一种在水/有机介质混合体系中酶催化合成β－内酰胺抗生素的方法

摘要

本发明公开了一种在水/有机介质混合体系中酶催化合成β－内酰胺抗生素的方法，包括将β－内酰胺母核、酰化试剂、水和有机溶剂混合，加入青霉素酰化酶后在－10～45℃反应1～48小时。本发明方法一方面可以有效抑制青霉素酰化酶的水解活性，降低酰化试剂的水解和产物的水解程度，另一方面可以减少溶剂尤其是强极性溶剂对酶表面“必需水”层的剥夺能力，从而获得更好的酶催化活性。与水介质的反应方法相比，本发明方法的合成/水解比值得到了很大提高，降低生产成本。由于水解等副反应受到抑制，副产物减少，产率得以提高，β－内酰胺抗生素的分离过程得到简化。

说明书

技术领域

本发明涉及β-内酰胺抗生素的制备方法，尤其涉及一种采用含少量水的水/有机介质混合体系中酶催化合成β-内酰胺抗生素的方法。

背景技术

现在，工业上半合成的β-内酰胺抗生素如氨苄西林、阿莫西林、头孢克洛、头孢氨苄及头孢羟氨苄都是以化学方法制备，反应过程中涉及到侧链的保护、羧基的活化、缩合反应、和侧链的去保护等步骤，因此生产过程化学反应步骤多，三废排放量大，环境污染严重。

近几年来，已有很多文献报道采用酶法来制备β-内酰胺抗生素。采用酶法制备β-内酰胺抗生素的优点是，反应步骤简单，反应条件温和，避免各种保护试剂和有毒溶剂，环境污染小。

JH Zhu，DZ Wei，XJ Cao，YQ Liu and ZhY Yuan的文章“Partitioningbehaviour of cephalexin and 7-aminodeacetoxicephalosporanic acid inPEG/ammonium sulfate aqueous two-phase systems”(《J.Chem.Technol.Biot.》2000，76，1194-1200)和DZ Wei，JH Zhu，XJ Cao的文章“Enzymaticsynthesis of cephalexin in aqueous two-phase systems”(《Biochem.Eng.J.》2002，11，95-99)分别报道了在PEG 400/硫酸铵的双水相体系、水-40％乙二醇体系中酶催化合成头孢氨苄和头孢克洛的方法。

公开号为CN1207742的中国专利申请中公开了一种酶催化合成β-内酰胺抗生素的方法，该方法在β-内酰胺抗生素从反应混合物回收后，利用反应水溶液中青霉素酰化酶对剩余母液中抗生素的水解作用，将抗生素分解为其起始化合物，特别是β-内酰胺核，从而实现β-内酰胺核的回收、循环利用。

专利申请WO9920786公开了一种酶催化合成头孢菌素的方法，将底物母核通过pH调节，使其达到过饱和浓度，在青霉素酰化酶作用下，与相应侧链酰胺缩合，得到产品。这种方法比不将底物母核调到过饱和浓度，转化率高10％左右，侧链与母核摩尔比不大于2.5。

美国发明专利US6048708公开了一种酶催化合成β-内酰胺抗生素的方法，该方法使抗生素母核与酰基供体的浓度在反应过程中一直保持在饱和浓度的70％甚至85％以上，反应至少5个小时，能够提高母核的转化率。

另外，文献CN1265706，CN1144274，CN1572873，WO9704086和US5525483分别公开了涉及到水溶液介质中高底物浓度下，以及新的固定化青霉素G酰化酶催化下合成β-内酰胺抗生素的方法。

在上述方法中，反应介质大多采用具有一定pH值的水溶液，或者添加少量有机溶剂的水相体系。由于青霉素G酰化酶在水相介质中存在较明显的水解作用，导致生成的β-内酰胺抗生素以及采用酯或酰胺活化的侧链不可避免的会分解成β-内酰胺母核和相应的侧链酸。合成的效率高低可以用合成/水解比值(S/H：合成产物的量与水解产生的侧链酸的量之比)来评价，这两个反应可以用青霉素类抗生素作为示例图解如下：

R1=H：氨苄西林

R1＝OH：阿莫西林

非水相酶催化方法是近年来研究的热点，将非水相介质引入到β-内酰胺类抗生素酶催化合成中可以增加底物的溶解度，降低反应介质中水的活性，有效抑制酰基供体侧链和产物的水解，从而提高合成产率。如C B.Park，S B Lee，D D.Ryu的文章“Penicillin acylase-catalyzed synthesis of cefazolinin water-solvent mixtures：enhancement effect of ethyl acetate and carbontetrachloride on the synthetic yield”(《J.Mol.Catal.B：Enz》2000，9(4-6)，275-281)提到在30％(v/v)的醋酸乙酯或四氯化碳的水相反应体系中头孢唑啉酶催化合成的产率分别提高了65％和56％。美国专利US 5268271公开了基于热力学控制策略(即侧链酸没有经过活化，缩合反应的副产物是水)，水-有机共溶非极性体系中的半合成抗生素酶催化合成，其中有机溶剂浓度30-90％，虽然含的水量较大(超过10％)，但是仍然取得了较好的效果。

但是由于反应体系含的水量较大，反应过程中酰基供体侧链和产物的水解仍然难以控制，产率有待于进一步提高。

发明内容

本发明提供一种收率高，副产物少的利用青霉素酰化酶催化制备β-内酰胺抗生素的方法。

一种在水/有机介质混合体系中酶催化合成β-内酰胺抗生素的方法，包括将β-内酰胺母核、酰化试剂、水和有机溶剂混合，加入30～300IU/ml青霉素酰化酶后在-10～45℃反应1～48小时。

β-内酰胺母核在反应体系中的浓度为50-400mM，酰化试剂与β-内酰胺母核的摩尔比为1.5～4。(出于原料成本考虑，一般酰化试剂的用量比例可适当加大)

本发明方法中所述的青霉素酰化酶可以是现有技术中通用的青霉素酰化酶，例如浙江顺风海德尔有限公司的固定化青霉素G酰化酶。

本发明所述有机溶剂选自异丙醇、叔丁醇、叔戊醇、2，2-二甲基-1-丙醇、2-甲基-1-丙醇、丙三醇、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、二氧六环、乙酸乙酯、乙酸丙酯、C4～C18直链或支链烷烃、环己烷、氯仿或二氯甲烷中的一种或多种。

本发明也采用混合溶剂，合适极性的混合溶剂搭配可以对酶的催化性质有更好的调节作用。本发明的混合溶剂选自由极性的醇、酯和非极性的C₅～C₁₈直链或支链烷烃溶剂组成。极性溶剂在混合溶剂中的合适比例为20-60％(v/v)。

本发明的方法其反应是在含微量水的水/有机溶剂体系中实施。所述的水在整个反应体系中的质量百分比的含量为0.3％～10％，优选1％～5％。所述的水可以是pH为3.0-8.0水或缓冲溶液。

这个水量是经过在不同含水量的体系中酶催化活性的考察后确定的，含微量水的反应体系一方面可以有效抑制酰化酶的水解活性，提高合成水解比值，另一方面可以减少溶剂尤其是强极性溶剂对酶表面“必需水”层的剥夺能力，从而获得更好的酶催化活性。

本发明所述的β-内酰胺母核是具有结构式(A)或结构式(B)的化合物，可从市售购得，也可分别通过发酵青霉素或头孢菌素衍生物的酶催化水解而获得。

本发明所述的酰化试剂是具有结构式(C)的化合物。

具有结构式(A)的化合物与结构式(C)的化合物反应生成具有结构式(D)β-内酰胺抗生素。

具有结构式(B)的化合物与结构式(C)的化合物反应生成具有结构式(E)β-内酰胺抗生素。

反应式如下：

结构式(D)中的取代基R1与结构式(C)中的取代基R1具有相同含义；

结构式(E)中的取代基R1与结构式(C)中的取代基R1具有相同含义；

结构式(E)中的取代基R2与结构式(B)中的取代基R2具有相同含义；

在结构式(B)中：

R2为氢原子、卤原子、甲氧基、C1～C4烷基、取代或非取代的烯基、4-6元环基或杂环基。

卤素原子是氟、氯、溴或碘；C1～C4烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基；取代或非取代的烯基是乙烯基、丙烯基、1-丁烯基或1-氯-丙烯基等。4～6元环基或杂环基是苯基、对羟基苯基、1，2，3-三唑基、5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基硫亚甲基或1，2，3-三唑-4-基硫亚甲基等。

结构式(C)中：

R1为取代或非取代的6元环基或杂环基。

取代或非取代的6元环基是指苯基或对羟基苯基；

杂环基是1H-四氮唑基。

R3为C1～C4烷氧基、氨基、酯基、氧乙烯基、烷基取代氧乙烯基或肟基。

酯基是乙酸酯基、丙酸酯基等。

烷基取代氧乙烯基是异丙烯氧基等。

肟基是丙酮肟基。

本发明方法一方面可以有效抑制青霉素酰化酶的水解活性，降低酰化试剂的水解和产物的水解程度，另一方面可以减少溶剂尤其是强极性溶剂对酶表面“必需水”层的剥夺能力，从而获得更好的酶催化活性。与水介质的反应方法相比，本发明方法的合成/水解比值得到了很大提高，降低生产成本。由于水解等副反应受到抑制，副产物减少，产率得以提高，β-内酰胺抗生素的分离过程得到简化。

具体实施方式

实施例1  在含2％水的叔戊醇中阿莫西林的酶催化合成

将2.16克6-APA(10mmol)和3.6克D-对羟基苯基甘氨酸甲酯(20mmol)(通式(C)化合物，其中R1为对羟基苯基，R3为甲氧基，缩写D-HPGM)加入到经过分子筛除水的98ml分析纯叔戊醇中。然后，向反应体系中加入2ml水，将反应的混合物置于恒温培养箱中振荡5分钟使得各个物质得到良好的分散，添加0.1g/ml的青霉素G酰化酶，在10℃下反应12小时，液相色谱测定阿莫西林产率88％，阿莫西林的合成产物和D-对羟基苯甘氨酸甲酯的水解产物的摩尔比选择性为1.6(相比之下，对于普通条件下水介质中为0.6左右)。

实施例2  在含10％水的叔戊醇中阿莫西林的酶催化合成

将2.16克6-APA(10mmol)和3.6克D-HPGM(20mmol)加入到经过分子筛除水的90ml分析纯叔戊醇中。然后，向反应体系中加入10ml水，将反应的混合物置于恒温培养箱中振荡5分钟使得各个物质得到良好的分散，添加0.1g/ml的青霉素G酰化酶，在10℃下反应8小时，液相色谱测定阿莫西林产率83％，阿莫西林的合成产物和D-对羟基苯甘氨酸甲酯的水解产物的摩尔比选择性为1.4(相比之下，对于普通条件下水介质中为0.6左右)。

实施例3  在含2％水的乙酸乙酯中氨苄西林的酶催化合成

将2.16克6-APA(10mmol)和3.3克D-苯基甘氨酸甲酯(20mmol)(通式(C)化合物，其中R1为苯基，R3为甲氧基，缩写D-PGM)加入到98ml分析纯乙酸乙酯(含水量＜0.1％)。然后，向反应体系中加入2ml的pH6.5的磷酸缓冲溶液，将反应的混合物置于恒温培养箱中振荡5分钟，添加0.1g/ml的青霉素G酰化酶，在10℃下反应8小时，液相色谱测定氨苄西林产率93％，氨苄西林的合成产物和D-苯甘氨酸的水解产物的摩尔比选择性为2.0(相比之下，对于普通条件下水介质中为1.2左右)。

实施例4  在水/乙酸乙酯/环己烷(4/68/28，v/v)混合溶剂中氨苄西林的酶催化合成

将2.16克6-APA(10mmol)和3.3克D-PGM(20mmol)加入到96ml乙酸乙酯/环己烷(68/28，v/v)混合溶剂中。然后，向反应体系中加入4ml水，将反应的混合物置于恒温培养箱中振荡5分钟，添加0.1g/ml的青霉素G酰化酶，在10℃下反应8小时，液相色谱测定氨苄西林产率97％，氨苄西林的合成产物和D-苯甘氨酸的水解产物的摩尔比选择性为2.3(相比之下，对于普通条件下水介质中为1.2左右)。

实施例5  在含2％水的乙酸丁酯中头孢氨苄的酶催化合成

将2.14克7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(10mmol)(通式(B)化合物，其中R2为甲基，缩写7-ADCA)和3.0克D-苯基甘氨酸甲酰胺(20mmol)(通式(C)化合物，其中R1为苯基，R3为氨基，缩写D-PGA)加入到经过分子筛除水的98ml乙酸丁酯中，然后，向反应体系中加入2ml的pH6.5的磷酸缓冲溶液，将反应的混合物置于恒温培养箱中振荡5分钟，添加0.1g/ml的青霉素G酰化酶，在15℃下反应18小时，液相色谱测定头孢氨苄产率98％，合成水解比值为2.5。

实施例6  在含3％水的叔丁醇中头孢羟氨苄的酶催化合成

将2.14克7-ADCA(10mmol)和3.32克D-对羟基苯基甘氨酸甲酰胺(20mmol)(通式(C)化合物，其中R1为对羟基苯基，R3为氨基，缩写D-HPGA)加入到经过分子筛除水的97ml叔丁醇中。然后，向反应体系中加入3ml的pH6.5的磷酸缓冲溶液，将反应的混合物置于恒温培养箱中振荡5分钟，添加0.1g/ml的青霉素G酰化酶，在15℃下反应12小时，液相色谱测定头孢氨苄产率92％，合成水解比值为2.1。

实施例7  在水/叔丁醇/异辛烷(2/49/49，v/v)混合溶剂中头孢克罗的酶催化合成

将2.14克3-氯-7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸3-Cl-7-ADCA(10mmol)和3.3克D-PGM(20mmol)加入到经过分子筛除水的98ml叔丁醇-异辛烷(49/49)中。然后，向反应体系中加入2ml的pH6.5的磷酸缓冲溶液，将反应的混合物置于恒温培养箱中振荡5分钟使得各个物质得到良好的分散。添加0.1g/ml的青霉素G酰化酶，在15℃下反应14小时，液相色谱测定头孢克罗产率88％，合成水解比值为3.2。