寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物及其用于治疗肿瘤的方法

摘要

这个发明提供了寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物及其用于治疗肿瘤的方法。肿瘤细胞裂解物是各种肿瘤细胞的裂解物。肿瘤细胞的来源可以是自体肿瘤细胞，同种异体肿瘤细胞和各种肿瘤细胞系细胞。寡核苷酸包括但不限于含CpG的寡核苷酸。寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物对在应用于个体后对相应的肿瘤有治疗作用。

说明书

技术领域

(TECHNICAL FIELD)

这个发明提供了寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物，这种裂解物在应用于个体后可通过激发抗肿瘤的免疫应答(anti-tumor immune resposes)治疗肿瘤。

发明背景(BACKGROUND)

肿瘤的治疗有手术治疗、放射治疗、化学药物治疗(化疗)以及其它的治疗(Harold Varmus.The NewEra in Cancer Research，Science，2006，Vol，312：1162-1165)。

研究表明，肿瘤细胞不能被个体的免疫系统清除的一个主要原因是肿瘤细胞起源于个体自身的细胞因而具有弱免疫原性(poorly immunogenic)。在本发明中，将可以增强肿瘤细胞免疫原性(immunogenicity)的肿瘤细胞裂解物和寡核苷酸混合后制成寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物，这种裂解物在应用于个体后可以激发有效的抗肿瘤免疫应答，使个体中发生的相应的肿瘤细胞受到抑制或清除。

在本发明中，癌症(cancer)和肿瘤(tumor)是可以互换应用并表达同样含义的术语。肿瘤可被分为原发肿瘤(primary cancers)和继发或转移肿瘤(secondary or metastatic cancers)。原发肿瘤和继发或转移肿瘤细胞可以被用来制备相应的肿瘤细胞裂解物。将原发肿瘤和继发或转移肿瘤细胞在体外培养，可获得肿瘤细胞系(tumor cell line)细胞。这些肿瘤细胞系细胞也可以被用来制备肿瘤细胞裂解物。用于制备肿瘤细胞裂解物的细胞可以是自体的(autologous)，也可以是同种异体的(allogenic)肿瘤细胞。这些肿瘤细胞裂解物含有各种各样的肿瘤抗原(tumor antigen)。

研究发现，含CpG的寡核苷酸(CpG containing oligonucleotide，CpG ODN)在被个体免疫系统识别后可表现强烈的免疫刺激活性(immunostimulatory properties)，激发天然免疫(innate immunity)和获得性免疫应答(adaptive immune response)。将CpG ODN和肿瘤细胞裂解物混合可制备出新型的抗肿瘤制剂(novel agent)或高效疫苗(highly effective vaccine)。

发明的简要说明(SUMMARY OF THE INVENTION)：

本发明提供了一种寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物，它由肿瘤细胞裂解物和寡核苷酸混合组成。此组合物可含有一种或一种以上的肿瘤细胞裂解物，也可含一种或一种以上的寡核苷酸。

本发明提供的寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物在应用于个体后可诱发抗肿瘤免疫，治疗相应的肿瘤。被治疗的肿瘤包括原发、继发、转移的肿瘤。

肿瘤细胞裂解物可从自体或同种异体的原发、继发、转移肿瘤的细胞或其肿瘤细胞系细胞制备。在制备肿瘤细胞裂解物之前，这些肿瘤细胞可经基因修饰。

用于制备寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物的寡核苷酸包括但不限于含CpG的寡核苷酸，这些寡核苷酸可以被化学修饰。

本发明提供的寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物可以单独或作为主要成分形成各种药物组合物或剂型(pharmaceutical composition)后应用于个体。

个体(subject或individual)是人或动物。

寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物的应用剂量是治疗有效剂量(therapeutically effective amount)。

在治疗肿瘤时，本发明提供的寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物可以自身组合应用，或和其它一种或几种抗肿瘤制剂联合应用。

本发明提供的寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物可经皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、淋巴结内注射、肿瘤内注射和肿瘤旁注射等途径应用。

图表的简要叙述(BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS)：

表-1、寡核苷酸增强的肿瘤细胞(黑色素瘤细胞)裂解物对黑色瘤出瘤率的影响

表-2、寡核苷酸增强的肿瘤细胞(Lewis肺癌细胞)裂解物对荷Lewis肺癌细胞瘤小鼠生长的抑制作用

表3、寡核苷酸增强的肿瘤细胞(EL4细胞)裂解物的对EL4细胞成瘤率的影响

表-4、寡核苷酸增强的肿瘤细胞(GL26细胞)裂解物对荷GL26细胞细胞瘤小鼠生存时间的影响

表-5、寡核苷酸增强的肿瘤细胞(C1498细胞)裂解物对荷C1498细胞小鼠生存时间的影响

表-6、寡核苷酸增强的肿瘤细胞(肝细胞癌细胞)裂解物对Hepal-6细胞生长的抑制作用

表-7寡核苷酸增强的肿瘤细胞(结肠癌细胞)裂解物对结肠癌细胞生长的抑制作用

发明内容

除非特别强调，本发明中的术语具有可以被本发明所属领域内技术人员所理解的通常意义。若出现含义上的冲突，应遵从本详细说明的解释、界定或说明。

“肿瘤”：肿瘤(tumor)和癌症(cancer)在本说明书中可以互换使用，具有相同的含义。癌症细胞不受生长控制，可侵袭周围的组织并形成转移(metastasize)，危及个体的生命。肿瘤包括实体瘤(solidtumors/malignancies)、软组织肉瘤(soft tissue sarcomas)和髓样或淋巴样系统(myeloid or lymphoidsystems)的肿瘤。本发明提供的寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物中的肿瘤细胞裂解物可以从下述但不限于下述的肿瘤细胞制备。这些肿瘤是：食道癌、胆囊癌、膀胱癌(如transitional，squamous cellcarcinoma)、乳腺癌(如ductal and lobular adenocarcinoma)、结肠癌(如epithelial adenocarcinoma)、结直肠癌、肾上腺皮质肿瘤、肾癌(如renal cell carcinoma)、肝癌(如hepatoma，cholangiocarcinoma)、肺癌(如small and large cell adenocarcinomas，squamous cell carcinoma，bronchoalveolarcarcinoma，non small cell lung cancer)、卵巢癌(如epithelial adenocarcinoma，ovarian follicle cancer，ovariangerm cell cancer)、子宫颈癌、子宫癌、endometrial cancer、阴道癌、cancer of the vulva、胰腺癌(如pancreatic ductal adenocarcinomas)、直肠癌、前列腺癌(如prostatic adenocarcinoma)、胃癌、皮肤癌(如malignant melanoma，tumor progression of human skin keratinocytes，squamous cellcarcinoma，basal cell carc inoma，hemangiopericytoma)、脑肿瘤(如asneuroblastomas，astrocyticbrain tumors，astrocytoma，gliomas，oligodendroglioma，ependymoma，neuroblastoma，medulloblastomas，metastatic tumor cell invasion of the central nervous system)、mesothelioma、Kaposi’s sarcoma、骨肿瘤(如osteomas)、肉瘤(如fibrosarcoma，osteosarcoma)、阴茎癌、视网膜母细胞瘤、睾丸癌、甲状腺癌、trophoblastic neoplasms，rhabdomyosarcoma，teratocarcinoma，Wilms’tumor。肿瘤也指淋巴样和髓样造血系统肿瘤，包括但不限于白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。这些疾病包括：急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia)、急性非淋巴细胞白血病(acute nonlymphocyticleukemia)，慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia)、慢性髓样细胞白血病(chronicmyelocytic leukemia)、T细胞白血病、毛细胞白血病、急性髓性白血病(acute myeloid leukemia)、红白血病、慢性粒细胞白血病(chronic granulocytic leukemia)、包括霍杰金氏淋巴瘤、霍杰金氏病氏淋巴瘤、acute myelogenous leukemia，acute myelomonocytic leukemia、急性淋巴母细胞白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、多形核细胞白血病(prolymphocytic leukemia，PLL)，B细胞大细胞淋巴瘤、恶性淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病(cell-acute lymphocytic leukemia，B-ALL)、B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-cell chronic lymphocytic leukemia，B-CLL)、小淋巴细胞淋巴榴、B细胞原淋巴细胞性白血病(B-cell prolymphocytic leukemia)、蓬状细胞淋巴瘤(Mantle celllymphoma)、滤泡状淋巴瘤(Follicular lymphoma)、淋巴结外边缘区B细胞淋巴瘤(Extranodal marginalzone B-cell lymphoma of MALT type)，淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤(Nodal marginal zone B-cell lymphoma，脾边缘区B淋巴瘤(Splenic marginal zone lymphoma)，浆细胞瘤/浆细胞骨髓瘤(Plasmacytoma/plasmacell myeloma)、弥散性大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma)、Mediastinal(thymic)largeB cell lymphoma，血管内大B细胞淋巴瘤(intravascular large B-cell lymphoma)、原发性渗出性淋巴瘤(primary effusion lymphoma)、伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、多发性骨髓瘤、皮肤B细胞淋巴瘤、原发性滤泡性皮肤B细胞淋巴瘤、B细胞非霍杰金氏病氏淋巴瘤、lymphoplasma cytoid lymphoma、mucosa-associated lymphoid tissue(MALT)lymphoma、原发性甲状腺淋巴瘤、intravascular malignantlymphomatosis、皮细胞淋巴瘤、intragraft angiotropic large-cell lymphoma。本发明提供的寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物可采用上述肿瘤的肿瘤细胞制备并被用来治疗上述相对应的肿瘤。

“肿瘤细胞”：在本专利中，肿瘤细胞包括自体肿瘤细胞和同种异体肿瘤细胞，这些肿瘤细胞可以是个体的原发肿瘤的肿瘤细胞、继发肿瘤的肿瘤细胞、转移癌的肿瘤细胞或肿瘤细胞系细胞。这些肿瘤细胞细胞均可被用来制备寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物。

“肿瘤细胞裂解物”：肿瘤细胞裂解物是指将肿瘤细胞破碎制备的裂解物。破碎肿瘤细胞的方法包括但不限于，反复冻融，超声处理，机械破碎等。肿瘤细胞裂解物和寡核苷酸(ODN)混合后可制成寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物。

“寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物”：本发明述及的“寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物”是本发明中的一个特有名词，其含义是将寡核苷酸和肿瘤细胞裂解物混合后形成的混合物。其中的寡核苷酸可以增强肿瘤细胞裂解物刺激天然和获得性抗肿瘤免疫应答。

“免疫应答”：在本发明的中，免疫应答(Immune response)和免疫反应有相似的含义。免疫反应是免疫细胞如B细胞、T细胞、NK细胞、树突细胞和巨噬细胞等对抗原或其它刺激作出的反应。免疫应答包括天然免疫应答和获得性(特异性)免疫应答。获得性性免疫应答括细胞免疫应答和体液免疫应答。本发明提供的寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物在应用于个体后激发抗肿瘤的天然免疫和特异性免疫应答，这种免疫应答可以抑制肿瘤细胞的生长或清除相应的肿瘤细胞。

“基因修饰的肿瘤细胞”：在本发明中，被用来制备寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物的肿瘤细胞均可经转基因处理而成为基因修饰的肿瘤细胞(genetically modified tumor cells)。用来修饰肿瘤细胞的基因包括但不限于编码MHC分子、细胞因子、协同刺激分子和肿瘤抗原的编码基因，这些基因可以是全长的编码基因，也可以是全长编码基因的一部分。转基因的方法包括但不限于化学、物理方法和病毒载体介导的方法，如磷酸钙法、脂质体法、电转移法(electroporation)、压力介导的基因转移(pressure mediatedtransfer)。可用于转基因的载体病毒有：逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关载体(adenovirus-associatcdvectors，AAV)、疱疹病毒和痘病毒等。此外，编码MHC分子、细胞因子、协同刺激分子和肿瘤抗原的的DNA和RNA也可用来转染肿瘤细胞。本发明涉及的肿瘤细胞在经基因修饰后可被用来制备寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物。和未修饰的肿瘤细胞相比，基因修饰的肿瘤细胞可能获得更强免疫原性，更有效地激发抗肿瘤的免疫应答。

“MHC分子”：MHC分子是主要组织相容复合体(major histocompatibiltiy complex，MHC)基因编码的蛋白类分子。MHC分子包括MHC I类分子和MHC II类分子。将MHC分子的编码基因转入肿瘤细胞可能增强肿瘤细胞的免疫原性(immunogenity)。

“细胞因子”：细胞因子(Cytokine)是具有免疫调节活性的蛋白类分子。被细胞因子基因修饰的肿瘤细胞制备的寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物可能更有效地激发抗肿瘤的免疫应答。可用于修饰肿瘤细胞的细胞因子包括但不限于IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，IL-28，IL-29，G-CSF，GM-CSF，干扰素α，干扰素β，干扰素γ，肿瘤细胞坏死因子和各种趋化因子。

“协同刺激分子”：协同刺激分子(co-stimulaory molecules)是表达在抗原提呈细胞(antigenpresenting cells，APC)或肿瘤细胞表面的蛋白类分子，在免疫应答的过程中提供激活CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的第二激活信号。将协同刺激分子的编码基因转入肿瘤细胞可能增强肿瘤细胞的免疫原性(immunogenity)。可用于修饰肿瘤细胞的协同刺激分子的包括但不限于：CD1a，CD1b，CD1c，CD2，CD9，CD10，CD11a，CD11b，CD11c，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD25，CD27，CD28，CD40，CD70，CD80，CD83，CD86，CD137，LFA-1，LFA-2，LFA-3，VLA-1，VCAM-1，ICAM-2，VCAM-2和趋化因子受体等。

“肿瘤抗原”：在本说明书中，肿瘤抗原(Tumor antigen)，肿瘤细胞抗原(tumor cell antigen或“antigen from a tumor cell)，肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)可以交换应用，有相同的含义。肿瘤抗原能激发抗肿瘤免疫应答，针对肿瘤抗原的免疫应答可使表达该肿瘤抗原肿瘤细胞的生长受到抑制或受到杀伤。在肿瘤细胞裂解物中存在各种各样的肿瘤抗原。可用于修饰肿瘤细胞的肿瘤抗原包括但不限于：前列腺癌特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)，前列腺特异性膜抗原(Prostate specific membrane antigen，PSMA)，粘蛋白1(MUC-1)，畸胎瘤衍化的生长因子(Teratocarcinoma-derived growth factor，CRIPTO-1)，HER2/neu，NY-ESO-1，telomerase reversetranscriptase，癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)，甲胎蛋白(alpha.-fetoprotein)，mitochondrial creatine kinase，髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)，glial fibrillaryacidic protein(GFAP)，黑色素瘤酪氨酸酶，neuron cancer enolase(NSE)，突变的K-ras蛋白，突变的p53蛋白，人乳头瘤病毒E6和E7蛋白，EB病毒多肽(Epstein Barr Virus peptides)，黑色素瘤MART-1抗原，黑色素瘤gp100抗原，胸腺白血病抗原(thymus-leukemia antigen，TL)，MAGE蛋白和活素(Survivin)等。

“寡核苷酸”：寡核苷酸是由糖(如脱氧核糖)，磷酸基团和碱基组成的单核苷酸连接而形成的分子，其中糖分子和碱基连接成核苷(nucleoside)，核苷由磷酸基团连接形成核苷酸(nucleotide)，形成核苷的碱基有嘧啶和嘌呤，嘧啶有胸腺嘧啶(thymine，缩写为T或t)和胞嘧啶(cytosine，缩写为C或c)，嘌呤有腺嘌呤(adenine，缩写为A或a)和鸟嘌呤(guanine，缩写为G或g)。在本发明中，寡核苷酸指的是脱氧寡核苷酸，包括但不限于含CpG的氧核苷酸。寡核苷酸可由人工合成，也可以从细胞、细菌和病毒中获得。

“化学修饰”：与自然的DNA相比，本发明提供的寡核苷酸可以经各种化学修饰，修饰的部位可发生在核苷之间的磷酸二酯键，核糖单位或/和有机碱基(A、T、C、G)。在寡核苷酸的合成期间或合成后都可以进行修饰。在合成期间的化学修饰可以在寡核苷酸的内部或5`端进行修饰。合成后的寡核苷酸可以但不限于在活性基团(如5`或3`端的磷酸或羟基)进行化学修饰。专业人员可以知道这些化学修饰具体方式。本发明中的寡核苷酸可以有一个或多个化学修饰。和相同序列的自然形态的寡核苷酸相比，本发明中的寡核苷酸的化学修饰可以位于局部的磷酸二酯键或/和局部的核糖单位或/和局部的核苷碱基。本发明中的化学修饰包括寡核苷酸的骨架修饰。在这里，寡核苷酸的骨架修饰包括但不限于磷酸骨架修饰。磷酸骨架修饰可以是在核苷酸分子的一个稳定的磷酸骨架中，其中至少一个核苷酸间键合中的非桥性磷酸氧原子被硫原子取代。在本发明中的寡核苷酸中，核苷酸间键合中的非桥性磷酸氧原子可以部分或全部被硫原子取代。本发明中的寡核苷酸的骨架也可发生非离子DNA类似物，如烷基、芳香-碳磷酸盐化合物(带电荷的碳磷酸盐化合物氧原子被烷基、芳香基取代)修饰，再如磷酸二酯和烷基磷酸三酯中的氧原子部分被烷基化修饰。本发明的寡核苷酸可以是磷硫酰和磷酸二酯的嵌合体。在本发明的寡核苷酸中，化学修饰还包括碱基替代，如C-5丙炔嘧啶和7-deaza-7替代嘌呤替代。替代的嘌呤和嘧啶包括但不限于：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、其它的自然的和非自然出现的碱基。在本发明的寡核苷酸中，化学修饰还包括碱基修饰。修饰的碱基在化学上不同于典型的自然中的碱基(如A、T、C、G。)，但具有它们基本的化学结构。本发明中的寡核苷酸还可以用胞嘧啶衍生物或胸腺嘧啶核苷衍生物修饰。这里胞嘧啶衍生物是指胞嘧啶样核苷(除外胞嘧啶)。胸腺嘧啶核苷衍生物是指胸腺嘧样核苷(不包括胸腺嘧啶)。另外，本发明中的寡核苷酸的修饰可以是在寡核苷酸的两个或一个末端连接连接一个二元醇，如四乙二醇或六乙二醇。本发明中的寡核苷酸经化学修饰可以产生出相应的寡核苷酸的功能性类似物。

“TOLL样受体激动剂”：本发明提供的用于制备寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物的寡核苷酸(ODN)包括但不限含CpG的寡核苷酸(CpG ODN)。CpG ODN是Toll样受体(Toll like receptors)9的激动剂。Toll样受体是一个识别微生物来源分子结构(病原体相关分子模型)的受体家族。表达Toll样受体的免疫细胞通过结合这种病原体相关分子模型而被激活。在人类，Toll样受体家族共有11个成员。Toll样受体可以识别很多病原微生物来源的物质，这些物质都是TOLL样受体激动剂。如，TLR4可以识别细菌脂多糖(LPS)；TLR2和TLR6的双体可以识别脂磷壁酸和双酰脂肽；TLR2和TLR1的双体可以识别三酰脂肽；TLR9可以识别合成的或来源于细菌和病毒含CpG寡核苷酸(CpG ODN)；Imiquimod也是TLR9的激动剂；TLR5可以识别细菌鞭毛蛋白；TLR2和TLR6的双体还可以识别酵母多糖；TLR4可以识别呼吸道合胞病毒F蛋白；TLR3可以识别聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸(poly IC)，合成的或来源于病毒的双链RNA；TLR7和TLR8可以识别单链病毒RNA；TLR4可以识别原虫产物，如GPI锚定蛋白；TLR4还可以识别炎症组织的产物，如HSP60和纤维原片段(Foo Y.Liew，et al.Negative regulation of toll like receptor mediated immuneresponses Nature Reviews Immunology.Vol 5，June 2005，446-458)。已经有研究证实，TLR9激动剂可以激活天然免疫反应和获得性免疫反应(Arthur M.Krieg.Therapeutic potential of Toll-likereceptor 9 activation.Nature Reviews Drug Discovery，Vol 5.June 2006，471-484)。在人类的免疫系统中，B细胞和浆细胞样树突细胞(pDCs)表达TLR9。含有CpG的寡核苷酸(CpG ODN)是TLR9的激动剂(D.M.Klinman，Immunotherapeutic uses of CpG oligodeoxynucleotides，428 Nat.Rev.，Immunol.4(2004)249-258)。根据功能特性，含有CpG的寡核苷酸分为3个类型(Tomoki Ito，et al.Specialization，kinetics，and repertoire of type 1interferon responses by human plasmacytoidpredendritic cells.Blood，15March 2006，Vol 107，Num 6：2423-2431)。A型含CpG寡核苷酸可以激活人浆细胞样树突状细胞产生大量的I型干扰素(IFN-a/β)，强烈地激活NK细胞。B型含CpG寡核苷酸主要激活B细胞，刺激B细胞增值和抗体分泌。C型含CpG的寡核苷酸同时具有A型和B型含CpG寡核苷酸的功能。TLR9激动剂可以被胞吞到细胞间隙而激活TLR9。在浆细胞样树突状细胞中，TLR9激活可以启始一个快速的天然免疫反应，其特征是分泌大量的促炎因子如IL-6，肿瘤坏死因子-α(TNFα)、I型干扰素(IFN-a/β)和干扰素诱导的趋化因子。通过干扰素依赖和干扰素非依赖两条通路，此浆细胞样树突细胞可以继发激活天然免疫细胞如NK细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞。通过TLR9的刺激，B细胞增强了对抗原刺激的敏感性，可以有效地分化成抗体分泌细胞。因此，TLR9的刺激有助于获得性免疫应答，特别是体液免疫应答。通过TLR9激活的浆细胞样树突状细胞可分泌IFNα，此IFNα可使浆细胞样树突细胞迁移聚集到淋巴结和其他周围淋巴组织。在这些部位，此浆细胞样树突细胞可以激活未致敏的T细胞和记忆T细胞，向CD8+细胞毒性T细胞交义提呈可溶性抗原交，促进TH1型的CD4和CD8T细胞反应。含CpG的寡核苷酸(CpG ODN)或其它的TLR受体激动剂在和肿瘤细胞裂解物混合后制备的寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物或TLR受体激动剂增强的肿瘤细胞裂解物可通过激活TLR而增强肿瘤细胞裂解物的激发个体抗肿瘤免疫应答的效力，因而发挥治疗肿瘤的作用。

″个体″：在本发明中，个体(subject或individual)是指人和非人类的脊椎动物。本发明提供的寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物在应用于个体后可产生肿瘤治疗作用。

“抗肿瘤作用”：在本发明中，抗肿瘤作用是指个体的肿瘤细胞生长的抑制，肿瘤细胞数目的减少，肿块缩小，肿块消失，个体临床症状的改善，肿瘤生长减缓，个体的生命延长，个体的生活质量改善和肿瘤的转移和复发受到抑制。抗肿瘤作用包括对肿瘤的治疗，也包括对肿瘤发生和复发的预防。

“药物学可接受的载体”：药物学可接受的载体(pharmaceutically acceptable carrier)是指一种或多种固体或液体的填充剂、稀释剂或包封物质，此载体适合将本发明提供的寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物应用于个体。该载体可以是有机的、无机的、天然的或合成的。该载体包括各种溶液、稀释剂、溶剂、分散剂、脂质体、乳化剂、抗菌剂、抗真菌剂、等渗的和延缓吸收的试剂、和其他的适合本发明中的核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物寡核苷酸应用的载体。药物学可接受的载体的选择决定于本发明中本发明提供的寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物的应用方式。可注射用的载体包括水、生理盐水、PBS缓冲液(phosphatebuffered saline solution)，平衡盐溶液、葡萄糖溶液、甘油和乳化剂和湿化剂等。乳化剂可包括水包油乳化剂(oil/water emulsion)和油包水乳化剂(o water/oil emulsion)。

“治疗有效剂量”：为了治疗肿瘤，给个体应用治疗有效剂量(therapeutically effective amount)寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物。该治疗有效剂量是指在应用后，在个体后可刺激抗肿瘤免疫应答，产生肿瘤治疗效果的寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物的剂量。本发明中的寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物可以直接或加载到药物学上可接受的载体中应用。这个“剂量”的多少决定于本领域技术熟练人员应知的标准技术，还要参考其他因素，包括并不限于个体的大小，健康情况和疾病的严重程度等。寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物中的寡核苷酸的剂量范围从1μg到100mg/针。为了达到理想的治疗效果，本领域技术熟练人员可以对此寡核苷酸的应用剂量作调整，其剂量范围可以是前述范围的10倍到1000倍。寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物中的肿瘤细胞裂解物的剂量是从含有自1×106个肿瘤细胞到1×1010个肿瘤细胞的范围内制备的肿瘤细胞裂解物。为了达到理想的治疗效果，本领域技术熟练人员可以对此肿瘤细胞裂解物的应用剂量作调整，其剂量范围可以是前述范围的10倍到1000倍。在一些情况下，寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物可被多次施用，如注射1到4次，注射的间隔是1或2到3周，此为一个疗程。个体可经历一个或多个疗程的治疗。本领域技术熟练人员可以对此肿瘤细胞裂解物的应用次数和疗程作出调整。

“药物组合物”：药物组合物(pharmaceutical composition)指的是本发明中治疗有效剂量的寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物或与药物学上可接受的载体组成的混合物。药物组合物分可以包含一个或多个本发明中的寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物。药物组合物可以但不限于是水溶液、盐溶液和粉剂。药物组合物的应用方式可以是经肠外注射。在各种情况下，药物组合物必须是无菌和稳定的。本发明的注射剂药物组合物包括药学上可接受的水溶液、非水溶液、分散剂、悬浊剂、乳剂。寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物或与药物学上可接受的载体组成的混合物也可被制备成粉剂(Powder)。寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物的粉剂可经冻干或真空干燥的方法制备。在注射前，用无菌的注射用水或其它药物学可接受的载体溶解。在一些情况下，为了延长本发明中寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物的作用效果，药物组合物可被处理于合适的持续释放系统后应用。本发明提供的寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物也可和其它的抗肿瘤制剂联合应用，其方式是(1)寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物和其它的抗肿瘤制剂在应用前混合；(2)寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物和其它的抗肿瘤制剂在不同的时间应用；(3)寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物和其它的抗肿瘤制剂在应用前混合通过不同的给药途径应用；(4)寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物和其它的抗肿瘤制剂组成药物组合物(pharmaceutical composition)应用。

“给药途径”：在应用时，本发明中的寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物可以经由各种合适的给药途径(Route)单独应用或和其它抗肿瘤制剂联合应用，来达到理想的肿瘤治疗效果。本发明中的寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物可经肠外给药途径施用，这些途径包括皮下，肌肉、腹腔、鞘内、皮内、瘤内、瘤旁和淋巴结内注射。

“抗肿瘤制剂”：抗肿瘤制剂(anti-tumor agent)能治疗肿瘤和/或激发抗肿瘤免疫应答的制剂，包括但不限于化疗药物，细胞因子，抗肿瘤抗体，表皮细胞生长因子受体(EGFR)-酪氨酸激酶(-TK)激活抑制剂，肿瘤细胞突变蛋白酪氨酸激酶抑制剂，肿瘤血管抑制剂，RNA干涉物，TLR激动剂和非特异性免疫增强剂和等。本发明提供的寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物可以单独应用，或几种联合应用，或和一种或几种其它的抗肿瘤制剂联合应用。本发明提供的寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物可以和其它的抗肿瘤制剂同时应用，或按先后次序应用。

“化疗药物”：化疗药物是指用于肿瘤治疗的化学药物。化疗药物包括但不限于氮芥、环磷酰胺、消瘤芥、盐酸氮芥，卡氮芥、环乙亚硝脲、噻替派、马利兰、顺铂，亚硝脲类，5-氟脲嘧啶、阿糖胞苷、甲氨喋呤、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤，羟基脲，阿霉素，表阿霉素，柔红霉素，米托蒽醌，丝裂霉素，博采霉素，自力霉素，放线菌素D，长春新碱，长春花碱，长春花碱酰胺，三尖杉脂碱，喜树碱，鬼臼乙叉，美登素，榄香烯乳，三苯氧胺，肾上腺皮质激素，甲基苄肼，羟基甲基苄肼，左旋门冬酰胺酶，铂类(顺铂，卡铂，草酸铂)，氮烯咪胺，六甲嘧胺，泰索帝或培美曲赛(Alimta)，诺维本，希罗达，伊立替康，拓扑替康，草酸铂，多烯紫杉醇(Docetaxel)，联合应用的化疗药物如泰素(紫杉醇)+顺铂，泰素+卡铂、健择(盐酸吉西他滨)+顺铂，泰索帝(多西紫杉醇)+顺铂，泰素D、健择+顺铂，顺铂(Cisplatin)+长春瑞宾(vinorelbine)，吉西他滨(gemcitabine)+卡铂(Carboplatin)，紫杉醇(paclitaxel)+卡铂。

“细胞因子”：本发明提供的寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物可和细胞因子联合应用。这些细胞因子包括但不限于：IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，IL-28，IL-29，G-CSF，GM-CSF，M-CSF，EPO(erythropoietin)，血小板生成素，干细胞生长因子，干扰素α，干扰素β，干扰素γ，肿瘤细胞坏死因子和各种趋化因子等。

“抗肿瘤抗体”：本发明提供的寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物可和抗肿瘤抗体联合应用，这些抗体包括但不限于HERCEPTIN(Clin Cancer Res.2006 Jul 15；12(14Pt 2)：4436s-4440s)，Rituximab(Rituxan.RTM.)(Blood.69：584-591，1987)，抗-CTLA-4抗体，抗CD40抗体，抗EGF受体抗体和抗VEGF受体抗体等。

“表皮细胞生长因子受体(EGFR)-酪氨酸激酶(-TK)激活抑制剂”：肿瘤细胞如肺癌细胞表达的表皮细胞生长因子是受体酪氨酸激酶，抑制此激酶活性的制剂可以抑制包括肺癌细胞的生长。此类制剂包括但不限于吉非替尼或易瑞沙(Gefitinib，Iressa)和埃罗替尼(Erlotinib，Tarceva)(Bezjak，A.，et al.J Clin Oncol 24：3831-38372006)。

“肿瘤细胞突变蛋白酪氨酸激酶抑制剂”是指抑制肿瘤细胞突变蛋白酪氨酸激酶活性的制剂。此类制剂包括但不限于甲磺酸伊马替尼(Gleevec或STI-571或Imatinib mesylate)。甲磺酸伊马替尼是突变蛋白质(Bcr-Abl)酪氨酸激酶磷酸化抑制剂(Rubin BP，DuensingA.Mechanisms of resistance to smallmolecule kinase inhibition in the treatment of solid tumors.Lab Invest.2006Aug 21)。

“肿瘤血管抑制剂”是指通过抑制肿瘤血管形成而发挥抗肿瘤作用的制剂。这类制剂包括但不限于阿瓦斯丁(Avastin)和恩度(ENDOSTAR)。阿瓦斯丁是结合血管内皮生长因子(VEGF)的基因工程单克隆抗体(Gridelli C，et al.New antiangiogenetic agents and non-small cell lung cancer.Crit Rev OncolHematol.2006 Jul 12)。恩度是重组人血管内皮抑制素。

“RNA干涉物”：RNA干扰(RNA interference，简称RNAi)是采用单链RNA干扰同源RNA功能的现象。具有RNA干扰作用的这种单链RNA也被称为RNA干涉物。各种能够干扰维持肿瘤细胞恶性表型的RNA干涉物都会产生抗肿瘤的作用。

“非特异性免疫增强剂”：是指能非特异增强个体抗肿瘤免疫反应的制剂，这些制剂包括单但不限于卡介苗(Bacillis Calmette-Gruen，BCG)，短小棒状杆菌(Corynabacterium parvum，金黄色葡萄球菌，CD40配体，细菌核糖体提取物(Ribosomal fractions)，细菌膜提取物(membranar bacterial fractions)，细菌膜proteoglycanes，polyarginine，HSP-60，HSP-70，HSP-90和CTLA-4抑制剂等。

实施例(EXAMPLES)

技术熟练人员可以了解到本发明提供的肿瘤细胞裂解物和寡核苷酸或其功能类似物联合应用可以表现抗肿瘤的作用。在实施例中，寡核苷酸由TAKARA公司合成，并经无热源处理。寡核苷酸中的内毒素应用鲎变形细胞溶解法检测(Associates of Cape Cod，Inc)。以下是在实施例中应用的寡核苷酸(ODN)序列和名称：

SEQ ID NO：1：5’-tcgcgaacgttcgccgcgttcgaacgcgg-3’(CpG 0800)(29bp)

SEQ ID NO：2：5’-tcgtcgacgtcgttcgttctc-3’(CpG 685)(21bp)

SEQ ID NO：3：5’-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3’(CpG 684)(23bp)

SEQ ID NO：4：5’-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3’(CpG 2006)(24bp)

SEQ ID NO：55’tgactgtgaacgttcgagatga 3’(CpG1018)(22bp)

实施例1、寡核苷酸增强的肿瘤细胞(黑色素瘤细胞)裂解物的抗黑色素瘤作用

1、肿瘤细胞裂解物的制备

B16细胞(黑色素瘤细胞，源自美国ATCC)，用含10％(v/v)胎牛血清(天津TBD公司)和抗生素(100IU青霉素/ml和100IU的链霉素/ml)的IMDM培养液(Gibco公司)，在37℃，5％ CO₂的细胞孵箱内培养。

将B16细胞(1×10⁷/ml)悬浮于1ml PBS(phosphate-buffered saline)中，做4轮冻融处理。方法是，甲醇干冰冰冻，37℃融解。也可采用液氮冷冻。将生成的细胞裂解物用台酚蓝染色，在显微镜下检测无完整的细胞。320g，4℃，离心10分钟。收上清，-70℃保存。ODN可以溶解在PBS中。100μl PBS中含有从1×10⁶肿瘤细胞制备的肿瘤细胞裂解物。

2、寡核苷酸增强的肿瘤细胞(黑色素瘤细胞)裂解物的抗黑色素瘤作用

采用6～8周龄的C57BL/6雌性小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行抗肿瘤的实验。在寡核苷酸增强的肿瘤细胞(B16细胞)裂解物组小鼠，于第0天和第7天在右侧背部皮下各注射100μl寡核苷酸增强的肿瘤细胞(B16细胞)裂解物(含20μg ODN)。设肿瘤细胞(B16细胞)裂解物对照组，ODN对照组和PBS对照组。肿瘤细胞(B16细胞)裂解物对照组小鼠：注射100μl肿瘤细胞(B16细胞)裂解物。ODN对照组小鼠：注射100μl含20μg ODN的PBS。PBS对照组小鼠：注射100μl PBS。于第14天，在C57BL/6小鼠左侧背部皮下注射3×10⁵B16肿瘤细胞。在接种B16肿瘤细胞的第18天观察各组小鼠的出瘤率。结果见表-1。

表-1、寡核苷酸增强的肿瘤细胞(黑色素瘤细胞)裂解物对黑色瘤出瘤率的影响

组别                               动物数(n)     出瘤率(％)

CpG0800增强的黑色素瘤细胞裂解物    20            13

CpG0800                            20            78

CpG685增强的黑色素瘤细胞裂解物     20            12

CpG685                             20            65

CpG684增强的黑色素瘤细胞裂解物     20            21

CpG684                             20            71

CpG2006增强的黑色素瘤细胞裂解物    20            23

CpG2006                            20            79

CpG1018增强的黑色素瘤细胞裂解物    20            31

CpG1018                            20            82

黑色素瘤细胞裂解物                 20            60

PBS                                20            100

结果表明，寡核苷酸增强的肿瘤细胞(黑色素瘤细胞)裂解物在应用于小鼠后，可产生显著的抗黑色素瘤的作用。寡核苷酸增强的肿瘤细胞(黑色素瘤细胞)裂解物组和对照组相比，P＜0.05。结果也表明，采用如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5所示序列的寡核苷酸制备的黑色素瘤细胞裂解物均可产生抗黑色素瘤的作用。

实施例2、寡核苷酸增强的肿瘤细胞(肺癌细胞)裂解物的抗肺癌作用

1、肿瘤细胞裂解物的制备

Lewis肺癌(Lewis lung carcinoma，LLC)细胞(源自美国ATCC)，用含10％(v/v)热灭活的胎牛血清和抗生素100IU青霉素/ml和100IU的链霉素/ml的IMDM培养液(Gibco公司)在37℃，5％CO₂的细胞孵箱内培养。Lewis肺癌细胞也可在C57BL/6J小鼠皮下接种传代扩增。采用体外培养和体内传代的Lewis肺癌细胞均可被制备成肿瘤细胞裂解物。将Lewis肺癌细胞(1×10⁷/ml)悬浮于1ml PBS(phosphate-buffered saline)中，做4轮冻融处理。方法是，甲醇干冰冰冻，37℃融解。也可采用液氮冷冻。将生成的细胞裂解物用台酚蓝染色，在显微镜下检测无完整的细胞。将细胞裂解物经超声处理。320g，4℃，离心10分钟。收上清，-70℃保存。ODN可以溶解在PBS中。100μl PBS中含有从1×10⁶。

2、寡核苷酸增强的肿瘤细胞(Lewis肺癌细胞)裂解物的抗Lewis肺癌细胞的作用

采用体内传代扩增的Lewis肺癌细胞接种C57BL/6J小鼠。C57BL/6J雄性小鼠，6～8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。具体方法是，无菌取出C57BL/6J小鼠皮下的Lewis肺癌瘤块，用0.25％胰蛋白酶-0.04％EDTA对瘤块进行消化(30min)，经200目尼龙网过滤，1500转，离心5min。用PBS将细胞离心洗涤2次。计数并将Lewis肺癌细胞配成浓度为每1×10⁶活细胞/0.1ml。

在寡核苷酸增强的肿瘤细胞(Lewis肺癌细胞)裂解物组小鼠，于第0天和第7天在右侧背部皮下各注射100μl寡核苷酸增强的肿瘤细胞(Lewis肺癌细胞)裂解物(含20μg ODN)。设肿瘤细胞(Lewis肺癌细胞)裂解物对照组，ODN对照组和PBS对照组。肿瘤细胞(Lewis肺癌细胞)裂解物对照组小鼠：注射100μl肿瘤细胞(Lewis肺癌细胞)裂解物。ODN对照组小鼠：注射100μl含20μg ODN的PBS。PBS对照组小鼠：注射100μl PBS。于第14天，在C57BL/6小鼠左侧背部皮下注射0.1ml Lewis肺癌细胞悬液。在接种肿瘤后的第18天断颈处死全部的小鼠，小鼠全部出现肿瘤。剖出瘤块，称取重量。结果见表-2。

表-2、寡核苷酸增强的肿瘤细胞(Lewis肺癌细胞)裂解物对Lewis肺癌细胞生长的影响

组别                                动物数(n)     瘤重(g)

CpG0800增强的Lewis肺癌细胞裂解物    20            0.488±0.040

CpG0800                             20            1.488±0.502

CpG685增强的Lewis肺癌细胞裂解物     20            0.257±0.040

CpG68                               520           1.358±0.302

CpG684增强的Lewis肺癌细胞裂解物     20            0.665±0.218

CpG684                              20            1.451±0.321

CpG2006增强的Lewis肺癌细胞裂解物    20            0.755±0.210

CpG2006                             20            1.489±0.547

CpG1018增强的Lewis肺癌细胞裂解物    20            0.775±0.312

CpG1018                             20            2.218±0.304

Lewis肺癌细胞裂解物                 20            1.581±0.404

PBS                                 20            2.733±0.407

结果表明，寡核苷酸增强的肿瘤细胞(肺癌细胞)裂解物在应用于小鼠后，可产生显著的抗肺癌的作用。寡核苷酸增强的肿瘤细胞(Lewis肺癌细胞)裂解物组和对照组相比，P＜0.05。结果也表明，采用具有如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5所示序列的寡核苷酸制备的Lewis肺癌细胞裂解物均可产生抗Lewis肺癌细胞的作用。

实施例3、寡核苷酸增强的肿瘤细胞(淋巴瘤细胞)裂解物的抗淋巴瘤作用

1、肿瘤细胞裂解物的制备

EL4细胞(C57BL/6小鼠淋巴瘤细胞)，源自American Type Culture Collection(ATCC)。采用含10％灭活FCS，20μg/ml庆大霉素，1mM HEPES的IMDM培养基(Gibco公司)，在37℃，5％ CO₂的条件下培养。将EL4细胞(1×10⁷/ml)悬浮于1ml PBS(phosphate-buffered saline)中，做4轮冻融处理。方法是，甲醇干冰冰冻，37℃融解。也可采用液氮冷冻。将生成的细胞裂解物用台酚蓝染色，在显微镜下检测无完整的细胞。将细胞裂解物经超声处理。320g，4℃，离心10分钟。收上清，-70℃保存。ODN可以溶解在PBS中。100μl PBS中含有从1×10⁶EL4细胞制备的肿瘤细胞裂解物。

2、寡核苷酸增强的肿瘤细胞(EL4细胞)裂解物的抗EL4细胞的作用

采用6～8周龄的C57BL/6雄性小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行抗肿瘤的实验。在寡核苷酸增强的肿瘤细胞(EL4细胞)裂解物组小鼠，于第0天、第7天和第14天在右侧背部皮下注射100μl寡核苷酸增强的肿瘤细胞(EL4细胞)裂解物(含20μg ODN)。设肿瘤细胞(EL4细胞)裂解物对照组，ODN对照组和PBS对照组。肿瘤细胞(EL4细胞)裂解物对照组小鼠：注射100μl肿瘤细胞(EL4细胞)裂解物。ODN对照组小鼠：注射100μl含20μg ODN的PBS。PBS对照组小鼠：注射100μl PBS。于第18天，在C57BL/6小鼠右侧背部皮下注射0.1ml EL4细胞悬液。自接种肿瘤后开始观察并记录小鼠的生存期。

表3、寡核苷酸增强的肿瘤细胞(EL4细胞)裂解物的对EL4细胞成瘤率的影响

组别                          动物数(n)     生存期(天)

CpG0800增强的EL4细胞裂解物    20            50.5±4.9

CpG0800                       20            28.5±4.6

CpG685增强的EL4细胞裂解物     20            51.3±5.9

CpG685                        20            27.7±3.6

CpG684增强的EL4细胞裂解物     20            48.2±7.0

CpG684                        20            26.9±6.6

CpG2006增强的EL4细胞裂解物    20            47.8±5.6

CpG2006                       20            33.5±5.7

CpG1018增强的EL4细胞裂解物    20            49.5±5.7

CpG1018                       20            28.7±4.6

EL4细胞裂解物                 20            29.7±3.7

PBS                           20            20.8±5.1

结果表明，寡核苷酸增强的肿瘤细胞(淋巴瘤细胞)裂解物在应用于小鼠后，可产生显著的抗淋巴瘤的作用。寡核苷酸增强的肿瘤细胞(淋巴瘤细胞)裂解物组和对照组相比，P＜0.05。结果也表明，采用如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5所示的寡核苷酸制备的淋巴瘤细胞裂解物均可产生抗淋巴瘤的作用。

实施例4、寡核苷酸增强的肿瘤细胞(神经系统肿瘤细胞)裂解物的抗神经系统肿瘤的作用

1、肿瘤细胞裂解物的制备

GL26细胞(C57BL/6小鼠胶质瘤细胞)，源自American Type Clture Collection(ATCC)。用含10％(v/v)灭活的胎牛血清和抗生素(100IU青霉素/ml和100IU的链霉素/ml)的IMDM培养液，在37℃、5％CO2的条件下培养。将GL26细胞(1×10⁷/ml)悬浮于1ml PBS(phosphate-buffered saline)中，做4轮冻融处理。方法是，甲醇干冰冰冻，37℃融解。也可采用液氮冷冻。将生成的细胞裂解物用台酚蓝染色，在显微镜下检测无完整的细胞。320g，4℃，离心10分钟。收上清，-70℃保存。ODN可以溶解在PBS中。100μl PBS中含有从1×10⁶ GL26细胞制备的肿瘤细胞裂解物。

2、寡核苷酸增强的肿瘤细胞(GL26细胞)裂解物的抗GL26细胞的作用

采用6～8周龄的C57BL/6雄性小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)做原位GL26小鼠胶质瘤模型(GL26 orthotopic murine glioma model)进行抗肿瘤的实验。在寡核苷酸增强的肿瘤细胞(GL26细胞)裂解物组小鼠，于第0天和第7天在右侧背部皮下注射100μl寡核苷酸增强的肿瘤细胞(GL26细胞)裂解物(含20μg ODN)。设肿瘤细胞(GL26细胞)裂解物对照组，ODN对照组和PBS对照组。肿瘤细胞(GL26细胞)裂解物对照组小鼠：注射100μl肿瘤细胞(GL26细胞)裂解物。ODN对照组小鼠：注射100μl含20μg ODN的PBS。PBS对照组小鼠：注射100μl PBS。在第14天，在小鼠颅内注射1×10⁴GL26细胞，注射的体积为2μl，方法如文献(Prins RM，Odesa SK，Liau LM Immunotherapeutic targeting ofshared melanoma-associated antigens in a murine glioma model.Cancer Res.2003 Dec，1；63(23)：8487-91)所述。自接种肿瘤后开始观察并记录小鼠的生存期。结果见表-4。

表-4、寡核苷酸增强的肿瘤细胞(GL26细胞)裂解物对荷GL26细胞细胞瘤小鼠生存时间的影响

组别                           动物数(n)     生存期(天)

CpG0800增强的GL26细胞裂解物    10            80.6±12.9

CpG0800                        10            35.6±6.7

CpG685增强的GL26细胞裂解物     10            83.5±10.1

CpG685                         10            34.6±5.5

CpG684增强的GL26细胞裂解物     10            79.5±7.8

CpG684                         10            33.6±5.8

CpG2006增强的GL26细胞裂解物    10            78.9±9.9

CpG2006                        10            38.6±6.8

CpG1018增强的GL26细胞裂解物    10            77.5±7.9

CpG1018                        10            40.2±6.6

GL26细胞裂解物                 10            40.6±13.8

PBS                            10            25.6±6.9

结果表明，寡核苷酸增强的肿瘤细胞(神经系统肿瘤细胞)裂解物在应用于小鼠后，可显著延长接种胶质瘤细胞(GL26细胞)小鼠的生存时间(Student test)。寡核苷酸增强的肿瘤细胞(神经系统肿瘤细胞)裂解物组和对照组相比，P＜0.05。结果也表明，采用如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5所示的寡核苷酸制备的神经系统肿瘤细胞裂解物均可产生抗神经系统肿瘤细胞的作用。

实施例5、寡核苷酸增强的肿瘤细胞(白血病细胞)裂解物的抗白血病作用

1、肿瘤细胞裂解物的制备

C1498细胞(a murine leukemia cell line of C57BL/6 origin)是C57BL/6小鼠的白血病细胞系细胞(ATCC)。用含10％(v/v)灭活的胎牛血清和抗生素(100IU青霉素/ml和100IU的链霉素/ml)的IMDM培养液，在37℃，5％ CO2的条件下培养。在制备肿瘤细胞裂解物前，C1498细胞在AIM-V无血清培养基(Life Technologies)中培养。将C1498细胞(1×10⁷/ml)悬浮于1ml PBS(phosphate-buffered saline)中，做4轮冻融处理。方法是，甲醇干冰冰冻，37℃融解。也可采用液氮冷冻。将生成的细胞裂解物用台酚蓝染色，在显微镜下检测无完整的细胞。320g，4℃，离心10分钟。收上清，-70℃保存。ODN可以溶解在PBS中。100μl PBS中含有从1×10⁶C1498细胞制备的肿瘤细胞裂解物。

2、寡核苷酸增强的肿瘤细胞(白血病细胞)裂解物的抗白血病细胞的作用

采用6～8周龄的C57BL/6雄性小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行抗肿瘤的实验。在寡核苷酸增强的肿瘤细胞(C1498细胞)裂解物组小鼠，于第0天和第7天在右侧背部皮下注射0.1ml寡核苷酸增强的肿瘤细胞(C1498细胞)裂解物，设肿瘤细胞(C1498细胞)裂解物对照组，ODN对照组和PBS对照组。肿瘤细胞(C1498细胞)裂解物对照组小鼠：注射100μl肿瘤细胞(C1498细胞)裂解物。ODN对照组小鼠：注射100μl含10μg ODN的PBS。PBS对照组小鼠：注射100μl PBS。于第14天，尾静脉注射C1498肿瘤细胞(2×10⁵细胞/鼠)，观察并记录小鼠的生存期。

表-5、寡核苷酸增强的肿瘤细胞(C1498细胞)裂解物对荷C1498细胞小鼠生存时间的影响

组别                            动物数(n)     生存时间(天)

CpG0800增强的C1498细胞裂解物    20            70.6±8.9

CpG0800                         20            35.6±5.8

CpG685增强的C1498细胞裂解物     20            72.5±10.1

CpG685                          20            44.6±5.8

CpG684增强的C1498细胞裂解物     20            67.6±7.8

CpG684                          20            40.6±6.9

CpG2006增强的C1498细胞裂解物    20            66.9±9.7

CpG2006                         20            38.6±6.8

CpG1018增强的C1498细胞裂解物    20            65.6±7.9

CpG1018                         20            43.8±8.9

C1498细胞裂解物                 20            44.6±5.9

PBS                             20            25.6±6.9

结果表明，寡核苷酸增强的肿瘤细胞(白血病细胞)裂解物在应用于小鼠后，可显著延长接种白血病细胞小鼠的生存时间。寡核苷酸增强的肿瘤细胞(白血病细胞)裂解物组和对照组相比，P＜0.05。结果也表明，采用如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5所示的寡核苷酸制备的白血病细胞裂解物均可产生抗白血病的作用。

实施例6、寡核苷酸增强的肿瘤细胞(肝细胞癌细胞)裂解物的抗肝癌作用

1、肿瘤细胞裂解物的制备

Hepa1-6(Hepatocellular carcinoma，HCC)细胞，源自American TypeCulture Collection(ATCC)。用含10％(v/v)灭活的胎牛血清和抗生素100IU青霉素/ml和100IU的链霉素/ml的IMDM培养基中，在37℃，5％CO2的条件下培养。将Hepa1-6细胞(1×10⁷/ml)悬浮于1ml PBS(phosphate-bufferedsaline)中，做4轮冻融处理。方法是，甲醇干冰冰冻，37℃融解。也可采用液氮冷冻。将生成的细胞裂解物用台酚蓝染色，在显微镜下检测无完整的细胞。320g，4℃，离心10分钟。收上清，-70℃保存。ODN可以溶解在PBS中。100μl PBS中含有从1×10⁶ Hepa1-6细胞制备的肿瘤细胞裂解物。

2、寡核苷酸增强的肿瘤细胞(肝癌细胞)裂解物的抗肝癌的作用

采用C57BL/10J小鼠(吉林大学动物中心提供)Hepa1-6细胞皮下移植瘤模型研究寡核苷酸增强的肿瘤细胞(肝癌细胞)裂解物的抗肝癌的作用。在寡核苷酸增强的肿瘤细胞(Hepa1-6细胞)裂解物组小鼠，于第0天和第7天在右侧背部皮下注射0.1ml寡核苷酸增强的肿瘤细胞(Hepa1-6细胞)裂解物(含20μg ODN)，设肿瘤细胞(Hepa1-6细胞)裂解物对照组，ODN对照组和PBS对照组。肿瘤细胞(Hepa1-6细胞)裂解物对照组小鼠：注射100μl肿瘤细胞(Hepa1-6细胞)裂解物。ODN对照组小鼠：注射100μl含10μg ODN的PBS。PBS对照组小鼠：注射100μl PBS。于第14天，将6.5×105 Hepa1-6细胞接种到小鼠(6～8周龄，雌性)左侧背部皮下。于接种肿瘤后的第19天，用游标卡尺(0.002cm)测量瘤块的长径(long diameter)和短径(short diameter)。肿瘤大小(cm2)＝长径(cm)×短径(cm)。表-6表示的是测量的结果。

表-6寡核苷酸增强的肿瘤细胞(肝细胞癌细胞)裂解物对Hepa1-6细胞生长的抑制作用

                                                肿瘤大小(cm²，

组别                              动物数(n)     x±s)

CpG0800增强的Hepa1-6细胞裂解物    25            0.116±0.091

CpG0800                           25            0.707±0.349

CpG685增强的Hepa1-6细胞裂解物     25            0.280±0.223

CpG685                            25            0.733±0.357

CpG684增强的Hepa1-6细胞裂解物     25            0.315±0.129

CpG684                            25            0.745±0.314

CpG2006增强的Hepa1-6细胞裂解物    25            0.435±0.186

CpG2006                           25            0.781±0.323

CpG1018增强的Hepa1-6细胞裂解物    25            0.316±0.117

CpG1018                           25            0.789±0.403

Hepa1-6细胞                       25            0.682±0.310

PBS                               25            0.870±0.412

结果表明，寡核苷酸增强的肿瘤细胞(肝癌细胞)裂解物在应用于小鼠后，可产生显著的抗肝癌的作用(Student test)。寡核苷酸增强的肿瘤细胞(肝癌细胞)裂解物组和对照组相比，P＜0.05。结果也表明，采用如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5所示的寡核苷酸制备的肝癌细胞裂解物均可产生抗肝癌的作用。

实施例7、寡核苷酸增强的肿瘤细胞(结肠癌细胞)裂解物的抗结肠癌的作用

1、肿瘤细胞裂解物的制备

CMT93细胞是C57BL/6小鼠来源的结肠癌细胞(mouse rectal carcinoma cell line)(ATCC)。用含10％(v/v)灭活的胎牛血清和抗生素(100IU青霉素/ml和100IU的链霉素/ml)的IMDM培养液，在37℃，5％ CO2的条件下培养。将CMT93细胞(1×10⁷/ml)悬浮于1ml PBS(phosphate-buffered saline)中，做4轮冻融处理。方法是，甲醇干冰冰冻，37℃融解。也可采用液氮冷冻。将生成的细胞裂解物用台酚蓝染色，在显微镜下检测无完整的细胞。320g，4℃，离心10分钟。收上清，-70℃保存。ODN可以溶解在PBS中。100μl PBS中含有从1×10⁶ CMT93细胞制备的肿瘤细胞裂解物。

2、寡核苷酸增强的肿瘤细胞(结肠癌细胞)裂解物的抗结肠癌的作用

采用C57BL/6雌性小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行抗肿瘤的实验。在寡核苷酸增强的肿瘤细胞(CMT93细胞)裂解物组小鼠，于第0天和第7天在右侧背部皮下注射0.1ml寡核苷酸增强的肿瘤细胞(CMT93细胞)裂解物(含20μg ODN)，设肿瘤细胞(CMT93细胞)裂解物对照组，ODN对照组和PBS对照组。肿瘤细胞(CMT93细胞)裂解物对照组小鼠：注射100μl肿瘤细胞(CMT93细胞)裂解物。ODN对照组小鼠：注射100μl含10μg ODN的PBS。PBS对照组小鼠：注射100μl PBS。于第14天，将2.5×10⁶ CMT93细胞接种到小鼠(6～8周龄，雌性)右侧背部皮下。从注射肿瘤后的第10天开始用游标卡尺(0.002cm)测量瘤块的长径(long diameter)和短径(short diameter)。肿瘤大小(cm²)＝长径(cm)×短径(cm)。表-7表示的是接种肿瘤后第20天的测量结果。

表-7寡核苷酸增强的肿瘤细胞(结肠癌细胞)裂解物对结肠癌细胞生长的抑制作用

                                              肿瘤大小(cm²，

组别                            动物数(n)     x±s)

CpG0800增强的CMT93细胞裂解物    18            0.316±0.158

CpG0800                         18            0.807±0.163

CpG685增强的CMT93细胞裂解物     18            0.400±0.136

CpG685                          18            0.751±0.157

CpG684增强的CMT93细胞裂解物     18            0.415±0.186

CpG684                          18            0.745±0.142

CpG2006增强的CMT93细胞裂解物    18            0.435±0.167

CpG2006                         18            0.815±0.302

CpG1018增强的CMT93细胞裂解物    18            0.416±0.178

CpG1018                         18            0.789±0.403

CMT93细胞裂解物                 20            0.689±0.303

PBS                             20            0.954±0.309

结果表明，寡核苷酸增强的肿瘤细胞(结肠癌细胞)裂解物在应用于小鼠后，可产生显著的抗结肠癌的作用。寡核苷酸增强的肿瘤细胞(CMT93细胞)裂解物组和对照组相比，P＜0.05。结果也表明，采用如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5所示的寡核苷酸制备的结肠癌肿瘤细胞裂解物均可产生抗结肠癌的作用。

序列表

<110>长春华普生物技术有限公司

<120>寡核苷酸增强的肿瘤细胞裂解物及其治疗肿瘤的用途

<160>5

<210>1

<211>29

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

tcgcgaacgt tcgccgcgtt cgaacgcgg                        29

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

tcgtcgacgt cgttcgttct c                                21

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

tcgacgttcg tcgttcgtcg ttc                              23

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                             24

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

tgactgtgaa cgttcgagat ga                               22