用蛋白质水解物对阴离子多糖的胶凝化

摘要

本发明提供了包含阴离子多糖及一定量的肽材料的亲水胶体组合物。这些亲水胶体组合物可适宜地用于使含水体系胶凝和/或稠化。所述阴离子多糖和所述肽之间在含水体系中的相互作用会产生交联聚合物网络结构。根据本发明，肽通常通过将蛋白质组合物水解并随后任意地从中分离或纯化出阳离子馏分来获得。本文公开了本发明胶凝和/或稠化的含水体系在例如食品、饮料、胶囊及药物组合物和/或化妆品组合物中的用途。

说明书

发明领域

本发明涉及使亲水胶体组合物胶凝和/或稠化的领域。更具体地说，本发明涉及使用肽材料作为用以使含水阴离子多糖组合物胶凝和/或稠化的交联剂的用途。因此，本发明提供包含阴离子多糖及一定量的肽材料的亲水胶体组合物，以及包含所述亲水胶体组合物的胶凝和/或稠化含水体系，包括例如食品。

发明背景

亲水胶体如蛋白质和多糖如要在医药、化妆品和食品工业中应用，亲水胶体分子之间的相互作用意义重大。许多亲水胶体能够稠化含水体系和/或形成水凝胶。水凝胶是显示类固体行为的亲水胶体含水网络结构，其特征强度视其浓度而定，其硬度和脆度视所存在的亲水胶体的结构而定。

凝胶按其最普通的定义被描述为至少两种组分的混合物，其中一种组分是数量占大多数的液体。此外，凝胶会显示固体或类固体行为。为了显示这一固体或类固体行为，微量组分必须形成空间填充三维网络结构。由于这一网络结构在液相中的共存，凝胶在低应力值下表现得象弹性固体，但在限定的屈服应力以上，凝胶会变成粘稠液体。

水凝胶通常通过将亲水胶体进行分散和水合，随意地进行加热和冷却来制备。随后亲水胶体形成三维聚合物网络结构，各个聚合物链之间存在化学或物理交联，从而产生宏观水凝胶。聚合物链之间的这种交联可以是任何化学或物理相互作用，包括共价键合、离子键合、氢键合、疏水缔合、偶极-偶极相互作用和范德华相互作用。因此，根据将网络结构保持在一起的相互作用的类型，凝胶可分成两类。

化学凝胶通过聚合物或无机氧化物的稀溶液的共价交联形成，由于网络结构的共价性质，化学凝胶是热不可逆的。多聚羧酸的共价交联的实例可在FR 2 752 843中找到。在所述文献中，使用了包含至少两种胺基团，例如多聚赖氨酸或多聚鸟氨酸的交联剂。该方法包括将多聚羧酸、活化剂和交联剂在聚羧酸和交联剂之间的共价键得以形成的条件下进行组合。这样形成的交联共聚物不溶于含水体系，作为沉淀物而获得。FR 2 752 843并没有公开用这些交联共聚物来形成(化学)凝胶。

在物理凝胶中，构成网络结构的亚单位通过非共价相互作用保持在一起。许多由聚合物、蛋白质、表面活性剂、有机小分子甚至矿物粘土形成的凝胶都属于这一类。

一般来说，基于阴离子多糖来形成物理凝胶，要依靠阳离子交联剂来将具有阴离子官能团如-SO₃H和-COOH的链交联到网络结构中。

最常用的交联剂包括单价或多价金属离子。对于大多数类型的阴离子多糖，二价阳离子能更为有效地促进胶凝作用，而其它类型则是用单价金属阳离子进行胶凝更为有效。三价金属阴离子经常发现会造成沉淀。胶凝强度和熔化温度都随金属阳离子浓度的增加而提高。

使用具有一个或多个阳离子残基的有机聚合物化合物来使阴离子多糖交联，这已有描述。在US 4,996,150中，描述了包囊在由阴离子多糖和阳离子聚合物构成的珠粒的生物催化剂系统。阳离子聚合物可以是任何聚烷胺(polyalkane amine)和/或聚烷亚胺(polyalkane imine)。

US 4,138,292描述了凝胶基质中的固定化酶和微生物，所述凝胶基质通过使硫酸多糖水溶液与铵离子、金属离子、水溶性胺或水混溶性有机溶剂接触而获得。根据这个文献，这种多糖的代表性实例包括卡拉胶、红藻胶和硫酸纤维素。用以使多糖胶凝或固化的合适的有机胺包括碳数为1-20的烷基二胺、氧肟酸盐、酰肼、碱性氨基酸的烷基酯或酰胺、肽和聚亚烷基亚胺。根据US 4,138,292可应用的肽的合适实例包括赖氨酰-赖氨酸、组氨酰-赖氨酸、组氨酰-精氨酸、组氨酰-精氨酰-赖氨酸和多聚赖氨酸。

水凝胶的具体性质，即粘度、弹性、硬度、外观等方面的性质，受到多种因素的影响，包括多糖的选择、交联剂的选择、pH、固形物含量等。公认的是需要控制胶凝速度，胶凝速度会影响例如所得凝胶的机械强度和孔径大小。对于许多应用，如在生物医学、医药、食品和化妆品配方中的应用，必需的/优选的胶凝速度落在相对较窄的参数范围内。已报道的控制胶凝速度的因素包括例如含阳离子化合物的溶解性、阳离子浓度、含阳离子化合物的混合物/比例、聚合物浓度、胶凝温度、剪切力的应用等。

发明内容

经过详尽的研究和实验，本发明人发现可以通过适当地使用“交联”肽对含有阴离子多糖的含水组合物进行胶凝和/或增稠。更具体地说，本发明提供了含有阴离子多糖和肽的亲水胶体组合物，其中所述肽通常通过将蛋白质组合物水解然后任意地从中分离或纯化出阳离子馏分来获得。此外，还公开了本发明亲水胶体体系作为增稠剂和/或胶凝剂的用途。

含有多糖和蛋白质、用以通过复凝聚法对微粒进行微囊化的组合物是胶体化学领域中公知的。一般来说，凝聚是指胶态分散体发生相分离形成两个液相的现象，即一个相寡含聚合物(胶体)和富含溶剂，另一个相则包含集中在聚合物中的凝聚液滴。胶体凝聚可通过多种方式产生，包括改变温度或pH或者添加另一高分子化合物。通常会出现形成高分子复合物和相分离的倾向，随着聚合物电荷密度和聚合物分子量(MW)而增加。聚合物MW的增加可降低凝聚所需的电荷密度。

Thu等(“Alginate polycation microcapsules I.Interaction betweenalginate and polycation”，Biomaterials，17(1996)，1031-1040)和Girod等(“Polyelectrolyte complex formation between iota-carrageenan andpoly(L-lysine)in dilute aqueous solutions：a spectroscopic and conformationalstudy”，Carbohydrate Polymers 55(2004)37-45)分别描述了通过使聚(L-赖氨酸)和藻酸盐或卡拉胶形成复合物来制备药物递送微胶囊。Girod等人在他们的工作中研究了聚-L-赖氨酸(PLL)和ι-卡拉胶在所形成的复合物可溶的浓度范围内的相互作用。有关包含PLL和ι-卡拉胶的相分离体系的研究，特别是关于诸如pH、离子强度、电荷密度和分子量对相分离程度的影响的研究，先前已有描述。

Tokaev等(“Study of complex formation by food proteins by gel filtrationand ultracentrifugation”，FSTA database 89-1-10-a0021；IFIS(1987))描述了用甜菜果胶和/或低糖化淀粉与酪蛋白水解物形成复合物。更具体地说，Tokaev等人用凝胶过滤法研究了这些可溶性复合物的形成，还通过沉淀分析法研究了含有这些可溶性复合物的乳液的稳定性。由于所形成的复合物能通过凝胶过滤法分离，它们在含水体系当中必定作为离散单元(或凝聚物)而存在。根据Tokaev等人，酪蛋白水解物含有20-25kDa肽片断。

Girod等人和Tokaev等人所描述的体系不能形成凝胶。本发明的亲水胶体组合物在含水体系中的增稠和/或胶凝并不包含宏观的相分离。

具体实施方式

因此，本发明首先涉及亲水胶体组合物的胶凝和/或增稠，所述组合物以其干重计包含1-95wt％的阴离子多糖和1-95wt％的分子量在0.3-12kDa范围内的交联肽，其中所述肽以其所包含的氨基酸残基总量计包含总量为2.5-40mol％的赖氨酸、组氨酸和精氨酸。

本文所用的术语“增稠的”和“使......增稠”分别指含水体系或组合物的增加的粘度和指使含水组合物的粘度增加(或者使含水组合物稠化)。因此这些术语在本文中分别可与术语“稠化的”和“使......稠化”互用。

本文所用的术语“阴离子多糖”是指任何类型的包含能在含水体系中携带一个或多个阴电荷的官能团，例如羧基基团、磷酸根基团和/或硫酸根基团的多糖。阴离子多糖可从任何来源衍生和/或可通过对多糖的修饰例如衍生化获得。优选本发明的阴离子多糖选自卡拉胶、藻酸盐、琼脂、果胶、改性果胶、结冷胶、黄原胶、红藻胶、纤维素衍生物特别是羧甲基纤维素(CMC)和硫酸纤维素、硫酸葡聚糖、改性淀粉、表多糖和它们的混合物。

根据另一个实施方式，本发明组合物含有平均每个单糖含有不超过1.5个、更优选不超过1.0个上述(阴离子)官能团的阴离子多糖。

本发明人发现，任何能用来在金属阳离子存在下使含水体系增稠和/或胶凝的阴离子多糖都可适宜地用来在本发明的交联肽存在下使含水体系增稠和/或胶凝。因此，根据一个更为优选的实施方式，本发明胶凝和/或增稠亲水胶体组合物所包含的阴离子多糖选自卡拉胶、CMC、果胶、黄原胶、结冷胶、琼胶和它们的混合物，更优选选自卡拉胶、CMC、黄原胶、结冷胶、琼胶和它们的混合物。

根据一个最优选的实施方式，提供了一种胶凝亲水胶体组合物，其中的阴离子多糖选自κ-卡拉胶、ι-卡拉胶、ι/κ-混合卡拉胶、结冷胶和它们的混合物。

众所周知，由超过一种多糖组成的体系会显示独特的多重非加和性质，这些性质产生增稠性能或混合流变能力和具有感官和加工优点的质地。因此，亲水胶体组合物可适宜地包含上述阴离子多糖和非阴离子多糖或阳离子多糖的混合物。

本发明提供的亲水胶体组合物以其干重计包含至少1wt％的阴离子多糖，更优选至少5wt％，还更优选至少10wt％，最优选至少25wt％。优选以组合物的干重计阴离子多糖的数量不超过95％，更优选不超过90wt％，最优选不超过75wt％。

上文提到，本发明亲水胶体组合物包含1-95wt％的分子量在0.3-12kDa范围内的交联肽，所述肽包含总量为2.5-40mol％的赖氨酸、组氨酸和精氨酸。根据一个优选实施方式，所述肽通过将蛋白质组合物水解，接着任意地从中分离阳离子馏分来获得。根据本发明，来自于任何来源的蛋白质组合物都可适宜地加以使用。

因此，根据一个特别优选的实施方式，本发明的交联肽包含在水解蛋白质组合物中或在从其分离出的阴离子馏分中，其中所述蛋白质组合物包含选自谷物蛋白质、蛋清蛋白质、乳蛋白质(包括酪蛋白和乳清蛋白质)、大豆蛋白质、豌豆蛋白质、马铃薯蛋白质、玉米蛋白质、明胶及它们的混合物中的一种或多种。

上述蛋白质可用专业技术人员熟知的任何方式进行水解，这些方式通常包括酶法处理，例如用胰蛋白酶或胃蛋白酶处理，或者化学水解，例如用盐酸水解，然后用氢氧化物中和。根据本发明，特别优选酶法水解蛋白质组合物，最优选用胃蛋白酶水解。这种酶已知能从蛋白质如酪蛋白和乳铁蛋白产生合适的阳离子片断。

根据本发明，重要的是蛋白质不被完全水解，即被水解成游离氨基酸。前文提到，肽的分子量在0.3-12kDa的范围内，在更为优选的实施方式中，所述分子量在0.5-10kDa的范围内。在最优选的实施方式中，所述分子量在0.5-8.0kDa的范围内。

与任何涉及合成肽用于使阴离子多糖胶凝的用途的现有技术公开内容不同的是，本发明的交联肽并不仅是由具有阳离子侧链的氨基酸残基组成。更具体地说，本发明的交联肽以其所包含的氨基酸残基总量计包含总量为2.5-40mol％的赖氨酸、组氨酸和精氨酸，优选所述数量范围为2.5-25mol％，更优选为5-25mol％，最优选为10-25mol％。

由于本发明的交联肽通常通过将蛋白质组合物水解而获得，所述交联肽通常不包含能被自然界中的核酸序列编码的氨基酸残基以外的任何氨基酸残基，即不包含选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val以外的氨基酸残基。因此，根据特别优选的实施方式，本发明的交联肽包含至少90mol％、更优选至少95mol％、还更优选至少98mol％、最优选至少99mol％的能被一个或多个核酸序列编码的氨基酸残基。

亲水胶体组合物除包含1-95wt％的前文定义的交联肽之外，还可包含其它蛋白质材料。本文所用的术语“蛋白质材料”指任何类型的包含蛋白质、肽和/或游离氨基酸的材料。

通常，也可以不应用包含本发明肽的蛋白质水解物，而是根据本发明使用蛋白质水解物的阳离子馏分。所述馏分可用专业技术人员熟知的任何常规方法从水解物纯化或分离得到。本文所用的术语“阳离子馏分”指与原料相比其特征为具有阳离子侧链的氨基酸残基即组氨酸、精氨酸和赖氨酸的含量相对较高的馏分。通常，本发明的蛋白质水解物的阳离子馏分包含总量在10-25mol％的赖氨酸、组氨酸和精氨酸。纯化或分离阳离子馏分的合适方法包括制备型离子交换色谱、电膜过滤、电渗析。

本发明提供的亲水胶体组合物以其干重计包含至少1.0wt％、优选至少5.0wt％、更优选至少10wt％，最优选至少25wt％的前文定义的交联肽。优选以组合物的干重计所述交联肽的数量不超过95wt％、更优选不超过90wt％、最优选不超过75wt％。

根据本发明，阴离子多糖和交联肽以1.0∶15.0～15.0∶1.0、更优选1.0∶10.0～10.0∶1.0、更优选1.0∶5.0～5.0∶1.0的重量比进行应用。

本发明的另一个优选实施方式涉及前文定义的亲水胶体组合物，选择其中所述阴离子多糖和所述肽的重量比，使得每克阴离子多糖为0.01-75mmol赖氨酸、组氨酸和精氨酸，更优选每克阴离子多糖为0.1-25mmol，最优选每克阴离子多糖为0.1-25mmol。

根据特别优选的实施方式，本发明的亲水胶体组合物不包含任何偶联剂，如传统上用于肽的合成的那些偶联剂。更具体地说，本发明的亲水胶体组合物不包含任何碳化二亚胺、喹啉衍生物和/或混合酸酐如氯甲酸酯。

本发明的另一个方面涉及制备亲水胶体组合物的方法，所述方法包括将蛋白质组合物水解至获得平均分子量在0.3-12kDa范围内的肽的程度，通常水解至水解度(DH)在5-40％之间，和将所述水解蛋白质组合物与阴离子多糖以.0∶15.0～15.0∶1.0的比例进行组合。术语“水解度”(DH)是指被切割的肽键的百分数。用以测定DH的方法是Adler-Nissen，J.，“Determinationof the Degree of Hydrolysis of Food Protein Hydrolysates byTrinitrobenzenesulfonic Acid”，J.Agric.Food Chem.，Vol.27，No.6，1979，第1256-62页中描述的TNBS比色法。蛋白质被水解越多(较高DH)，平均分子量越低；肽谱(peptide profile)因此改变。优选水解度在7-30％之间。前文提到，优选所述蛋白质组合物通过酶法进行水解，最优选用胃蛋白酶水解。为实现所需水解度所必要的条件和温育时间可容易地由技术人员确定。

根据优选的实施方式，所述方法还包括从水解蛋白质中分离阳离子馏分并将所述馏分与本发明阴离子多糖进行组合。

本发明的又一个方面涉及可通过上文描述的方法获得的亲水胶体组合物。

因此，根据本发明，阴离子多糖聚合物通过肽进行交联，本发明的亲水胶体组合物的特征是，其可用低浓度的盐进行应用。因此，根据优选的实施方式，组合物包含不超过10mmol/克选自Na⁺、K⁺和Ca²⁺的金属阳离子阴离子多糖的，更优选不超过6mmol/克阴离子多糖。

根据本发明，提供了包含本发明亲水胶体组合物的胶凝或增稠含水组合物。更具体地说，本发明的一个方面涉及以其总重量计包含0.01-10wt％的阴离子多糖和0.01-40wt％的分子量在0.3-12kDa范围内的交联肽的胶凝或增稠含水组合物，其中所述肽以其所包含的氨基酸残基总量计包含总量为2.5-40mol％的赖氨酸、组氨酸和精氨酸。

根据优选的实施方式，本发明的胶凝或增稠含水体系通过将亲水胶体组合物与所述含水体系进行组合来制备。优选含水体系的pH在3.0-8.5的范围，更优选4.0-8.0，最优选4.0-7.0。当加入亲水胶体组合物时，可将含水体系进行加热和/或可对其施加剪切力，以改进阴离子多糖的水合作用。如果让亲水胶体组合物的含水分散体冷却和/或如果不再施加剪切力，含水体系将开始发生稠化或固化。

本发明的亲水胶体组合物可适宜地用于掺入到各种类型的食品中，以提供质地、结构、粘度、弹性和/或稳定性。因此，本发明的另一个方面涉及以其总重量计包含0.01-95wt％的前文定义的胶凝或增稠含水亲水胶体组合物的食品。通常该食品是连续水相食品(water continuous foodstuff)。合适的实例包括甜点、调味品、冰淇淋和饮料。

由于根据本发明，胶凝或增稠组合物适宜地不用添加金属阳离子来制备，所述水凝胶可有利地应用于低盐食品即极少含有或不含有NaCl的食品，如通常应用于给患有心脏衰竭、肝功能受损、高血压、急性和慢性肾病等的人使用的膳食。因此，本发明的一个特别优选的实施方式涉及包含本发明含水亲水胶体组合物的食品，所述食品包含不超过30mM、优选不超过15mM的选自Na⁺、K⁺和Ca²⁺的金属阳离子。

本发明亲水胶体组合物可适宜地用于将用以催化各种转化作用的酶和/或微生物包载在凝胶基质当中而使它们固定化。或者，本发明的亲水胶体组合物可用于制备包含治疗和/或诊断用药的微胶囊，例如药物控释用微胶囊。因此，本发明的另一个方面涉及包含活性成分和装载活性成分的基质的胶囊，所述基质包含0.5-95wt％的阴离子多糖和0.5-95wt％的分子量在0.3-12kDa范围内的肽，其中所述肽以其所包含的氨基酸残基总量计包含总量为2.5-40mol％的赖氨酸、组氨酸和精氨酸。可有利地包囊在本发明的基质中的活性成分包括药物、疫苗、酶、激素、寡核苷酸、维生素等。

在又一个另选实施方式中，本发明的胶凝或增稠含水亲水胶体组合物可用于制备供局部应用到皮肤的化妆品组合物或治疗组合物。因此，本发明的又一个方面涉及包含治疗剂或美容剂的前文定义的含水亲水胶体组合物。

本发明的另一个方面涉及前文定义的分子量在0.3-12kDa范围内和以其所包含的氨基酸残基总量计包含总量为2.5-40mol％的赖氨酸、组氨酸和精氨酸的肽，用于改进阴离子多糖的胶凝和/或稠化特性的用途。

本发明在以下实施例中得到进一步的说明，这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例 1

将市售的蛋白质水解物Hyfoama 66(出自Quest B.V.Naarden，荷兰)以25mg/ml的量在不同pH值(pH 5.8、pH 7.0和pH 8.0)下加入到ι-卡拉胶水溶液(0.5％w/v)中。Hyfoama 66的特性(即水解物中所包含的各片断的分子量分布和组氨酸、精氨酸和赖氨酸的数量(mol％))在另一实验中测定。这些结果在实施例2中给出。Hyfoama 66通过加热到60℃而溶于卡拉胶溶液中。目视检查室温下Eppendorf管(2ml)中的凝胶形成。

观察到ι-卡拉胶在25mg/ml的Hyfoama 66浓度下在pH 5.8、pH 7.0和pH 8.0下形成凝胶。

实施例2

从4种蛋白质水解物——Hyfoama 66、酪蛋白酸钠、乳铁蛋白和蛋清蛋白质(EWP)制备阴离子馏分。测试肽馏分对卡拉胶胶凝化的作用。此外，分析阳离子肽馏分的氨基酸组成和通过GPC法分析其分子量分布。

将10克的酪蛋白酸钠和EWP和乳铁蛋白与胃蛋白酶(5％蛋白质，pH 3)一起在37℃下温育4小时进行水解。将pH调至7.0使胃蛋白酶失活。在对阳离子馏分进行色谱分离之前和对此馏分进行分离之后，对水解物进行透析(MWCO 100)。透析继续进行到电导率[μS/cm]达到稳定值。将脱盐的水解物及其阳离子馏分进行冷冻和低压冻干。将这三种脱盐的新制备水解物和Hyfoama 66进行分级分离。将脱盐的水解物溶于50mM乙酸钠缓冲液(pH 4.5)中。通过离心和过滤(0.45μm)除去不可溶材料，滤液用色谱系统kta(Amersham)加载到填充HiTrap SP(Amersham)的柱上。用相同的缓冲液洗涤该柱后，用含有1M NaCl的50mM乙酸钠缓冲液(pH 4.5)洗脱阳离子馏分。

分子量分布用排阻色谱法(NIZO food research-method：Visser et al inJournal of Chromatography 599(1992)205-209)测定。通过使用分子量已知的标记蛋白质，确定出对应于分子量为5和10kDa的蛋白质片断的洗脱时间。用这些时间将各片断分成三类：＞10kDa、10-5kDa和＜5kDa。表1显示这三类不同水解物及其阳离子馏分的分布。从水解物获得的阳离子馏分都富含分子量＞5kDa的片断。

表1：各水解物及其阳离子馏分的分子量分布

  样品  面积(占总面积的％)  面积＞10  kDa  10kDa＞面积＞5  kDa  面积＜5kDa   酪蛋白酸钠水解物  26  18  56  乳铁蛋白水解物  33  18  49  EWP水解物  48  13  39  Hyfoama 66  39  21  40  酪蛋白酸钠阳离子馏  分  18   38   44   乳铁蛋白阳离子馏分  39  28  33  EWP阳离子馏分  53  18  28  Hyfoama 66阳离子  馏分  57   22   22 

各水解物及其阳离子馏分中的氨基酸组成的测定由Ansynth serviceB.V.按照酸水解方法进行。各水解物及其阳离子馏分中的阳离子氨基酸(Lys、His和Arg)百分数在表2中显示。

表2：不同蛋白质来源及其阳离子馏分中的阳离子氨基酸mol％

  样品  mol％Lys-His-Arg/总量  蛋白质  阳离子馏分  Hyfoama  NaCas  Kip-eiwit  乳铁蛋白  5.3  11.7  12.3  15.9  10.4  18.9  17.1  18.8

用κ-和ι-卡拉胶评估所制备的阳离子馏分对阴离子多糖的胶凝化行为的作用。通过倾析来目视检查室温下Eppendorf管(2ml)中的凝胶形成。表3给出了阳离子肽对卡拉胶的胶凝化的作用的评估结果。在所有情况下的所应用浓度范围中，都可观察到因添加阳离子馏分所致的胶凝化。并发现凝胶特性上的差异取决于阳离子馏分的浓度。还发现了外观上的差异。衍生自EWP和乳铁蛋白的阳离子馏分造成了混浊凝胶的形成，而Hyfoama 66和酪蛋白酸钠的阳离子馏分则产生透明凝胶。

表3：不同阳离子肽馏分对κ-卡拉胶和ι-卡拉胶(0.5％(w/v))的胶凝化行为的作用

  阳离子馏  分  阳离子馏分浓度[mg]/[mL]κ-卡拉胶0.5％   10  25  评论  Hyfoama  +  +/-  透明  Na-Cas  +  -  透明  EWP  +  ++  混浊  乳铁蛋白  ++  ++  混浊

  阳离子馏  分  阳离子馏分浓度[mg]/[mL]ι-卡拉胶0.5％ 

  10  25  评论  Hyfoama  +  +  透明  Na-Cas  +  +  透明  EWP  +  +  混浊  乳铁蛋白  +  +  混浊

评分：

-无胶凝化

+/-弱胶凝化/沉淀

+弱凝胶

++强凝胶

实施例3

应用乳铁蛋白的阳离子馏分来评估对其它阴离子多糖的作用。评估了一系列的五个阴离子多糖制品。目视检查室温下Eppendor管(2ml)中的凝胶形成。结果在表4中显示。观察到添加乳铁蛋白水解物的阳离子肽馏分可引起ι/κ-混合卡拉胶、黄原胶和结冷胶的胶凝化。

表4：乳铁蛋白阳离子肽馏分对不同阴离子多糖(0.5％(w/v))的胶凝化行为的作用

  多糖  10mg/mL  50mg/mL  评论  1.ι/κ-混合卡拉胶  V  +  混浊弱凝胶  2.黄原胶  V  +V  粘度增加  3.LM果胶  -  V  4.结冷胶  ++  ++  透明凝胶  5.琼胶  凝胶颗粒  凝胶颗粒

-无胶凝化

+/-弱胶凝化/沉淀

+弱凝胶

++强凝胶

V粘度增加

实施例4

应用完整的蛋白质和合成法制备的聚-L-赖氨酸(Sigma-Aldrich，Zwijndrecht，荷兰)来评估它们对κ-、ι-和λ-卡拉胶(0.5％(w/w)的作用。目视检查室温下Eppendorf管(1.5ml)中这些混合物的行为。结果在表5中显示。在所有情况下都观察到复合物形成。混合阴离子卡拉胶和阳离子肽或聚-L-赖氨酸时的复合物形成，导致溶液中形成浑浊的微白色或微红色(在细胞色素c情况下)材料。

表5：肽和聚-L-赖氨酸对卡拉胶(0.5％(w/v))的行为的作用

  蛋白质  卡拉胶  κ  ι  λ  细胞色素c  复合物形成  复合物形成  复合物形成  溶菌酶  复合物形成  复合物形成  复合物形成  聚-L-赖氨酸13kDa  复合物形成  复合物形成  复合物形成  聚-L-赖氨酸405  kDa  复合物形成   复合物形成   复合物形成