽酶消化的明胶产物。然后典型地使经内肽酶消化的明胶产物与至少一种具有外肽酶活性的蛋白水解酶接触。通常，内肽酶和外肽酶蛋白水解消化过程进行足够长的时间，反应的运行条件能够形成明胶水解产物。
本发明方法所用的明胶原材料典型地源自获自几种合适原料的胶原或富含胶原的组织。富含胶原的组织包括来自动物的皮肤和骨头，例如来自鱼、家禽、猪或牛。源自胶原的明胶通常有两种主要的类型，即A型和B型，其区别在于制造方法。在一个实施方案中，明胶原材料为A型明胶。A型的等离子点为7至10.0，可通过本领域公知的方法，以专用的酸预处理法从胶原获得。在替代实施方案中，明胶原材料为B型明胶。B型的等离子点为4.8至5.8，是胶原的碱预处理的结果，可通过本领域公知的方法制得。
在另一个替代实施方案中，明胶原材料为A型和B型的混合物。A型和B型明胶各自的量可以大不相同，只要不损害所产生的明胶水解产物的性质。
基本上，可以用酶解产生的明胶完全或部分地交换A型和B型明胶中的任何一种。然而，到目前为止，用于制造明胶的酶解方法并未得到广泛使用。
无论哪种实施方案，明胶原材料通常都将包含约80wt％至约90wt％蛋白质、约0.1wt％至约2wt％矿盐(对应灰分含量)和约10wt％至约15wt％水。
还预期明胶原材料的物理性质能够并且将根据明胶水解产物的预期用途而变化。明胶原材料的平均分子量将典型地为约50,000Da至约200,000Da。在特别优选的实施方案中，明胶原材料的平均分子量将小于约150,000Da。
在一个实施方案中，明胶原材料的胶凝强度(bloom strength)将为约50至约300，pH将为约3.8至约7.5，等电点将为约4.7至约9.0，粘度将为约15至约75mP，灰分将为约0.1至约2.0％。
在替代实施方案中，当明胶原材料基本上为A型明胶时，胶凝强度将为约50至约300，pH将为约3.8至约5.5，等电点将为约7.0至约9.0，粘度将为约15至约75mP，灰分将为约0.1至约2.0％。
在替代实施方案中，当明胶原材料基本上为B型明胶时，胶凝强度将为约50至约300，pH将为约5.0至约7.5，等电点将为约4.7至约5.4，粘度将为约20至约75mP，灰分将为约0.5至约2.0％。
在一个优选实施方案中，当明胶水解产物用于制造硬胶囊药物产品时，明胶原材料的胶凝强度将为约200至约300，粘度将为约40至约60mP，pH将为约4.5至约6.5。在还一个优选实施方案中，当明胶水解产物用于制造软壳胶囊药物产品时，明胶原材料的胶凝强度将为约125至约200，粘度将为约25至约45mP，pH将为约4.5至约6.5。
在本发明的方法中，典型地通过被称为溶胀的过程将明胶原材料与水混合或溶于水，以形成包括约10wt％至约60wt％明胶的溶液。在一个优选实施方案中，所述溶液包括约10wt％至约50wt％明胶。
在进一步优选的实施方案中，所述溶液包括约20wt％至约50wt％明胶。在还更优选的实施方案中，所述溶液包括约35wt％至约40wt％明胶。
预期具有不同粒度的明胶可以用于本发明作为原材料。例如，明胶粒度可以为约0.1mm至约10mm。在一个实施方案中，明胶粒度可以为精细型，平均粒度为约0.1至约0.3mm。在另一个实施方案中，明胶粒度可以为中等，平均粒度为约0.3至约0.8mm。在还一个实施方案中，明胶粒度可以为大型，平均粒度近似大于约0.8mm。一般来说，明胶原材料的粒度将影响明胶溶于溶液中所需的时间。在溶胀过程中，利用明胶可吸收其十倍重量的冷水的能力。细粒度的明胶在几分钟内溶胀，中等粒度的明胶在约8至约12分钟内溶胀，而大粒度的明胶在约一小时内溶胀。典型地，能够使用所有粒度制备低浓度的明胶溶液，即包含例如约10wt％至约20wt％明胶的溶液。对于高浓度的溶液，即包含例如约30wt％至约35wt％明胶的溶液，典型地使用粗粒子，因为它们不会在加工过程中趋于聚集，并且可产生较少的气泡。
在通过溶胀过程使明胶成为溶液后，典型地在添加蛋白水解酶前，典型地调整溶液的pH、温度和氧化还原态，以使明胶在制造过程中存在少量残余过氧化物，从而优化水解反应，尤其是确保在水解反应中所用的包含半胱氨酸的蛋白水解酶作用接近其最佳活性水平。调整明胶溶液的pH并保持在约5至约7。在特别优选的实施方案中，调整明胶溶液的pH并保持在约6.0至约6.5。在该pH下，下面详述的蛋白水解酶接近其最佳活性水平。可以根据本领域公知的方法调整和监测明胶溶液的pH。例如，要降低明胶溶液的pH，典型地添加酸如盐酸。或者，要增加明胶溶液的pH，典型地添加碱如氢氧化钠。在水解反应过程中，优选根据本领域已知的方法，将明胶溶液的温度调整并保持在约40℃至约65℃。在特别优选的实施方案中，在水解反应过程中，将明胶溶液的温度调整并保持在约50℃至约60℃。通常，高于该范围的温度可能使蛋白水解酶失活，而低于该范围的温度将减缓蛋白水解酶的活性。根据水解反应中所用的蛋白水解酶，典型地应该调整明胶溶液的氧化还原态并保持为中性至稍偏还原一侧。高水平的氧化剂将钝化水解反应中所用的一些包含半胱氨酸的蛋白水解酶，而低水平的还原剂可以用于保留一些蛋白水解酶，如木瓜蛋白酶的活性，直至它们被失活。
通常，通过将蛋白水解酶添加到明胶溶液中来进行水解反应。几种蛋白水解酶适用于本发明的方法。在优选实施方案中，蛋白水解酶将为食品级酶，在约5至约7的pH和约40℃至约65℃的温度下具有内肽酶或外肽酶活性。在特别优选的实施方案中，蛋白水解酶将为食品级酶，在约6至约6.5的pH和约50℃至约60℃的温度下具有内肽酶或外肽酶活性。
在一个实施方案中，内肽酶将为属于EC 3.4.21的食品级丝氨酸蛋白酶。在该实施方案的一个替代方案中，丝氨酸蛋白酶为糜蛋白酶。在该实施方案的还一个替代方案中，丝氨酸蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶。在另一个实施方案中，内肽酶将为属于EC 3.4.22的食品级半胱氨酸蛋白酶。在还一个实施方案中，内肽酶将为属于EC 3.4.23的食品级天冬氨酸蛋白酶。在另外的实施方案中，内肽酶将为属于EC 3.4.24的食品级金属蛋白酶。可用于本发明方法的食品级内肽酶的示例性非限制性例子包括ValidaseAFP、ValidaseFP 500、碱性蛋白酶浓缩物、ValidaseTSP、Enzeco菠萝蛋白酶浓缩物、Corolase7089、木瓜蛋白酶600L和不含亚硫酸盐的Validase木瓜蛋白酶浓缩物。
在其它实施方案中，外肽酶将为属于EC 3.4.11的食品级氨肽酶。在另一个实施方案中，外肽酶将为属于EC 3.4.13的食品级二肽酶。在还一个实施方案中，外肽酶将为属于EC 3.4.14的食品级肽基二肽酶或三肽酶。在另一个实施方案中，外肽酶将为属于EC 3.4.15的食品级肽基二肽酶。在另外的实施方案中，外肽酶将为属于EC 3.4.16的食品级丝氨酸型羧肽酶。在还一个实施方案中，外肽酶将为属于EC 3.4.17的食品级金属羧肽酶。在另外的实施方案中，外肽酶将为属于EC 3.4.18的食品级半胱氨酸型羧肽酶。在还一个实施方案中，外肽酶将为属于EC 3.4.19的食品级ω肽酶。可用于本发明方法的食品级外肽酶的示例性例子包括ValidaseFP II或Corolase LAP。
可用于本发明方法的食品级水解酶的另一个例子是ValidaseFP浓缩物。其它合适的食品级蛋白水解酶的例子示于表A中。
表A
典型地，将组合使用内肽酶和外肽酶来催化水解反应。通过考虑酶的蛋白酶活性和选择将最大地裂解明胶原材料中肽键的酶，来优选蛋白水解酶。在优选实施方案中，首先将优先具有内肽酶活性的酶添加到明胶溶液中，以形成经内肽酶消化的明胶产物。然后使经内肽酶消化的明胶产物与优先具有外肽酶活性的酶接触，而不会使内肽酶失活。还预期在某些实施方案中，可以在添加具有内肽酶活性的酶之前或同时添加具有外肽酶活性的酶。
在一个优选实施方案中，内肽酶选自Corolase7089、ValidaseAFP、ValidaseFP 500、碱性蛋白酶浓缩物、ValidaseTSP、Enzeco菠萝蛋白酶浓缩物、木瓜蛋白酶600L和不含亚硫酸盐的Validase木瓜蛋白酶浓缩物；外肽酶为ValidaseFP II或CorolaseLAP。在还一个实施方案中，内肽酶选自Corolase7089、Enzeco菠萝蛋白酶浓缩物和木瓜蛋白酶6000L；外肽酶选自ValidaseFP II和CorolaseLAP。在优选实施方案中，按照下列顺序，将各种蛋白水解酶依次添加到明胶原材料中：Corolase7089、Enzeco菠萝蛋白酶浓缩物、木瓜蛋白酶6000L、ValidaseFPII和CorolaseLAP。在该实施方案的一个替代方案中，各蛋白水解酶将明胶原材料消化约0.5至约2小时，然后添加后续的蛋白水解酶。
添加到水解反应中的蛋白水解酶的量能够并且将根据所需的明胶水解程度和水解反应持续时间而变化。通常，对于持续时间为约5小时至约24小时的水解反应，添加约0.025％至约0.15％(w/w)具有内肽酶活性的蛋白水解酶和约0.025％至约0.15％(w/w)具有外肽酶活性的蛋白水解酶。在优选实施方案中，将约0.05％至约0.15％(w/w)Corolase7089、约0.025％至约0.075％(w/w)Enzeco菠萝蛋白酶浓缩物、约0.05％至约0.15％(w/w)木瓜蛋白酶6000L、约0.025％至约0.075％(w/w)ValidaseFPII和约0.05％至约0.15％(w/w)CorolaseLAP添加到明胶原材料中。
水解反应将典型地进行高至约24小时。典型地，在约24小时后，从颜色和气味的角度，明胶水解产物的质量将开始显著减少。在另一个实施方案中，水解反应将进行约1小时至约24小时。在还一个实施方案中，水解反应将进行约3小时至约15小时。在还更优选的实施方案中，水解反应将进行约5小时至约12小时。在这段时间内，易于获得高度经济的加工条件和稳定的明胶水解产物质量。在水解反应结束时，可以将经水解的明胶溶液加热到约90℃，以使蛋白水解酶失活。可能需要额外的步骤来使半胱氨酸蛋白酶失活。如果需要这样做，可以添加过氧化氢或其它氧化剂，通常不超过1000ppm。然后可以通过本领域公知的任何方式，例如微量过滤，从水解溶液中纯化明胶水解产物。
典型地，在本发明方法中明胶原材料的水解程度(DH)大于约13％。在某些实施方案中，DH为约10％至约20％。在其它实施方案中，DH为约20％至约30％。在另一个实施方案中，DH为约30％至约40％。在还一个实施方案中，DH为约40％至约50％。在另一个实施方案中，DH为约50％至约60％。在另外的实施方案中，DH为约60％至约70％。在还另外的实施方案中，DH为约70％至约80％。在还一个实施方案中，DH为约80％至约90％。在还一个实施方案中，DH大于约90％。DH是明胶原材料中已经被蛋白水解酶水解的肽键总数的百分比。可以通过本领域公知的方法计算DH，例如根据Adler-Nissen法(19)。
已经观察到，具有较低平均分子量的明胶水解产物在防止交联过程方面更有效。结果是，可以减少明胶剂型中的水解产物量，从而优化成本。
II.明胶水解产物
本发明的还一个方面包括由本发明方法制备的明胶水解产物。一般来说，与明胶原材料相比，明胶水解产物将包括不同长度的肽的混合物，其中游离甘氨酸、其它氨基酸和小肽的量增加。与明胶原材料相比，明胶水解产物还将具有较低的平均分子量和较高的伯胺含量。
明胶水解产物的平均分子量将典型地为至少约100Da。在其它实施方案中，明胶水解产物的平均分子量将典型地不超过约2000Da。在一些实施方案中，明胶水解产物的平均分子量将为约100Da至约2,000Da。在其它实施方案中，明胶水解产物的平均分子量将为约700Da至约1800Da。在另一个实施方案中，明胶水解产物的平均分子量将为约700Da至约1500Da。在还另外的实施方案中，明胶水解产物的平均分子量将为约800Da至约1200Da。
平均分子量为按电喷雾离子化液相色谱质谱(ESI-LC/MS)测量的明胶水解产物重量。例如，平均分子量为约1200Da的明胶水解产物的分子量范围可以为约75Da至约8000Da。
通常，明胶水解产物的平均伯胺含量将不小于约1.0×10-3μMol/μg明胶水解产物。在另一个实施方案中，明胶水解产物的平均伯胺含量将不小于约1.5×10-3μMol/μg明胶水解产物。在还一个实施方案中，明胶水解产物的平均伯胺含量将不小于约2.0×10-3μMol/μg明胶水解产物。在另外的实施方案中，明胶水解产物的平均伯胺含量将为约1.0×10-3至约1.0×10-2μMol/μg明胶水解产物。通过衍生和随后的UV吸收(6-8)测量明胶水解产物的伯胺含量，如实施例所示。
本发明的明胶水解产物包括多肽，多肽长度典型地为高至约75个氨基酸，优选长度为高至50个氨基酸。在一个实施方案中，明胶水解产物所含的平均多肽长度为约6至约18个氨基酸。在另一个实施方案中，本发明明胶水解产物所含的平均多肽长度为约9至约20个氨基酸。可以通过尺寸排阻色谱/高效液相色谱(SEC/HPLC)间接确定多肽链的长度。
在一个实施方案中，明胶水解产物的平均分子量将为约100Da至约2,000Da，平均伯胺含量将为约1.0×10-3至约1.0×10-2μMol/μg明胶水解产物，平均多肽长度将高至约20个氨基酸。在还一个实施方案中，明胶水解产物的平均分子量将为约700Da至约1500Da，平均伯胺含量将为约1.0×10-3至约2.0×10-3μMol/μg明胶水解产物，平均多肽长度将高至约18个氨基酸。在另一个实施方案中，明胶水解产物的平均分子量将为约800Da至约1200Da，平均伯胺含量将为约1.0×10-3至约2.0×10-3μMol/μg明胶水解产物，平均多肽长度将为约4至约18个氨基酸。
III.明胶组合物
本发明的另一个方面包括含有低分子量明胶水解产物和明胶的明胶组合物。令人惊讶地发现，当低分子量的明胶水解产物与较高分子量的明胶掺混时，通过增加掺混明胶产物中游离甘氨酸、其它氨基酸和小肽的量，该水解产物可以减少明胶的交联并改进溶解性质，如实施例所示。
许多不同的明胶水解产物适用于所述明胶组合物。在一个实施方案中，明胶水解产物将为酶消化的水解产物。作为非限制性例子，通过酶水解程序制备本发明的明胶水解产物，如上面的详述。在另一个实施方案中，明胶水解产物将为经酸消化的水解产物。例如，在约110℃的反应温度下，通过用约6N的盐酸将明胶原材料消化约24小时，可以进行酸性水解。在还一个实施方案中，明胶水解产物将为经碱消化的水解产物。作为非限制性例子，通过用强碱如氢氧化钠消化明胶原材料，可以进行碱水解。酸和碱水解将典型地导致包含游离氨基酸的水解产物。在各实施方案中(即酶、酸和碱水解)，在上面的部分I中详细描述了合适的明胶原材料，其中描绘了要用于本发明方法的明胶原材料的结构和功能性质。
典型地，明胶水解产物将具有低分子量。在一个实施方案中，平均分子量将为约400Da至约2000Da。在另一个实施方案中，平均分子量将为约700Da至约1500Da。此外，明胶水解产物的平均伯胺含量范围还将为约1.0×10-3至约1.0×10-2μMol伯胺/μg明胶水解产物。
在另一个实施方案中，平均伯胺含量范围可以为约1.0×10-3至约2.0×10-3μMol伯胺/μg明胶水解产物。
在还一个实施方案中，平均伯胺含量范围可以为约2.0×10-3至约4.0×10-3μMol伯胺/μg明胶水解产物。在另一个实施方案中，平均伯胺含量范围可以为约4.0×10-3至约6.0×10-3μMol伯胺/μg明胶水解产物。在还另外的实施方案中，平均伯胺含量范围可以为约6.0×10-3至约1.0×10-2μMol伯胺/μg明胶水解产物。
明胶水解产物的平均多肽链长通常还将为约4至约50个氨基酸。在一个实施方案中，明胶水解产物包括的平均多肽长度高至约30个氨基酸。在另一个实施方案中，明胶水解产物包括的平均多肽长度为约9至约20个氨基酸。按照部分II的详述确定平均分子量、平均伯胺含量和平均多肽链长。
在优选实施方案中，组合物所用的明胶水解产物将为部分II详述的本发明水解产物。可以用于组合物的其它示例明胶水解产物的例子描绘于表B。也可以使用上述明胶水解产物的混合物。
表B
明胶水解产物可以与具有广泛物理和功能性质的几类明胶掺混。对具体明胶的选择能够并将根据明胶组合物的预期用途而显著变化。一般来说，无论实施方案或预期用途如何，明胶都典型地源自胶原或富含胶原的组织，它们获自几种适当的原料如来自动物的皮肤和骨头。在一个实施方案中，明胶为A型明胶。在另一个实施方案中，明胶为B型明胶。在还一个实施方案中，明胶为A型和B型明胶的混合物。此外，可以用在酶解过程中制备的明胶代替A型和/或B型明胶。
无论实施方案如何，明胶都将优选包含约80wt％至约90wt％蛋白质、约0.1wt％至约2wt％矿盐(灰分含量)和约10wt％至约15wt％水。
明胶将典型地具有高平均分子量。在一个实施方案中，明胶的平均分子量将大于约200,000Da。在另一个实施方案中，明胶的平均分子量将大于约150,000Da。在还一个实施方案中，明胶的平均分子量将为约100,000Da至约200,000Da。
在一个实施方案中，明胶的胶凝强度将为约50至约300，pH将为约3.8至约7.5，等电点将为约4.7至约9.0，粘度将为约15至约75mP，灰分将为约0.1至约2.0％。
在替代实施方案中，当明胶基本上为A型明胶时，胶凝强度将为约50至约300，pH将为约3.8至约5.5，等电点将为约7.0至约10.0，粘度将为约15至约75mP，灰分将为约0.1至约2.0％。
在替代实施方案中，当明胶基本上为B型明胶时，胶凝强度将为约50至约300，pH将为约5.0至约7.5，等电点将为约4.8至约5.8，粘度将为约20至约75mP，灰分将为约0.5至约2.0％。
在一个优选实施方案中，当明胶组合物用于制造硬胶囊药物产品时，明胶的胶凝强度将为约200至约300，粘度将为约40至约60mP，pH将为约4.5至约6.5。
在还一个优选实施方案中，当明胶组合物用于制造软壳胶囊药物产品时，明胶的胶凝强度将为约125至约200，粘度将为约25至约45mP，pH将为约4.5至约6.5。
本发明的明胶组合物通常将包括约1wt％至约20wt％明胶水解产物和约80wt％至约99wt％明胶。在另一个实施方案中，明胶组合物将包括约1wt％至约5wt％明胶水解产物和约95wt％至约99wt％明胶。在还一个实施方案中，明胶组合物将包括约5wt％至约10wt％明胶水解产物和约90wt％至约95wt％明胶。在另一个实施方案中，明胶组合物将包括约10wt％至约15wt％明胶水解产物和约85wt％至约90wt％明胶。在另外的实施方案中，明胶组合物将包括约15wt％至约20wt％明胶水解产物和约80wt％至约85wt％明胶。在典型的实施方案中，明胶组合物将包括比率为约1∶4至约1∶99(w/w)的明胶水解产物和明胶。
在优选实施方案中，明胶组合物将包括本发明的明胶水解产物和较高分子量的药用级明胶。在一个实施方案中，明胶组合物将包括约5wt％至约10wt％明胶水解产物和约90wt％至约95wt％药用级明胶。在另一个实施方案中，明胶组合物将包括约10wt％至约15wt％明胶水解产物和约85wt％至约90wt％药用级明胶。
有益地，按照涡旋硬化测试和粘度测试，本发明和本实施方案的明胶组合物典型地具有减少的交联。本实施方案的明胶组合物的涡旋硬化时间典型地为约200至约300秒。在另一个实施方案中，涡旋硬化时间大于约300秒。用于确定涡旋硬化时间的程序描述于实施例中。该实施方案的明胶组合物的平均初始粘度还典型地为约10至约15cP，在约60℃的反应温度下，在约两小时内，在向明胶组合物中添加少于约0.5wt％的[2-(4-二甲基-氨基甲酰基-吡啶并)-乙烷-1-磺酸盐](H.W.Sands Corporation的OB1207)后，明胶组合物的平均粘度为约15至约50cP。用于测量粘度的程序描述于实施例中。
在一个实施方案中，可以将甘氨酸作为独立的化合物添加到本发明的明胶组合物中。可以将约0.5wt％至约5wt％甘氨酸添加到明胶组合物中。在更典型的实施方案中，甘氨酸的量将为约1.5wt％至约2.5wt％。在还一个实施方案中，可以将柠檬酸添加到明胶组合物中。柠檬酸的添加量可以为约0.5wt％至约5wt％。在更典型的实施方案中，将约0.5％至约1.5％柠檬酸添加到明胶组合物中。
本发明的明胶组合物可以用于几种应用，包括作为食品成分、作为化妆品成分和作为照相成分。因为明胶组合物的交联趋势减少并且溶解性质得到改善，所以在优选实施方案中，使用所述明胶组合物制造药物产品。
在一个优选实施方案中，所述明胶组合物用于制造硬明胶胶囊。如上详述，当明胶组合物用于制造硬胶囊药物产品时，明胶的胶凝强度将为约200至约300，粘度将为约40至约60mP，pH将为约4.5至约6.5。典型的硬明胶胶囊剂型将包括约30wt％本发明的明胶组合物、约65wt％水、约5wt％合适的染料，并且在需要时将包含颜料。可以根据本领域公知的任何方法制备硬明胶胶囊。
在还一个实施方案中，明胶组合物用于制造软明胶胶囊。如上详述，当明胶组合物用于制造软壳胶囊药物产品时，明胶的胶凝强度将为约125至约200，粘度将为约25至约45mP，pH将为约4.5至约6.5。典型的软明胶胶囊剂型将包括约40wt％至约45wt％本发明的明胶组合物、约15wt％至约35wt％增塑剂和约20wt％至约45wt％水。可以根据本领域公知的任何方法制备软明胶胶囊。增塑剂的典型例子为甘油(通常以85wt％水溶液的形式使用)和山梨醇(通常以70wt％水溶液的形式使用)及其混合物。
本申请引用的所用出版物、专利、专利申请和其它参考文献均被全文纳入本文以供参考，如同每个单独的公开、专利、专利申请或其它参考文献被具体和单独的声明纳入以供参考。
定义
“两性物”指性质能够为阳离子性和阴离子性两者的物质，例如蛋白质。
“胶凝值”是按克测量的凝胶坚固程度。胶凝值是限定形式和尺寸的冲头渗入6.7wt％明胶溶液表面内4mm深处所需的力。市售明胶的胶凝值为80至280。
“骨头屑”指切碎、脱脂并干燥的骨头，然后软化(参见浸渍)，从中制得明胶。
“交联”指例如在药物软胶囊上形成薄皮的机理。典型地，交联会减少胶囊的溶解性质。
“Da”是道尔顿的简写。
“EC”是酶分类的简写。它典型地用作酶数字命名的前缀。
“内肽酶”是典型地属于EC 3.4子类、即肽水解酶的酶，它水解低聚肽或多肽的非末端肽联接，包括任何酶子类EC 3.4.21-99。
“外肽酶”是子类EC 3.4内的一组肽水解酶，它催化与低聚肽或多肽的末端氨基或羧基相邻的肽键水解。该组典型地包括酶子类3.4.11-3.4.19。
“食品级酶”是典型地不含基因改性的有机体的酶，在被有机体如人类消费时是安全的。典型地，根据可应用的FDA指导原则制备该酶及酶的来源产品。
“硬胶囊”是由添加或不添加染料的纯明胶制成的各种尺寸的中空胶囊。它们包括上部和下部；一旦完成填充，上部和下部就结合到一起。
“速溶明胶”是能够在冷水中溶胀的明胶粉末。
“微凝胶”被认为是分子量大于300,000Da的明胶。
“硬蛋白”是在体内提供支撑功能的那些蛋白质。它们不溶于水并具有纤维性结构。这些蛋白质包括例如存在于毛发和指甲中的角蛋白、存在于支撑和连接组织、皮肤、骨头和软骨中的弹性蛋白和胶原。
“软胶囊”是由明胶制成的弹性胶囊，用于填充活性成分/赋形剂混合物。它们能制成不同的壁厚，具有或没有接缝。
“Split”是明胶原料；是牛皮连接组织的中层。
“三股螺旋”是由3种蛋白质链组成的胶原基础结构。这些蛋白质通常具有稍微不同的氨基酸序列。
“A型明胶”是经酸消化的明胶。
“B型明胶”是经碱(碱性)消化的明胶。
“LBSH型”是通过蛋白水解消化明胶制备的本发明石灰鞣骨水解产物。
“LHSH型”是通过蛋白水解消化明胶制备的本发明石灰鞣革水解产物。
由于在不背离本发明范围的情况下，可以对上述化合物、产品和方法进行各种变化，所以希望上面描述和下列实施例中包含的所有内容均应理解为说明而非限制。
实施例
下列实施例说明了本发明。
实施例1
可以根据下列方法制备本发明的明胶水解产物。向1.0kg去离子化处理的明胶中加入1.94kg水，制备包含34wt％明胶的溶液(石灰鞣骨明胶B型，胶凝强度＝100)。将明胶水化1小时，然后放到55℃的水浴中以溶解。一旦完全溶解，就用氢氧化钠水溶液将明胶溶液的pH调整到6.0-6.5。按溶液中明胶的量计(CDG市售干明胶(含湿量为约10wt％)，本程序中的所有添加均基于该量)，将0.037％w/w氯化钙添加到明胶溶液中。为了测试溶液的氧化还原态，取出等份量并稀释成5wt％。使用过氧化物测试条(EM Science)快速测量过氧化物的量。如果存在过氧化物，则以0.5ml的增量添加Fermcolase1000F(GenencorInternational Inc.)。在每次添加后，将溶液放置反应30分钟，然后重复过氧化物测量。重复添加Fermcolase1000F，直至过氧化物水平接近零。
将0.1％w/w Corolase7089(AB Enzymes)添加到溶液中。在接近1小时反应时间的末尾，在添加下一种酶之前，取出少量样品并分析分子量。对于每次酶添加重复该过程。在1小时的反应时间后，添加0.05％w/w Enzeco菠萝蛋白酶浓缩物(Enzyme Development Corp.)，使溶液再反应1小时。然后添加0.1％w/w液体木瓜蛋白酶6000L(ValleyResearch)。在1小时后，向溶液中添加0.05％w/w ValidaseFPII(ValleyResearch)，再反应1小时。最后添加的酶是0.1％w/w CorolaseLAP(ABEnzymes)。在1小时后，将溶液加热到90℃，以使剩余的功能酶失活。在一些情况下，额外添加30-40ppm过氧化氢，以确保木瓜蛋白酶6000L失活。在加热失活后看不到酶活性的证据。表1给出了在水解过程中所用的五种酶的细节摘要。
表1
将在该实施例中获得的明胶水解产物用作下列实施例中的LHSH型水解产物。确定平均分子量为约1500Da。
实施例2
使用下列程序来定量各种明胶组合物的交联减少程度。在对照实验中，将10.0±0.1g明胶添加到250ml烧杯中，向其中添加90.0±0.5g去离子水。将表面皿放到烧杯上，使明胶溶胀30-60分钟。将溶胀的明胶在60±0.1℃的水浴中放置15-30分钟，或者直至所有明胶溶解。将磁力搅拌棒放到明胶溶液中，在搅拌盘上，用稀NaOH或H2SO4将pH调整到7.00±0.05，然后除去磁力搅拌棒。将溶液在40±0.1℃的水浴中放置15-60分钟以冷却。使用装配有4叶混合器的数字搅拌机(Heidolph Brinkman 2102)，以产生750±10RPM的涡旋。随即，添加20±0.5ml pH 7磷酸盐缓冲的10％福尔马林溶液(Fisher Scientific)。将涡旋硬化时间(秒)记录为当交联的明胶溶液沉淀到4叶混合器柄上时的时间。
在涉及包含添加剂的明胶组合物的实验中，用所需添加剂代替明胶的百分比(例如10％添加水解产物的样品包含9.0g明胶和1.0g水解产物)。相信具有较长涡旋硬化时间的明胶具有减少的甲醛诱导交联趋势。
如表2所示，涡旋硬化测试证实了前面的发现，即甘氨酸与柠檬酸的组合能够减少明胶交联的量。更重要地，单独添加甘氨酸对这种特定石灰鞣骨明胶样品的涡旋硬化时间具有显著影响。添加柠檬酸盐不能减少交联。
惊讶地，在该特定样品中，添加1.5％柠檬酸盐会促进交联。这些结果可以用于支持甘氨酸在该模型体系中作为醛清除剂的地位。不能容易地解释对仅包含柠檬酸盐的样品之一所经历的交联损害影响。
涡旋硬化测试在本文中用作分析工具，来迅速筛选添加剂对明胶组合物的交联行为的影响。
表2
图1详述了添加按照与实施例1相似的过程获得的石灰鞣革明胶水解产物LHSH型水解产物(MW～1200Da)、和BH-3型明胶水解产物(MW～2200Da)对LH-1的影响，LH-1是典型的石灰鞣革明胶，其胶凝强度为260g，6.67％粘度为45mP。术语“6.67％粘度”用作以6.67％CDG水溶液观察到的粘度的简写。结果显示对于所添加的两种水解产物，涡旋硬化时间均增加。然而，在添加本发明水解产物LHSH型的情况下，效果更好。几种皮革明胶展示出以前仅在6.67％粘度接近60mP的石灰鞣骨明胶中见到的这种非常迅速的交联。
表3显示几种灰石鞣革明胶的涡旋硬化时间与不同分子量性质的关系。不能推导出结论性的趋势，除了微凝胶百分比和粘度的增加可能与交联增加和随后的涡旋硬化时间减少有关。
表3
表4显示将10％实施例1的LBSH型水解产物(平均MW＝1500)、BB-4型明胶水解产物和甘氨酸添加到高粘度石灰鞣骨明胶中的结果，该明胶的胶凝强度为240g，6.67％粘度为64mP。这种高粘度提取物具有与一些极低粘度的石灰鞣革明胶相似的交联性质。当所有三种添加剂都存在的情况下，这种明胶显示出交联显著减少。然而，与BB-4型相比，LBSH型水解产物可将涡旋硬化时间增加近30％。甘氨酸显示出最大的交联减少和随后最大的涡旋硬化时间增加，如表4所示。
表4
表5显示通过涡旋硬化测试测量的实验结果，该实验试图确定当添加到中等粘度的石灰鞣骨药用明胶中(胶凝强度＝244，6.67％粘度＝47.0TnP)时，匹配甘氨酸性能所需的低分子量水解产物量。结果暗示需要4-5％LBSH型来匹配2.5％甘氨酸的性能，而需要5-6％BB-4型。类似地，需要10％LBSH型和11-12％BB-4型来匹配由5.0％甘氨酸获得的交联减少。
表5
实施例3
从H.W.Sands Corporation获得明胶硬化剂OB1207[2-(4-二甲基氨基甲酰基-吡啶并)-乙烷-1-磺酸盐]。在照相乳液中，OB1207已经被吹捧为甲醛的替代物。反应1描述了OB1207与明胶的交联。通过与OB1207的反应，在明胶链之间形成酰胺和酯键可以近似地模仿在如下明胶样品中见到的交联类型，由于暴露于极端的高热和高湿，所述样品已经老化和/或受压。
反应1(gelatine：明胶)
在对照实验中，将15.0±0.1g明胶(石灰鞣骨明胶B型，胶凝强度＝200)添加到250ml烧瓶中。向其中添加95.0±0.5g去离子水，添加磁力搅拌棒。用石蜡膜盖住明胶，使其溶胀30-60分钟。将烧瓶在60±1.0℃的水浴中放置15-20分钟，或者直至所有明胶溶解。使用BrookfieldDV-III+流变仪，在50RPM和60.0±0.1℃测量该溶液的粘度。在搅拌盘上搅拌的同时，将由0.30g OB1207溶于10.0g去离子水制得的溶液缓慢添加到烧瓶内的明胶中。将烧瓶放回水浴中。2小时后测量溶液的粘度。在包含水解产物添加剂的实验中，用所需水解产物代替对照明胶的百分比(即10％添加水解产物的样品包含13.5g明胶和1.5g水解产物)。
表6给出了在与OB1207交联后，具有中等胶凝强度和粘度的明胶(LB-1)的粘度实验结果。对照A LB-1没有添加水解产物或OB1207，而对照BLB-1不包含水解产物，但用OB1207交联过。两小时后，对照B太粘而不能在Brookfield流变仪上读数，这暗示非常高的交联程度。包含水解产物的样品显示交联程度减少，其中本发明的水解产物LBSH型获得了最佳结果，尤其在10％的水平下。
表6
实施例4
下列程序用于确定明胶水解产物中的伯胺含量。Alder-Nissen描述了使用三硝基苯磺酸(TNBS)来测量伯胺的量(6)。使用该程序的改良版本来测量明胶水解产物中的伯胺相对量。反应2示意用TNBS衍生伯胺。
反应2(protein：蛋白质)
将2.000±0.002g甘氨酸(Acros)添加到250ml烧杯中，使用1％十二烷基硫酸钠(“SDS”，Aldrich)溶液使重量达到200.00±0.01g(该甘氨酸溶液称为G-1)。将4.000±0.002g明胶水解产物添加到250ml烧杯中，使用1％SDS溶液使重量达到100.00±0.01g(该水解产物溶液称为H-1)。将包含G-1和H-1溶液的烧杯放置到电热板上，加热到80-85℃的温度，以完全溶解和分散固体。将溶液冷却到室温，然后将1.00g G-1添加到250ml烧杯中，使用1％SDS溶液使重量达到200.00±0.01g(G-2)。通过分别添加50、37.5、25、12.5、5和0.5ml G-2，在50ml容量瓶中制备G-2的稀释液(G-3标准液)。通过使用1％SDS溶液，将烧瓶稀释至刻度。在250ml烧杯中，通过添加1.00g H-1并使用1％SDS溶液使其重量达到200.00±0.01g，将H-1溶液稀释以产生H-2。向15ml试管中添加2ml 0.2125M磷酸盐缓冲液(通过将0.2125M NaH2PO4添加到0.2125M Na2HPO4中，直至达到pH 8.20±0.02而制得)和250μl G-3标准液。这相当于六个标准甘氨酸基准，每个样品分别包含0.1667、0.1250、0.0833、0.0417、0.0167和0.0017μmole伯胺。类似地，将250μl各H-2溶液与2ml磷酸盐缓冲液添加到15ml试管中(相当于50μg样品)。通过将250μl 1％SDS溶液和2ml缓冲液添加到15ml试管中，制备对照样品。通过将170±2μl 1M TNBS溶液(Sigma)添加到50ml容量瓶中，用去离子水稀释至刻度，立即用铝箔盖住(因为TNBS对光敏感)，来制备0.1％三硝基苯溶液。
下列所有步骤均在照相暗室中进行。向试管中添加2ml 1％TNBS溶液。然后将试管涡旋(Fisher Scientific Vortexgenie 2)5秒。然后将样品在50.0±0.1℃的水浴中放置30分钟。然后将样品再涡旋5秒，再在水浴中放置30分钟。从水浴中取出样品，添加4ml 0.100N HCl溶液以终止TNBS反应。将溶液涡旋5秒，冷却10分钟(较长的冷却可能导致由SDS所致的混浊)。以水为空白，在340nm(Beckman DU-7分光光度计)处读取各样品的吸光度。通过使用甘氨酸标准液的吸光度线性回归计算，计算样品中的伯胺量。
Church等人描述了用邻苯二甲醛(OPA)衍生伯胺来测量牛奶蛋白的蛋白水解(7)。Nielsen等人(8)使用OPA来测量其他食品蛋白、包括明胶蛋白的水解程度。Nielsen方法的优点是用更环境友好的二硫苏糖醇(DTT-Cleland试剂)代替β-硫基乙醇作为含硫还原剂。本程序改编自Nielson等人的工作。反应3示意在DTT存在的情况下，伯胺与OPA的反应。
反应3(protein：蛋白质)
通过将7.620g四硼酸钠十水合物(Fisher Scientific)和200mg SDS添加到200ml容量瓶中，制备OPA试剂。添加约150ml去离子水，搅拌溶液直至完全溶解。将160mg OPA(Aldrich)溶于4ml乙醇(FisherScientific)中，使用去离子水定量转移至容量瓶中。添加176mgDTT(Aldrich)，用去离子水将全部溶液稀释到体积。通过将50mg甘氨酸添加到500ml容量瓶中并用去离子水稀释至刻度，产生甘氨酸标准液。通过将100、75、50、25和5ml甘氨酸溶液添加到100ml容量瓶中并用去离子水填充至刻度，制备稀释液，从而产生5个甘氨酸标准液。通过将0.500g水解产物添加到100ml容量瓶中并添加去离子水至刻度，制备明胶水解产物样品。向另一个100ml容量瓶中添加10ml水解产物溶液并用去离子水填充至刻度。向15ml试管中添加3.0ml OPA试剂溶液，然后添加400μl甘氨酸标准液(得到40、30、20、10和2μg甘氨酸)或明胶水解产物样品(200μg水解产物)。还使用400μL水作为对照样品来测量单独OPA的吸光度。将样品涡旋5秒。在添加样品后恰好2分钟时，相对于水空白读取吸光度。偏离2分钟的要求会显著影响吸光度。然后以两分钟的间隔测定各样品或标准液。通过使用甘氨酸标准液的吸光度线性回归计算来计算样品中的伯胺量。
表7和表8显示在6种明胶水解产物、第一提取明胶、甘氨酸三聚体和赖氨酸单体中，TNBS和OPA对伯胺的衍生结果。将水解程度报告为伯胺量除以HCl水解样品(6N HCl 24小时，110℃)的伯胺数目。TNBS和OPA衍生物的分子量是每个样品量中伯胺量的倒数。认为TNBS和OPA衍生物的分子量仅仅是定性的，真正的显著性是各样品中的伯胺测得量。伯胺衍生物的分子量不考虑赖氨酸和羟基赖氨酸的双衍生，也不考虑如下事实，即仲胺没有被任一衍生试剂衍生。然而，当假设这些因素对所有明胶水解产物相对稳定时，伯胺衍生物的分子量可用于比较各种不同明胶水解产物类型的相对水解程度。与其他酶消化的水解产物相比，显示LBSH型和LHSH型，即本发明的石灰鞣骨和石灰鞣革水解产物的伯胺平均增加近30-130％。还给出了由SEC/HPLC方法测得的平均分子量。要注意赖氨酸和甘氨酸三聚体的分子量距离已知分子量值很远。TNBS和OPA衍生物的分子量还非常相似于HCl水解明胶样品的期望值，尽管HPLC/SEC数据几乎为该量的5倍。这证明通常用于测量明胶水解产物分子量的低分子量SEC/HPLC方法的相对不精确性。明胶并不考虑TNBS和OPA衍生物的分子量。明胶大分子的络合物阻止使用这种简化模型来精确描绘分子量。与用TNBS衍生相比，证实OPA衍生是用于测量伯胺含量的更可靠方法。
表7
表8
参考文献
在为本文所列内容提供示例的、程序的或其他细节补充的范围内，本申请上文或下列参考文献列表中引用的所有参考文献均被明确纳入本文以供参考，如同每个单独的公开或专利申请被具体和单独地声明纳入本文以供参考。
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机译： 制备低分子量明胶水解产物和明胶水解产物组合物的方法
机译： 制备低分子量明胶水解产物和明胶水解产物组合物的方法
机译： 低分子量明胶水解产物的制备方法和明胶水解产物组合物
