一株短小芽孢杆菌突变株及其发酵生产碱性蛋白酶

摘要

本发明提供了一株高产碱性蛋白酶的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)突变株，并提供了一种利用该菌株发酵制备碱性蛋白酶的方法。属于生物工程技术领域。发明所用菌株是将短小芽孢杆菌1.894菌株，经紫外诱变，筛选得到。以麸皮为主要底物，添加酵母膏、D－果糖、磷酸二氢钾和水分，接种短小芽孢杆菌2080菌株，在接触空气条件下，于温度35℃左右，静态培养48小时左右达到产酶高峰。用Na

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域。

技术背景

蛋白酶是工业用酶中占据比例最大的酶类，大约占全世界每年总销售量的60％左右。碱性蛋白酶在食品、洗涤及制革等行业中有着广泛的用途。目前，碱性蛋白酶的主要产生菌种有芽孢杆菌属细菌、链霉菌(如灰色链霉菌、费氏链霉菌等)以及酵母等。中国专利(申请号：03144206.4)中公开了一种发酵生产高碱碱性蛋白酶的方法，采用的菌种是一株嗜碱性枯草芽孢杆菌。中国专利(申请号：02825897.5)中公开了一种来自芽孢杆菌种(DSM 14392)的芽孢杆菌属型碱性蛋白酶，及其在洗涤剂和清洗剂中的应用。中国专利(申请号：00123404.8)中公开了一株黄杆菌属末知种菌株YS 9412-130可以产生的低温碱性蛋白酶。

我们从中国科学院微生物研究所中国普通微生物菌种保藏中心短小芽孢杆菌1.894菌株(Bacillus pumilus 1.894)，该菌株具有一定的产碱性蛋白酶能力。本发明将该原始菌株进行紫外诱变，得到高产碱性蛋白酶的突变株，目前还没有用该突变株进行发酵生产碱性蛋白酶的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一株具有高产碱性蛋白酶能力的耐碱细菌——短小芽孢杆菌的突变株，并提供一种利用该菌株发酵生产碱性蛋白酶的方法。

该菌株是将短小芽孢杆菌1.894菌株，经紫外诱变，通过稀释涂平板培养和透明圈筛选方法，筛选到碱性蛋白酶高产突变株，其产碱性蛋白酶的能力比原始菌株提高90％，经连续培养性能稳定。菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCCNo.2080。

采用该菌株进行固态发酵生产碱性蛋白酶的步骤如下：

1、菌种保藏。短小芽孢杆菌突变株2080保藏于4℃冰箱内碱性琼脂培养基斜面，半年转接一次。培养基组成(g/L)：胰蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，琼脂15，用20％碳酸钠调节pH＝8.5。于115℃灭菌20分钟。

2、种子培养。培养基组成(g/L)：胰蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，用20％碳酸钠调节pH＝8.5。于115℃灭菌20分钟。接种，30℃摇瓶培养24小时，既得液体种子。

3、固态发酵。产碱性蛋白酶固态培养基：麸皮50g，酵母膏1.5g，D-果糖1.25g，磷酸二氢钾20mg，水125mL，用20％的Na₂CO₃调节pH＝8.5，搅拌均匀，于115℃灭菌20分钟。接种液体种子，混合均匀，于35℃静态培养48小时。

4、酶的提取和净化。固态发酵后的物料，加入10倍重量的pH为10的0.05mol/L的Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲溶液，浸泡30分钟，在高速离心机中进行固液分离，提取液用孔径0.1μm的微滤膜过滤除去菌体，滤液用截留分子量为10000的超滤膜浓缩，收集浓缩液，即碱性蛋白酶溶液，贮藏。

5、蛋白酶活力定义：在50℃、pH 10的反应体系中，每分钟降解酪蛋白释放出的三氯醋酸可溶物在280nm的光密度与1微克酪氨酸相当时，其所需酶的量为一个单位。

以下通过具体实施例详细说明本发明的实施，目的在于帮助读者更好地理解本发明的精神实质，但不作为对本发明实施范围的限定。

实施例1：不同氮源对产酶的影响

向固体培养基中添加不同氮源，替代酵母膏。用20％的Na₂CO₃调节pH＝8.5，搅拌均匀，于115℃灭菌20分钟。接种液体种子，混合均匀，于35℃静态培养48小时。结果见表1。结果表明，酵母膏比较适合碱性蛋白酶的发酵生产。

表1：不同氮源对产酶的影响

    氮源    相对酶活％    不另加氮源    酵母膏    大豆蛋白胨    大豆分离蛋白    牛肉膏    干酪素    胰蛋白胨    硝酸钠    硫酸氨    100    121.5    75.5    77.9    42.4    16.0    46.0    6.8    6.8

实施例2：不同碳源添加对产酶的影响

向固体培养基中添加2.5％重量比的各种碳源。用20％的Na₂CO₃调节pH＝8.5，搅拌均匀，于115℃灭菌20分钟。接种液体种子，混合均匀，于35℃静态培养48小时。结果见表1。当添加D-果糖时产酶率最高，达到1.53万U/g干底物。

表2：各种含果胶生物质及培养基不同湿度对产酶影响

  碳源  酶产率(×10³U/g干底物)  对照(不另加碳源)  麦芽糖  葡萄糖  糊精  淀粉  蔗糖  D-半乳糖  乳糖  D-果糖  玉米粉  10  6.1  7.2  2.5  5.3  8.9  5.5  7.6  15.3  2.8