一种棉花幼胚离体培养和植株形成的培养基及培养方法

摘要

本发明公开一种棉花幼胚离体培养和植株形成的培养基及培养方法，它是在对培养基中的大量元素、微量元素、氨基酸、植物激素、糖类等各个组成成分进行多次正交设计及梯度试验基础上得到的。其培养基中大量元素是MS培养基中大量元素的一半；微量元素和MS培养基相同；有机成分与B5培养基的有机成分及用量相同；应用脯氨酸、谷氨酰胺等对幼胚发育及植株形成有利的营养成分；配合一定用量的植物激素和棉花幼铃干燥处理等培养方法，实现了棉花离体幼胚的直接萌发和植株形成。用此培养体系培养开花后20～25天的棉花离体幼胚，可使幼胚直接萌发并发育形成植株，其幼胚成苗率达40％以上。

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养方法及培养基，特别涉及一种棉花幼胚离体培养和植株形成的专用培养基及其培养方法。

背景技术

棉花属锦葵科(Malvaceae)、棉属(Gossypium)。除4个常用的栽培种外，还有30多个野生种。棉属野生种和近缘种中蕴藏着许多抗盐、抗旱和抗病虫优良基因，将这些有益基因通过种间杂交转育到栽培种中，是拓宽棉花遗传基础的有效途径。但由于种属间的遗传隔离，杂种胚常常败育致使杂交难以成功。幼胚(珠)离体培养技术通过人为改善幼胚发育条件，提供幼胚发育必需的营养物质，促使幼胚发育成植株，为创造遗传新种质提供一条重要途径。将幼胚培养技术应用于常规育种程序中，可节省棉花种子成熟和种子萌发前的休眠时间，在不影响世代间选择程序的情况下，缩短棉花植株的发育周期，从而加快育种进程，提高育种效率，快速培育棉花新品种。

棉花的幼胚离体培养有多种培养方法和培养基。其中，用于棉花幼胚离体培养的培养基有Mauney培养基(Mauney JR.Botanical Gazette，122：205～209，1961)、MS培养基(Aher AR，Pawar SV，Patil SC，Mehetre，SS，Shinde GC，Pardedhi SU.Current Science，87：286～289，2004)、BT培养基(Beasley CA，Ting IP.American Journal of Botany，60：130～139，1973)和BH培养基(Stewart JM，Hsu CL.Planta，137：113～117，1977)等；培养方法有：棉花幼胚发育不同时期转换不同培养基的方法(Thengane S，Paranjpe SV，Khuspe SS，MascarenhasAF.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，6：209～219，1986)，光照培养结合黑暗培养(AherAR，Pawar SV，Patil SC，Mehetre，SS，Shinde GC，Pardedhi SU.Current Science，87：286～289，2004)等方法。

虽然棉花幼胚离体培养有多种培养基和培养方法，但仍然存在着幼胚培养时间长、幼胚萌发困难、成株率很低等问题。Stewart等(Stewart JM，Hsu CL.Planta，137：113～117，1977)利用其研制的培养基经过8～10周将成熟胚培养成苗；Thengane等(Thengane S，Paranjpe SV，Khuspe SS，Mascarenhas AF.Plant Cell Tissue Organ and Culture，6：209～219，1986)实验表明，幼胚转换5种培养基经过140～160天培养成发育完全的小植株；Mirza等(Mirza MA，Shaikh AL.The Pakistan Cottons，28，117～126，1984)报道19种不同棉属种间杂交胚在改良的BT培养基中培养，萌发胚率为8.0％～50.0％，仅有极少数萌发胚发育成株。这些研究结果一方面说明棉花幼胚培养的困难程度和复杂性，另一方面也表明棉花幼胚培养技术需进一步深入研究。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种棉花幼胚离体培养和植株形成的专用培养基及培养方法。

1.本发明所提供的一种用于棉花幼胚离体培养和植株形成的培养基(命名为CEM)配方如表1。

表1 棉花幼胚离体培养和植株形成的专用培养基组成成分(CEM)

成分名称用量mg/L 成分名称用量mg/L硝酸钾(KNO₃)950.0 氯化钴(CoCl₂·6H₂O)0.025硝酸铵(NH₄NO₃)825.0 肌醇(Inositol)100.0氯化钙(CaCl₂·2H₂O)220.0 烟酸(Nicotinic acid)1.0硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)185.0 盐酸硫胺素(Thiamine hydrochloride)10.0磷酸二氢钾(KH₂PO₄)85.0 L-甘氨酸(L-Glycine)2.0乙二胺四乙酸二钠(Na₂-EDTA·2H₂O)37.25 盐酸吡哆醇 (Vitamin B6 Pyridoxine)1.0硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)27.8 L-脯氨酸(L-Proline)10.0～20.0硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)22.3 L-谷氨酰胺(L-Glutamine)100～500硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)8.6 激动素(KT)0.1～0.5硼酸(H₃BO₃)6.2 吲哚丁酸(IBA)0.1～0.5碘化钾(KI)0.83 6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.1～0.5钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)0.25 蔗糖(Sucrose)20000.0硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)0.025 植物凝胶(Phytagel)2500.0

CEM培养基pH值为6.0，其中，根据培养的品种幼胚特性调整L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、激动素、吲哚丁酸、6-苄氨基嘌呤的精确用量。

2.棉花幼胚离体培养和植株形成的培养方法

1)干燥处理  取开花后20～25天的棉花幼铃，放入温度为28±2℃、相对湿度为40％～50％的培养室或培养箱中干燥处理2～4天。

2)棉花幼胚剥取将干燥后的棉花幼铃用70％乙醇浸泡杀菌30秒，或者蘸取95％乙醇点燃，进行棉铃表面灭菌。用灭菌解剖刀剖开棉铃，取出未成熟种子，剥去胚根部位的部分种皮，用镊子夹住种子中部并轻轻挤压，挤出幼胚。将幼胚放入盛有CEM培养基的玻璃培养瓶中，用封口膜密封培养瓶。所有操作均在超净工作台上进行。

3)棉花幼胚离体培养和植株形成  将CEM培养基中的幼胚培养置于植物组织培养室中，培养温度30±2℃，光照强度1500～2500lux，光照时间12～15小时光照/12～9小时黑暗。

本发明的棉花幼胚离体培养和植株形成的专用培养基及培养方法，是在对培养基中的大量元素、微量元素、氨基酸、植物激素、糖类等各个组成成分进行多次正交设计及梯度试验基础上得到的。培养基中大量元素是MS培养基中大量元素的一半；微量元素和MS培养基相同；有机成分与B5培养基的有机成分及用量相同，应用脯氨酸、谷氨酰胺等对幼胚发育及植株形成有利的营养成分，同时配合一定用量的植物激素成分和棉花幼铃干燥处理等培养方法，实现了棉花离体幼胚的直接萌发成苗和植株形成。用此培养体系培养开花后20～25天的离体幼胚，可使幼胚直接萌发并发育形成植株，其幼胚成苗率达40％以上。

具体实施方式

通过下面给出的具体实施例可以进一步清楚本发明，但它们不是对本发明的限制。

实施例1：

供试棉花品种为中无642及邯93-2。摘取2个品种开花后20～25天的幼铃，在温度为28±2℃，相对湿度为40％～50％的培养室中干燥处理3天。用75％乙醇浸泡约30秒后迅速点燃，进行棉铃表面灭菌。用解剖刀沿棉铃表面的缝隙切开棉铃，取出棉花幼种子并剥取幼胚，将棉花幼胚夹出转移至灭菌后的CEM培养基上(L-脯氨酸20mg/L、L-谷氨酰胺500mg/L、吲哚丁酸0.1mg/L、6-苄氨基嘌呤0.1mg/L)，然后将培养幼胚的培养瓶用封口膜封严，在培养室中进行培养。培养室温度28±2℃，光照强度1500～2500lux，相对湿度为40％～50％，14h光照/10h黑暗。培养10～15天后进行棉花幼胚成苗情况统计。结果表明：中无642幼胚平均成苗率为41.5％，邯93-2幼胚平均成苗率为45.0％。