胰岛素样生长因子－1(IGF－I)和聚乙二醇的缀合物

摘要

公开了由胰岛素样生长因子－1(IGF－I)变体和一个或两个聚乙二醇基组成的缀合物，其特征在于所述的IGF－I变体具有野生型IGF－I氨基酸序列27、37、65、68位的至多三个氨基酸位置上的氨基酸改变，使得所述的氨基酸中的一个或两个为赖氨酸且第27位氨基酸为极性氨基酸，但不是赖氨酸，所述的IGF－I变体通过所述的赖氨酸的伯氨基缀合并且所述的聚乙二醇基具有20－100kDa的总分子量。该缀合物用于治疗神经变性病症，如阿尔茨海默病。

说明书

本发明涉及胰岛素样生长因子-I(IGF-I)与聚乙二醇(PEG)的缀合物，包含这类缀合物的药物组合物和生产和使用这类缀合物的方法。

发明背景

阿尔茨海默病(AD)为日益增加的神经变性的普遍形式，其在65岁以上年龄的全部痴呆病例中约占50％-60％。据估计它目前影响全世界1500万人，并且由于在人群中老龄化人口的相对增加，所以其患病率可能在接下来的20年到30年内增加。AD是一种进行性病症，其中从临床症状发作到死亡之间的平均期限约有8.5年。与高级精神功能相关的大脑区域中的锥体神经元死亡和神经元突触丧失产生了典型症状，其特征在于认知功能的严重和进行性受损(Francis，P.T.等人，J.Neurol.Neurosurg：Psychiatry66(1999)137-147)。AD在世界中为老年性和早老性痴呆的最常见形式并且在临床上被视为残酷的进行性痴呆，与之共同存在的情况是记忆、智力功能丧失和语言障碍增加(Merritt，A Textbook of Neurology，第6版，Lea&Febiger，费城，第484-489页，1979)。从神经病理学上讲，AD的主要标志在于存在两种特征性损害：淀粉状老年蛋白斑和神经纤维缠结(NFT)。尽管所述的斑沉积在神经元外，但是在死亡后的大脑中的神经元内部观察到了缠结。淀粉状蛋白斑核心中的主要成分之一为病理性沉积的小淀粉状蛋白-β-肽(Aβ)，其被来自淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的分泌酶裂解(Selkoe，D.J.，Physiol.Rev.81(2001)741-766；Hardy，J.，和Selkoe，D.J.，Science297(2002)353-356；Bush，A.I.，和Tanzi，R.E.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA99(2002)7317-7319)。39-43个残基的自聚集肽Aβ(MW～4kDa)作为较大APP(110-120kDa)的一部分合成.APP为具有大的N-末端胞外结构域、单一跨膜结构域和短胞质尾的I型膜整合糖蛋白.Aβ区跨APP的胞外和跨膜结构域部分。APP参与AD中神经元细胞死亡的最常见推断为淀粉状蛋白假说。这一假说推断淀粉状蛋白沉积或部分聚集的可溶性Aβ引起神经毒性级联，由此产生与AD病理学相似的神经变性(Selkoe，D.J.，Physiol.Rev.81(2001)741-766；Hardy，J.，和Selkoe，D.J.，Science 297(2002)353-356)。

胰岛素样生长因子I(IGF-I)为在结构上与胰岛素相关的循环激素。传统上认为IGF-I是生长激素对外周组织起作用的主要介体。IGF-I由70个氨基酸组成并且也称作生长调节素C且定义为SwissProt No.P01343。用途、活性和产生在下列文献中提及：例如，le Bouc，Y.等人，FEBS Lett.196(1986)108-112；de Pagter-Holthuizen，P.等人，FEBS Lett.195(1986)179-184；Sandberg Nordqvist，A.C.等人，Brain Res.Mol.Brain Res.12(1992)275-277；Steenbergh，P.H.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.175(1991)507-514；Tanner，J.M.等人，Acta Endocrinol.(Copenh.)84(1977)681-696；Uthne，K.等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.39(1974)548-554；EP0 123 228；EP 0 128 733；US 5,861,373；US 5,714,460；EP 0 597 033；WO02/32449；WO 93/02695。

IGF-I功能的调节是十分复杂的。在循环中，仅0.2％的IGF-I以游离形式存在，而大部分与IGF-结合蛋白(IGFBP)结合，它们对IGF具有极高的亲和力并且调节IGF-I功能。该因子可以通过释放IGF-I的机制，诸如蛋白酶对IGFBP的蛋白水解局部释放。

IGF-I在发育和成熟大脑中起旁分泌作用(Werther，G.A.等人，Mol.Endocrinol.4(1990)773-778)。体外研究表明IGF-I为CNS中几种类型神经元的有效的非选择性营养剂(Knusel，B.等人，J.Neurosci.10(1990)558-570；Svrzic，D.，和Schubert，D.，Biochem.Biophys.Res.Commun.172(1990)54-60)，包括多巴胺能神经元(Knusel，B.等人，J.Neuroscl.10(1990)558-570)和少突胶质细胞(McMorris，F.A.，和Dubois-Dalcq，M，J.Neurosci.Res.21(1988)199-209；McMorris，F.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)822-826；Mozell，R.L.，和McMorris，F.A.，J.Neurosci.Res.30(1991)382-390))。US 5,093,317中提及了胆碱能神经元细胞的存活通过施用IGF-I得到提高。进一步已知IGF-I刺激外周神经再生(Kanje，M.等人，Brain Res.486(1989)396-398)并且提高鸟氨酸脱羧酶活性(US5,093,317)。US 5,861,373和WO 93/02695中提及了治疗中枢神经系统损伤或疾病的方法，这主要通过增加IGF-I和/或其类似物在患者中枢神经系统中的活性浓度来影响神经胶质和/或非胆碱能神经元细胞。WO0232449涉及减轻或预防哺乳动物中枢神经系统中局部缺血性损伤的方法，这通过向哺乳动物鼻腔施用包含治疗有效量的IGF-I或其生物活性变体的药物组合物来进行。有效减轻或预防与局部缺血事件相关局部缺血性损伤的量的IGF-I或其变体通过哺乳动物的鼻腔吸收并且被转运入中枢神经系统。EP0874641请求保护IGF-I或IGF-II在制备用于治疗或预防中枢神经系统中的神经元损伤的药物中的用途，所述的神经元损伤是因为AIDS-相关痴呆、AD、帕金森病、皮克病、亨廷顿舞蹈病、肝性脑病、皮质-基底神经节综合征、进行性痴呆、具有痉挛性截瘫的家族性痴呆、进行性核上麻痹、多发性硬化、Schilder脑硬化或急性坏死性出血性脑脊髓炎引起的，其中所述的药物为用于在血脑屏障或血-脊髓屏障外部以有效量肠胃外施用所述IGF的形式。

游离IGF-I的脑和血清水平的下降与AD的散发和家族形式的发病机制相关。此外，IGF-I防止神经元受到Aβ-诱导的神经毒性的影响(Niikura，T.等人，J.Neurosci.21(2001)1902-1910；Dore，S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(1997)4772-4777；Dore，S.等人，Ann.NY Acad.Sci.890(1999)356-364)。近来，经证实外周施用IGF-I能够降低大鼠和小鼠脑Aβ水平(Carro，E.等人，Nat.Med.8(2002)1390-1397)。此外，研究证实在转基因AD小鼠模型中，延长的IGF-I治疗显著减少了脑淀粉状蛋白斑的堆积。

这些数据强烈支持了IGF-I能够通过从大脑中清除Aβ降低脑Aβ水平和减轻与斑相关的脑痴呆的观点。

蛋白质与聚乙二醇(PEG)的共价修饰证实是延长蛋白质的体内循环半衰期的有用方法(Hershfield，M.S.等人，N.Engl.J.Med.316(1987)589-596；Meyers，F.J.等人，Clin.Pharmacol.Ther.49(1991)307-313；Delgado，C等人，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.9(1992)249-304；Katre，Advanced Drug Delivery Systems 10(1993)91；EP-A 0 400 472；Monfardini，C等人，Bioconjugate Chem.6(1995)62-69；Satake-Ishikawa，R.等人，CellStruct.Funct.17(1992)157-160；Katre，N.V.等人，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 84(1987)1487-1491；Tsutsumi，Y.等人，Jpn.J.Cancer Res.85(1994)9-12；Inoue，H.等人，J.Lab.Clin.Med.124(1994)529-536；Chamow，S.M.等人，Bioconjugate Chem.5(1994)133-140)。

聚乙二醇化的其它优点在于溶解度增加和蛋白质免疫原性下降(Katre，N.V.，J.Immunol.144(1990)209-213)。用于蛋白质聚乙二醇化的常用方法为使用氨基反应性试剂如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化的聚乙二醇。使用这类试剂使聚乙二醇与蛋白质在游离伯氨基，诸如N-末端α-氨基和赖氨酸残基的∈-氨基上连接。然而，这种手段的主要局限在于蛋白质一般包含大量的赖氨酸残基且由此聚乙二醇基以非特异性方式与蛋白质在所有游离∈-氨基上连接，从而产生随机聚乙二醇化蛋白质的异源产物混合物。因此，许多NHS-聚乙二醇化蛋白质因低特异性活性而不适合于商业化应用。失活是因生物活性所需的一个或多个赖氨酸残基或N-末端氨基残基的共价修饰或蛋白质活性位点附近或位点上的聚乙二醇残基的共价连接所致。例如，发现使用NHS-聚乙二醇化试剂修饰人生长激素将蛋白质的活性降低了10-倍以上(Clark，R.等人，J.Biol.Chem.271(1996)21969-21977)。人生长激素包含9个赖氨酸与N-末端氨基酸。这些赖氨酸中的某些位于已知对受体结合而言关键的蛋白质区内(Cunningham，B.C.等人，Science 254(1991)821-825)。此外，通过使用氨基反应性聚乙二醇试剂修饰红细胞生成素也导致生物活性接近完全丧失(Wojchowski，D.M.等人，Biochim.Biophys.Acta 910(1987)224-232)。使用氨基反应性聚乙二醇化试剂共价修饰干扰素-α2导致生物活性丧失40-75％(美国专利US 5,382,657)。对G-CSF的类似修饰导致活性丧失60％以上(Tanaka，H.等人，Cancer Res.51(1991)3710-3714)且对白细胞介素-2的类似修饰导致生物活性丧失90％以上(Goodson，R.J.，和Katre，N.V.，BioTechnology 8(1990)343-346)。

WO 94/12219和WO 95/32003中请求保护包含PEG和IGF或半胱氨酸突变的IGF的聚乙二醇缀合物，所述的PEG与所述的突变蛋白在突变蛋白的N-末端区的游离半胱氨酸上连接。WO 2004/60300中描述了N-末端聚乙二醇化的IGF-I。

发明概述

本发明包含IGF-I变体，其特征在于在野生型IGF-I氨基酸序列的27，37，65和/或68位氨基酸上具有氨基酸改变，使得37、65、68位氨基酸中的一个或多个为赖氨酸(K)且第27位氨基酸为极性氨基酸，但不是赖氨酸。

优选第27位氨基酸为精氨酸。

这类IGF-I变体用作生产赖氨酸-聚乙二醇化IGF-I的中间体(IGF-I中间体)。

令人意外地发现赖氨酸-聚乙二醇化IGF-I变体(氨基反应性聚乙二醇化IGF-I变体)，优选20 kDa-100 kDa的聚乙二醇化IGF-I变体且尤其优选单聚乙二醇化IGF-I变体在治疗应用方面具有优良特性。

本发明的另一个实施方案为本发明赖氨酸-聚乙二醇化IGF-I变体和N-末端聚乙二醇化的IGF-I变体组合物。优选摩尔比为9∶1-1∶9。另外优选一种组合物，其中该摩尔比至少为1∶1(每一份N-末端聚乙二醇化IGF-I变体中有至少1份赖氨酸-聚乙二醇化IGF-I变体)，优选至少6∶4(每4份N-末端聚乙二醇化IGF-I变体中有至少6份赖氨酸-聚乙二醇化IGF-I变体)。

优选赖氨酸-聚乙二醇化IGF-I变体和N-末端聚乙二醇化IGF-I变体均为单聚乙二醇化的。优选在该组合物中，在赖氨酸-聚乙二醇化IGF-I变体和N-末端聚乙二醇化IGF-I变体中所述变体是相同的。变体优选地选自RRKK、RRKR、RRRK、RKRR。PEG优选具有的平均分子量为30-45kDa，尤其是30kDa或40kDa。赖氨酸-聚乙二醇化IGF-I变体和N-末端聚乙二醇化IGF-I变体在IGF结合蛋白(例如BP4和BP5)的结合方面表现出相差无几的亲和力，但在IGF-IR磷酸化方面表现出活性不同。

本发明提供了由IGF-I变体(IGF-I缀合物或缀合物)和聚乙二醇基组成的缀合物，其特征在于所述的IGF-I变体在野生型IGF-I氨基酸序列的27、37、65和/或68位氨基酸上具有氨基酸改变，使得37、65、68位氨基酸中的一个或多为赖氨酸(K)，第27位氨基酸为极性氨基酸，但不是赖氨酸，并且所述的PEG与所述的IGF-I变体通过伯氨基，优选通过赖氨酸的伯氨基缀合。

优选聚乙二醇基具有的总分子量至少为20kDa，更优选约20-100kDa并且尤其优选20-80kDa。

聚乙二醇基与IGF-I变体通过赖氨酸的伯氨基在37、65、68位氨基酸中的一个或多个氨基酸上缀合(氨基反应性聚乙二醇化)并且任选在N-末端氨基酸上聚乙二醇化。缀合物优选在37、65、68位氨基酸的一个或多个赖氨酸残基上单聚乙二醇化或二聚乙二醇化并且任选在N-末端氨基酸上聚乙二醇化。进一步优选所述的缀合物在K65、K68或K37上单聚乙二醇化或在K65和K68上二聚乙二醇化并且任选在N-末端氨基酸上聚乙二醇化。

优选不超过20％的聚乙二醇化IGF-I变体另外在N-末端聚乙二醇化。

如下命名IGF-I变体：K65意指第65位氨基酸为赖氨酸，R27意指第27位氨基酸为精氨酸等。带有氨基酸R27、K37、K65、K68的IGF-I变体命名为RKKK。IGF-I野生型命名为KRKK。

尤其优选的IGF-I变体和缀合物中的变体为：RRKK、RRKR、RRRK、RKRR。

另外优选本发明的(聚乙二醇化)IGF-I变体为这样的一种变体，其中在N-末端上的至多三个(优选所有三个)氨基酸被截去。相应的野生型突变体称作Des(1-3)-IGF-I并且缺乏来自N-末端的氨基酸残基gly、pro和glu(Kummer，A.等人，Int.J.Exp.Diabesity Res.4(2003)45-57)。

聚乙二醇基为线性或支化的。

本发明进一步包含使用IGF-I中间体制备本发明缀合物的方法。该方法包括制备包含IGF-I变体和一个或两个聚乙二醇基的缀合物，所述的聚乙二醇基优选具有的总分子量至少为20kDa，更优选约20-100kDa并且尤其优选20-80kDa，该方法通过使IGF-I中间体与活化的聚乙二醇在一定条件下反应来进行，所述的条件使得所述聚乙二醇通过化学方式与所述的IGF-I中间体经IGF-I变体的赖氨酸伯氨基结合。

本发明进一步包含药物组合物，其包含本发明的缀合物，优选包含本发明的缀合物与可药用截体。

本发明进一步包含生产包含本发明缀合物的药物组合物的方法。

本发明进一步包含本发明缀合物在制备用于治疗AD的药物中的用途。

本发明进一步包含治疗AD的方法，其特征在于向有这类治疗需要的患者施用药物有效量的氨基反应性聚乙二醇化IGF-I变体，优选每周施用1-2次。

发明详述

本文所用的″聚乙二醇化IGF-I变体″或″氨基反应性聚乙二醇化″意指IGF-I变体与一个或两个聚乙二醇基通过IGF-I变体分子的一个或两个赖氨酸发生氨基反应性偶联而共价结合。PEG基连接在IGF-I变体分子的赖氨酸侧链的伯∈-氨基位点上。另外可能的情况是，聚乙二醇化还发生在N-末端α-氨基上。因合成方法和所用的变体，聚乙二醇化IGF-I变体可以由具有或不具有N-末端聚乙二醇化的、在K65、K68和/或K37上聚乙二醇化IGF-I变体的混合物组成，由此聚乙二醇化位点在不同分子上可以不同或在每个分子的聚乙二醇侧链的量和/或分子的聚乙二醇化位点方面基本上为均一的。优选IGF-I变体为单聚乙二醇化和/或二聚乙二醇化的并且尤其是从N-末端聚乙二醇化IGF-I变体纯化的。

本文所用的氨基反应性聚乙二醇化指的是通过使用反应性(活化的)聚乙二醇，优选使用N-羟基琥珀酰亚胺基酯类，优选甲氧基聚乙二醇使聚乙二醇链与IGF-I变体的赖氨酸伯氨基随机连接的方法。该偶联反应使聚乙二醇与IGF-I的赖氨酸残基的反应性伯∈-氨基和任选的IGF-I的N-末端氨基酸的α-氨基连接。PEG与蛋白质的这类氨基缀合为本领域众所周知的。

例如，这类方法的综述由Veronese，F.M.，Biomaterials 22(2001)405-417提供。按照Veronese所述，可以通过使用对伯氨基进行烷基化的活化的PEG进行PEG与蛋白质伯氨基的缀合。为了进行这类反应，可以使用活化烷基化PEG，例如PEG醛，PEG-三氟代乙烷磺酰氯或PEG环氧化物。另外有用的试剂为酰化PEG，诸如羧化PEG的羟基琥珀酰亚胺基酯类或末端羟基被氯甲酸酯类或羰基咪唑活化的PEG。另外有用的PEG试剂为具有氨基酸臂的PEG。这类试剂可以包含所谓的支化PEG，由此至少2个相同或不同的PEG分子通过肽间隔基(优选赖氨酸)彼此连接，并且例如与作为赖氨酸间隔基的活化羧酸酯的IGF-I变体结合。单-N-末端偶联还描述于Kinstler，O.等的Adv.Drug Deliv.Rev.54(2002)477-485中。

本文所用的″PEG或聚乙二醇″意指商购或可以按照本领域众所周知的方法通过对乙二醇进行开环聚合制备的水溶性聚合物(Kodera，Y.等人，Progress in Polymer Science 23(1998)1233-1271；Francis，G.E.等人，Int.J.Hematol.68(1998)1-18)。术语″PEG″广泛用于包括任意的聚乙二醇分子，其中乙二醇单元的数量至少为460，优选460-2300且尤其优选460-1840(230个PEG单元折合分子量约为10kDa)。PEG单元的上限值仅受缀合物的溶解度限制。通常不使用大于包含2300个单元的PEG的PEG。优选本发明中所用的PEG一端为羟基或甲氧基(甲氧基PEG，mPEG)并且在另一端上通过醚氧键与接头部分共价连接。聚合物为线性或支化的。支化PEG例如描述于Veronese，F.M.等人，Journal of Bioactive和Compatible Polymers12(1997)196-207中。有用的PEG试剂例如购自NektarTherapeutics(www.nektar.com)。

可以实际需要任意分子量的PEG，例如，约20千道尔顿(Da)-100kDa(n为460-2300)。对以道尔顿描述的分子量而言，在PEG中重复单元的数量″n″为近似的。例如，如果两个PEG分子与接头连接，其中每个PEG分子具有10kDa(n各自约为230)的相同分子量，那么接头上PEG的总分子量约为20kDa。与接头连接的PEG的分子量也可以不同，例如，在接头上的两个分子中，一个PEG分子可以为5kDa并且一个PEG分子可以为15kDa。分子量始终意指平均分子量。

在下文的实施例中，描述了用于生产氨基反应性聚乙二醇化IGF-I变体的某些优选试剂。应理解，例如基于Veronese，F.M.，Biomaterials22(2001)405-417所述方法的修饰可以在操作步骤中进行，只要该方法可以产生本发明的缀合物即可。

在靶蛋白中存在至多三个可能的反应性伯氨基(至多两个赖氨酸和一个末端氨基酸)产生了一系列聚乙二醇化IGF-I变体异构体，它们在聚乙二醇链的连接点上不同。

本发明提供了具有改进的特性的IGF-I变体的聚乙二醇化形式。这类聚乙二醇化IGF-I变体缀合物包含与之随机连接的线性或支化的一个或两个PEG基，由此缀合物中所有PEG基团的总分子量优选约20-80kDa。本领域技术人员显而易见来自这一分子量范围的小的衍生形式是可能的，只要该聚乙二醇化IGF-I变体在降低大脑中Aβ肽水平方面表现出活性即可。此外，使用具有大于80kDa的分子量的PEG使IGF-I变体聚乙二醇化产生了较高的生物利用度。然而，预计这类活性随分子量的增加而降低，这是因IGF-I受体活化和血脑屏障转运减少所致。因此，必须将20-100kDa的PEG分子量范围理解为用于有效治疗AD患者的PEG和IGF-I变体的缀合物的最佳范围。

本文所用的″分子量″意指PEG的平均分子量。

下列IGF-I变体的聚乙二醇化形式为考虑的本发明缀合物的实施方案：

-单聚乙二醇化IGF-I变体，其中PEG基具有20-80kDa的分子量

(460-1840个PEG单元)；

-二聚乙二醇化IGF-I变体，其中每一PEG基具有约10-50kDa的分

子量(230-1150个PEG单元)；

及其混合物。

尤其优选选自RRKK、RRKR、RRRK和RKRR的单聚乙二醇化IGF-I，其中支化PEG基具有30-45，优选40-45kDa的分子量(约920个PEG单元)。例如，基于PEG的44kDa的平均分子量和IGF-I的7.6kDa的分子量，这类单PEG-IGF-I的计算平均分子量约为51.6kDa。另外优选单聚乙二醇化IGF-I，其选自RRKK、RRKR、RRRK和RKRR，其中PEG具有30或40kDa的平均分子量。

本发明的″PEG或PEG基″意指包含聚乙二醇作为必需部分的残基。

这类PEG可以包含对结合反应而言必不可少的额外化学基团；其因分子的化学合成而产生；或为用于分子部分彼此之间最佳间隔的间隔基。此外，这类PEG可以由一个或多个彼此连接的PEG侧链组成。带有一个以上PEG链的PEG基称作多臂或支化PEG。例如，可以通过将聚环氧乙烷添加到各种多元醇，包括甘油、季戊四醇和山梨醇上而制备支化PEG。例如，可以由季戊四醇和环氧乙烷制备四臂支化PEG。支化PEG通常带有2-8个臂并且描述于例如EP-A 0 473 084和美国专利US 5,932,462中。尤其优选带有两个通过赖氨酸伯氨基连接的PEG侧链(PEG2)的PEG(Monfardini，C等人，Bioconjugate Chem.6(1995)62-69)。

本文所用的″基本上均一的″意指产生、包含或使用的聚乙二醇化IGF-I变体分子仅为那些带有一个或两个所连接PEG基的分子。该制品可以包含少量未反应的(即缺乏PEG基)蛋白质。正如根据肽作图和N-末端测序确定的，下文的一个实例提供了至少90％PEG-IGF-I变体缀合物和至多5％未反应蛋白质的制品。可以通过常用的纯化方法，优选大小排阻色谱法对聚乙二醇化IGF-I变体的这类均一制品进行分离和纯化。

本文所用的″单聚乙二醇化″意指IGF-I变体为每个IGF-I变体分子仅在一个赖氨酸上聚乙二醇化，由此仅一个PEG基在该位点上共价联机。这类单聚乙二醇化IGF-I可以在一定程度上在N-末端上额外聚乙二醇化。纯的单聚乙二醇化IGF-I变体(没有N-末端聚乙二醇化)占制品的至少80％，优选90％，并且最优选单聚乙二醇化IGF-I变体占制品的92％或92％以上，剩余部分为例如未反应的(未聚乙二醇化)IGF-I和/或N-末端聚乙二醇化IGF-I变体。因此，本发明的单聚乙二醇化IGF-I变体制品的均一性足以展示出均一性制品的优点，例如，在药物应用中。这同样应用于二聚乙二醇化分子。

″活化的PEG或活化的PEG试剂″为本领域当前水平众所周知的。优选使用亲电子活化的PEG，诸如聚乙二醇的烷氧基丁酸琥珀酰亚胺基酯类(″低级烷氧基-PEG-SBA″)或聚乙二醇的烷氧基丙酸琥珀酰亚胺基酯类(″低级烷氧基-PEG-SPA″)或N-羟基琥珀酰亚胺活化的PEG。可以使用使活化的酯与胺反应而形成酰胺的任意常规方法。在活化的PEG与IGF-I的反应中，典型的琥珀酰亚胺基酯为导致酰胺形成的离去基。琥珀酰亚胺基酯类在生产带有蛋白质的缀合物中的用途公开在美国专利US 5,672,662中。

所用的反应条件对不同聚乙二醇化IGF-I变体的相对量具有影响。通过控制反应条件(例如试剂之比、pH、温度、蛋白质浓度、反应时间等)，不同聚乙二醇化分子的相对量可以改变。优选反应在pH 8-10的包含5-15％(v/v)乙醇和0.5-4％(v/v)乙二醇的缓冲水溶液中进行。如果产生单聚乙二醇化变体，则蛋白质∶PEG之比优选为1∶0.5-1∶2，并且如果产生二聚乙二醇化变体，则蛋白质∶PEG之比优选为1∶2.2-1∶5。可以根据本领域技术人员的知识改变反应温度和反应时间，由此高温和长反应时间导致聚乙二醇化增加。如果产生单聚乙二醇化变体，那么由此优选在4℃下进行至多30分钟。当将聚乙二醇化试剂与IGF-I变体在由50mM硼酸钠、10％乙醇和1％二(乙二醇)(DEG)组成pH约9.0的反应缓冲液中以1∶1.5的蛋白质∶PEG之比混合时，并且反应温度从4℃开始，产生单聚乙二醇化分子、二聚乙二醇化分子和微量三聚乙二醇化分子的混合物。当蛋白质∶PEG之比约为1∶3时，主要产生二聚乙二醇化和寡聚乙二醇化分子。

本发明的IGF-I变体缀合物如下制备：通过使IGF-I变体的赖氨酸伯氨基与双官能试剂共价反应而形成带有酰胺键的中间体并且使含有酰胺键的该中间体与活化的聚乙二醇衍生物共价反应而形成IGF-I变体缀合物。

在上述方法中，所述的双官能试剂优选为N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代丙酸酯或N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯，并且活化的聚乙二醇衍生物优选地选自碘-乙酰基-甲氧基-PEG、甲氧基-PEG-乙烯基砜和甲氧基-PEG-马来酰亚胺。

尤其优选使用分子量为40kDa的N-羟基琥珀酰亚胺基活化的支化PEG酯(mPEG2-NHS)(Monfardini，C等人，Bioconjugate Chem.6(1995)62-69；Veronese，F.M.等人，J.Bioactive Compatible Polymers 12(1997)197-207；美国专利US 5,932,462)。

可以通过巯基与IGF-I变体进行氨基反应性共价连接(″活化″)并且使所得到的活化的IGF-I变体与聚乙二醇(PEG)衍生物偶联制备IGF-I变体缀合物。第一步包含通过IGF-I变体赖氨酸NH₂-基共价连接的巯基。使用携带被保护的巯基和额外的反应基的双官能试剂对IGF-I变体进行这种活化，分别诸如活性酯类(例如琥珀酰亚胺基酯)、酸酐类、磺酸酯类、羧酸和磺酸卤化物。用本领域公知的基团，例如乙酰基保护巯基。这些双官能试剂能够通过形成酰胺键与赖氨酸的∈-氨基反应。所述双官能试剂的制备为本领域公知的。双官能NHS酯类的前体描述于DE 39 24 705中，而对乙酰巯基化合物的衍生描述于March，J.，Advanced OrganicChemistry(1977)375-376中。双官能试剂SATA为商购的(MolecularProbes，Eugene，OR，USA和Pierce，Rockford，IL)并且描述于Duncan，R.J.，Anal.Biochem.132(1983)68-73中。

例如，反应在pH 6.5-8.0的缓冲水溶液，例如，在10mM磷酸钾，300mM NaCl，pH 7.3中进行。可以将双官能试剂加入到DMSO中。在反应完成后，优选在30分钟后，通过添加赖氨酸终止反应。可以通过本领域公知的方法，例如通过透析或柱过滤分离过量的双官能试剂。可以通过例如Grasetti，D.R，.和Murray，J.F.，Arch.Biochem.Biophys.119(1967)41-49中所述的光度测定法测定加入到IGF-I变体上的巯基的平均数量。上述反应后共价偶联活化的聚乙二醇(PEG)衍生物。

活化的PEG衍生物为本领域公知的并且就PEG-乙烯基砜而言描述于例如Morpurgo，M.等人，J.Bioconjugate Chem.7(1996)363-368中。直链和支化PEG分子均适合于制备式I的化合物。反应性PEG试剂的实例为碘-乙酰基-甲氧基-PEG和甲氧基-PEG-乙烯基砜。这些碘活化的物质的用途为本领域中公知的并且描述于例如Hermanson，G.T.，BioconjugateTechniques，Academic Press，San Diego(1996)pp.147-148中。

本发明化合物的进一步纯化，包括单聚乙二醇化和/或二聚乙二醇化IGF-I变体的分离且优选从N-末端聚乙二醇化形式中的分离可以通过本领域公知的方法进行，例如，柱色谱法，优选离子交换色谱法，尤其是阳离子交换色谱法。

单PEG缀合物的百分比以及单PEG和二PEG分子之比可以通过混合洗脱峰周围的较宽范的级分而减少组合物中单PEG的百分比或混合较窄的级分而增加组合物中单PEG百分比来控制。约90％的单PEG缀合物在产率和活性间达良好平衡。有时，例如，至少95％或至少98％的缀合物为单PEG分子的组合物可能是理想的。在本发明的一个实施方案中，单聚乙二醇化缀合物的百分比为90％-98％。

本文所用的″极性氨基酸″意指选自半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)的氨基酸。赖氨酸也为极性氨基酸，但不包括在内，因为按照本发明赖氨酸被取代。精氨酸优选用作极性氨基酸。

药物制剂

本发明的聚乙二醇化IGF-I提供了改善的循环稳定性，从而能够在整个体内在低施用间隔持续接近IGF-I受体。

可以将聚乙二醇化IGF-I变体作为混合物或作为离子交换色谱法或大小排阻色谱法分离的不同聚乙二醇化种类施用。可以按照用于制备本领域技术人员公知的药物组合物的方法配制本发明的化合物。为了生产这类组合物，可以将本发明的聚乙二醇化IGF-I变体与可药用载体混合，优选通过对含有药物组合物所需组分的水溶液透析来进行。例如，这类可接受的载体描述于Remington′s Pharmaceutical Sciences，18^th edition，1990，Mack Publishing Company，Oslo等编辑(例如1435-1712页)中。典型组合物包含有效量的本发明物质，例如约0.1-100mg/ml，与适量的载体。可以通过肠胃外施用该组合物。优选通过腹膜内、皮下、静脉内或鼻内施用本发明的聚乙二醇化IGF-I。

可以按照本领域公知的方法制备本发明的药物制剂。通常将聚乙二醇化IGF-I变体的溶液对指定用于药物组合物的缓冲液透析并且通过浓缩或稀释调整所需的最终蛋白质浓度。

这类药物组合物可以用于注射或输注施用，优选通过腹膜内、皮下、静脉内或鼻内施用，并且包含有效量的聚乙二醇化IGF-I变体与可药用稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。这类组合物包括各种缓冲内含物的稀释剂(例如精氨酸、乙酸盐、磷酸盐)；pH和离子强度剂；添加剂，诸如去污剂和增溶剂(例如Tween^TM 80/聚山梨醇酯、pluronic^TMF68)；抗氧化剂(例如抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)；防腐剂(Timersol^TM、苄醇)和填充物质(例如蔗糖、甘露糖醇)；将所述物质掺入聚合物化合物，诸如聚乳酸、聚乙醇酸等微粒制品或掺入脂质体。这类组合物可以影响本发明单聚乙二醇化IGF-I释放和清除的物理状态稳定率。

剂量和药物浓度

一般而言，在标准治疗方案中，在一定时间期限内使用0.001-3mg、优选0.01-3mg聚乙二醇化IGF-I变体/kg/天范围的剂量治疗患者，持续1天至约30天乃至30天以上。将药物作为单一每日皮下或静脉内或腹膜内快速弹丸注射或输注包含0.1-100mg聚乙二醇化IGF-I/ml的药物制剂施用。将这种治疗方法与任意标准(例如化疗)治疗联用，通过在所述的标准治疗之前、治疗过程中或治疗之后施用聚乙二醇化IGF-I来进行。这导致与单一标准治疗相比效果改善。

发现每周仅施用1或2次本发明的聚乙二醇化IGF-I可以进行成功治疗。本发明的另一个实施方案由此为治疗阿尔茨海默病的方法，包括向有此需要的患者施用治疗有效量的本发明聚乙二醇化IGF-I，一次剂量范围为每kg和每3-8天、优选每7天0.001-3mg、优选0.01-3mg的聚乙二醇化IGF-I变体。当使用聚乙二醇化IGF-I时，优选地，单聚乙二醇化IGF-I优选作为本发明赖氨酸-聚乙二醇化IGF-I变体与N-末端聚乙二醇化IGF-I变体(其中摩尔比至少为1∶1)的组合物使用。

本发明的另一个实施方案为本发明的聚乙二醇化IGF-I在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的用途，所述治疗为向有此需要的患者施用治疗有效量的和1或2个剂量，其范围为每kg和每6-8天、优选每7天0.001-3mg、优选0.01-3mg的聚乙二醇化IGF-I变体。当使用聚乙二醇化IGF-I时，优选地，单聚乙二醇化IGF-I优选作为本发明赖氨酸-聚乙二醇化IGF-I变体与N-末端聚乙二醇化IGF-I变体(其中摩尔比至少为1∶1)的组合物使用。

提供下列实施例、参考文献和附图有助于理解本发明，其确切的范围如后附权利要求中所述。应理解可以在不脱离本发明精神的情况下对所述操作步骤进行修改。

序列表

SEQ ID NO：1为人IGF-I的氨基酸序列(SwissProt P01343，氨基酸1-70：IGF-I；氨基酸71-105：前肽)。

附图简述

图1：PEG-IGF的IEC-HPLC。使用制备型强阳离子交换柱(TOSOH-BIOSEP，SP-5PW)从聚乙二醇化混合物中分离纯的位置异构体。

分离5个不同的峰级分(编号0-4)并且处理以便进一步分析。

图2：单PEG-IGF-I峰的SDS-PAGE分析。通过4-12％Tris-甘氨酸SDS-PAGE在非还原(A)和还原(B)条件下对5个纯化的峰级分(编号0-4)进行电泳并且使用考马斯蓝对凝胶中的蛋白质染色。MW，分子量标记。

图3：单聚乙二醇化IGF-I峰1，2和3的肽分析。使用Asp-N消化纯化的单聚乙二醇化峰1，2和3并且通过HPLC分离肽级分。通过如所述的Edman N-末端肽降解获得聚乙二醇化片段的肽序列。A：HPLC分析在30-45分钟保留时间时产生rhIGF-I肽的6个不同片段并且聚乙二醇化峰的主要片段7(和最小的片段7′)在～70分钟保留时间时达到峰值。箭头表示与rhIGF-I相比不同峰中肽片段的主要相对改变。B：获自rhIGF-I的Asp-N裂解的6个片段的肽序列。用黑体字标记赖氨酸(K)并且在片段3和4中出现。片段5例示了N-末端肽。C：Edman降解后聚乙二醇化肽片段7的肽序列。半胱氨酸和聚乙二醇化赖氨酸残基递送该肽序列中的片段。

图4：来自IGF-I和单聚乙二醇化异构体的不同总体表达谱的AD的分级簇类分析。IGF-I和聚乙二醇化变体的孵育时间为24小时；使用小鼠细胞系NIH-3T3。数据分析条件描述于文中。(A)下调的基因簇。(B)上调的基因簇。

图5：IGF-IR通过rhIGF-I和单PEG-IGF-I的磷酸化。使人IGF-IR稳定转染的NIH3T3细胞血清饥饿过夜并且与增加剂量(0.01-10μg/ml)的rhIGF-I或单PEG-IGF-I异构体(峰1、2、3、峰混合物、Des(1-3)峰3)一起孵育30分钟。随后处理细胞以便进行方法中所述的蛋白质印迹或细胞中的分析。得到分别使用rhIGF-I(A)、峰1(B)、峰2(C)、峰3(D)、峰混合物(E)和Des(1-3)峰3(F)的剂量响应曲线。将磷酸化信号对各孔中的IGF-IR水平归一化。数据点表示来自3次独立培养的6个测定值的平均值±SEM。

图6：NIH-3T3细胞中IGF-IR磷酸化的定量分析。使用单点结合动力学拟合获自实施例7中实验的剂量响应曲线，以便获得特异性结合(B_Max)、半数最大结合浓度(EC₅₀)和希尔系数(n_H)。数据表示来自3次独立培养的6个测定值的平均值±SEM。

图7：rhIGF-I体内降低PS2APP小鼠中脑Aβ。用rhIGF-I(50μg/kg腹腔注射)将2-3月龄的双重转基因PS2AAP小鼠(n＝10)处理2小时。制备皮质提取物并且如方法中所述评价APP、C99、Aβ和对照蛋白质(清蛋白)水平。从对清蛋白归一化的值计算C99/APP、Aβ/APP和C99/Aβ比值并且表示为占未处理对照的％并且表示为平均值±SEM。A：2月龄皮质提取物的代表性蛋白质印迹。注意通过rhIGF-I处理Aβ水平明显下降，而其它水平未改变。B：来自PS2APP小鼠皮质提取物的定量分析(^＊＊，与未处理对照相比p＜0.01)。

图8：rhlGF-I体内降低PS2APP小鼠中Aβ的时程。用rhIGF-I(50μg/kg腹腔注射)将2月龄小鼠处理2、6或24小时。随后评估Aβ/APP和C99/Aβ水平并且如所述计算比例。将数据表示为占未处理对照的％并且表示为平均值±SEM。(n＝10-13)。A：注射后2、6和24小时时Aβ/APP比值；B：注射后2、6和24小时时C99/Aβ比值(^＊＊，与未处理对照相比p＜0.01)。

图9：峰1-3体内降低AAP和PS2APP小鼠中Aβ。在单一转基因APP和双重转基因PS2APP小鼠的混合群体中进行实验。峰1、2和3的Aβ/APP和C99/Aβ比值共同显示了其对Aβ降低和清除的相对作用的直接比较(n＝8-10)。A：Aβ/APP比值表示峰1-3对脑Aβ积累的作用。B：峰1-3的C99/Aβ比值表示Aβ从脑中的清除(^＊，p＜0.05；^＊＊，p＜0.01；^＊＊＊，p＜0.001，与未处理对照相比)。

图10：峰3体内降低AAP和PS2APP小鼠中Aβ的时程。用峰3(50μg/kg腹腔注射)将2月龄APP和PS2APP小鼠的混合群体处理2、6、24、48或72小时。随后评估APP，C99，Aβ和肌动蛋白水平并且如所述计算比例。将数据表示为占未处理对照的％并且表示为平均值±SEM。

(n＝10-15)。A：注射后6、24和48小时时Aβ/APP；B：注射后6、24和48小时时C99/Aβ比值(^＊，p＜0.05；^＊＊，p＜0.01；^＊＊＊，p＜0.001，均与未处理对照相比)。

图11：峰1-3体内降低PS2APP小鼠中的Aβ。峰1、2和3的Aβ/APP比值共同显示了其对Aβ降低和清除的相对作用的直接比较(n＝3-13)；^＊，与未处理对照相比p＜0.05)。

图12：峰3体内降低PS2APP小鼠中Aβ的时程。用峰3的单一注射(50μg/kg腹腔注射)将2月龄PS2APP小鼠处理2、6、24、48或72小时。

随后如所述计算Aβ/APP比值。将数据表示为占未处理对照的％并且表示为平均值±SEM(n＝4-13；^＊，p＜0.05；^＊＊，p＜0.01，与未处理对照相比)。

实施例

材料和方法

重组人胰岛素样生长因子(rhIGF-I)通过Cell Concepts(Umkirch，Germany)购自PeproTech(Rocky Hill，NJ，USA)并且Des(1-3)-IGF-I获自GroPep(Adelaide，Australia)。聚乙二醇(PEG)试剂来自Nektar Ltd.(SanCarlos，CA，USA)。用于本研究的所有其它化学品和溶剂具有可获得的最高纯度。可以根据本领域当前水平通过重组方式生产IGF-I变体，例如通过使用位点定向诱变与优选例如在US 6,509,443或US 6,403,764中所述在大肠杆菌(E.coli)中的表达方法的组合。

IGF-I的聚乙二醇化

产生在单一位点上具有聚乙二醇化的IGF-I(单PEG-IGF-I)。通过使赖氨酸∈-氨基在IGF-I分子表面或N-末端上与40kDa分子量的活化支化PEG部分缀合制备单PEG-IGF-I。聚乙二醇化反应混合物包含在50mM硼酸钠缓冲液(10％乙醇和1％DEG)，pH 9.0中的1∶1.5摩尔比的rhIGF-I和40kDa PEG-NHS。使该反应在4℃下进行30分钟。基于所用PEG部分的44kDa平均分子量和IGF-I的7.6 kDa分子量，预计计算的单PEG-IGF-I的平均分子量约为51.6kDa。

通过离子交换色谱法分离PEG-IGF-I位置异构体

使用制备型强阳离子交换柱(TOSOH-BIOSEP，SP-5PW，内径30mm和长75mm)的纯化方案制备纯的单PEG-IGF-I同种型。缓冲系统由调整至pH4.5的7.5mM乙酸钠、10％乙醇和1％二甘醇(缓冲液A)和调整至pH 6.5的20mM磷酸钾、10％乙醇和1％二甘醇(缓冲液B)组成。

用25％缓冲液B将该柱预平衡。在加载PEG-IGF-I样品后，用35％缓冲液B洗涤该柱，随后使线性梯度上升至65％缓冲液B以便分离异构体。为了洗脱未聚乙二醇化IGF-I，将系统切换至具有pH.8.0的改变的缓冲液B。流速为8ml/分钟并且在218nm处进行检测。手工收集所得蛋白质样品并且等分储存在-20℃下以便通过各种蛋白质化学和生物分析法进行分析(参见下文)。

使用分析型强阳离子交换柱(TOSOH-BIOSEP，SP-NPR，颗粒大小2.5μm，直径4.6mm，长3.5cm)研究分离的位置异构体的纯度。就这种分析柱而言，我们使用了与制备型分析柱相同的流动相，但流速和运行时间下降。通过分光光度法，基于单PEG-IGF-I蛋白质部分的280nm吸收(E^1mg/ml₂₈₀＝0.584)测定单PEG-IGF-I异构体的蛋白质浓度。

单PEG-IGF-I纯度的分析

通过4-12％Tris-甘氨酸SDS-PAGE在非还原或还原条件下分析各单PEG-IGF-I异构体。固定蛋白质并且使用Simple Blue SaveStain(Invitrogen，Basel，Switzerland)染色。

单PEG-IGF-I异构体的质谱鉴定

使用Asp-N裂解纯化的单PEG-IGF异构体以便鉴定N-末端、K27、K65或K68上4个可能的聚乙二醇化位点。裂解缓冲液由100mM Tris/HClpH 8.0与0.04μg/μl Asp-N(Roche Diagnostics GmbH，DE)组成。在裂解缓冲液中，将20μg单PEG-IGF在37℃下与1μgAsp-N一起孵育16小时。

16小时后，通过添加TCEP(10mM)在37℃下反应1.5小时还原该反应混合物。随后通过添加1/20体积的10％TFA使反应溶液终止以便完成裂解反应。通过联机HPLC ESI质谱、HPLC直接分析获得的肽混合物或储存在-80℃下。

为了进行ESI-LC-MS分析，在配备有Phenomenex Jupiter C18反相柱(1×250mm，5μm，300)的Agilent 1100 HPLC系统上分离肽混合物，其中流速为40μl/分钟。另外在220nm处读取UV信号。使Q-ToFII或LCT质谱仪(Micromass)与HPLC系统直接偶联。在200-2000m/z质量范围内以1次扫描/秒记录ESI-ToF光谱。评价UV和TIC光谱并且可以在色谱图中对每一肽指定一个单峰。

为了进行HPLC分析，在配备有Phenomenex Jupiter C18反相柱(1×250mm，5μm，300)的Agilent 1100 HPLC系统上分离肽混合物，其中流速为40μl/分钟。另外在220nm处读取UV信号。在保留时间内PEG肽类向较高乙腈浓度移位并且手动收集它们且对其进行N-末端Edman降解。

HPLC试验条件(溶剂A：0.1％的水中的TFA；溶剂B：0.1％的乙腈中的TFA)如表1中所示：

表1.梯度

    时间    ％B    0    0    10    0    30    20    60    28    70    48    80    100    85    100    86    0    96    0

在带有procise系统控制软件的Applied Biosystems ProteinsequencerProcise 492上并根据制造商的说明进行N-末端Edman降解测序。将自HPLC收集的20μl/级分直接应用于BioBrene Plus^TM conditioned microTFA滤器。在滤筒密封垫密封的氩气环境中将滤器干燥并且导入蛋白质测序仪。使用自动化标准程序对多肽进行序列降解。使用Applied Biosystems数据评估软件610A对来自每一降解循环的HPLC色谱图进行分析揭示出了每一氨基酸的位置。半胱氨酸以及修饰的氨基酸，如聚乙二醇化赖氨酸作为色谱图中的缺口出现。

寡核苷酸阵列转录分析

为了对不同单PEG-IGF-I异构体进行体外转录谱分析，使IGF-IR稳定转染的NIH-3T3细胞血清饥饿2小时并且在24小时内无血清存在下与0.1或1μg/ml rhIGF和1μg/ml相应单PEG-IGF-I异构体或所获得的未分离异构体混合物一起孵育。随后收集培养的细胞并且用RNA-BeeTM提取总细胞RNA。将每一样品中的10μgRNA逆转录、标记并且使用商品试剂盒并按照供应商的说明(Invitrogen，Basel，Switzerland；Ambion，Huntingdon，UK)处理。用于碱性热片段化的方法和用于MOE 430AGeneChip阵列的杂交条件为制造商提供的标准操作步骤(Affymetrix，US)。

使用共焦激光扫描器记录阵列的荧光(细胞强度)并且使用MAS 5.0软件(Affymetrix，US)分析数据。将各基因的表达水平计算为与错配寡核苷酸杂交相比荧光强度的归一化的平均差(表示为平均差(AD))。每次实验均按照一式三份进行以便解释生物变异性。

选择下面的两个标准用于选择差异表达的基因：i)处理细胞的mRNA水平值必须至少高于未处理的细胞5倍或低于其5倍；ii)标准偏差必须显著小于平均差的绝对改变并且将计算的基因的置信水平设定在大于97％(p＜0.03)。

IGF-IR磷酸化测定

将使用人IGF-IR稳定转染的第2-4代之间的NIH-3T3细胞用于这些实验。将细胞在未包被的24-孔或96-孔平板中培养并且使其生长至70％汇合。随后将细胞血清饥饿过夜，然后与rhIGF-I或相应的PEG-IGF-I峰(或峰混合物)一起孵育30分钟。然后在Laemmli缓冲液中裂解细胞以便进行蛋白质印迹或用4％多聚甲醛固定30分钟以便进行细胞内IGF-IR磷酸化分析。为了进行蛋白质印迹分析，通过10％Bis-Tris SDS-PAGE分离蛋白质提取物并且印迹在硝化纤维膜上。将印迹与小鼠抗磷酸酪氨酸(4G10，1∶1000；Upstate)和兔抗IGF-IR(C-20，1∶1000；Santa Cruz)一级抗体共孵育并且用抗小鼠Alexa680(1∶10000；Molecular Probes)和抗兔IRDye800二级抗体(1∶10000；Jackson)标记。为了进行细胞内分析，封闭固定的细胞并且用2％山羊血清和Triton X-100(0.1％)透化处理且与相同的初级和二级抗体一起孵育。使用Odyssey成像系统(Licor Biosciences)对蛋白质带进行荧光检测。从数字图像中对蛋白质带的像素强度进行定量并且使用GraphPad Prism软件分析剂量响应曲线。使用获自所关注的相同区的IGF-IR值归一化磷酸酪氨酸水平以便获得实时IGF-IR活化改变。一式两份进行实验并且重复3次以便获得每一剂量的6个独立研究结果。将数据表示为平均值±SEM。

使用rhIGF-I和PEG-IGF-I异构体的体内实验

将由单一转基因AAP和双重转基因PS2AAP小鼠组成的阿尔茨海默病小鼠模型(Richards，J.G.等人，J.Neurosci.23(2003)8989-9003)用于研究rhIGF-I(和单PEG-IGF-I)对大脑淀粉样变性病的作用，近期已经在其它小鼠和大鼠模型中证实了该大脑淀粉样变性病(Carro，E.等人，Nat.Med.8(2002)1390-1397)。已经证实在2个月时PS2APP小鼠模型发生具有可测定Aβ水平的淀粉样变性病并且在8月龄时斑块沉积发作(Richards，J.G.等人，J.Neurosci.23(2003)8989-9003)。单一转基因APP小鼠在其幼龄时表现出极为相似的Aβ水平且因此包括在该组中。我们分析了前斑块龄(2-3个月)以便研究rhIGF-I和PEG-IGF-I异构体对可溶性大脑Aβ水平的作用。所有实验均按照Swiss动物保护权利进行并且将对动物的损害保持在最低水平。由在含有10％甘油的1mM HCI(rhIGF-I)或PBS中的储备溶液(单PEG-IGF-I异构体)制备在溶剂低于1％的0.9％NaCl中的注射溶液。给对照组注射0.9％NaCl。注射在轻度异氟烷麻醉下腹腔注射进行。在注射后不同时间点(2、6、24、48或72小时)时在异氟烷麻醉下处死动物。

将小鼠断头并且取出大脑用于分离端脑(包括海马的皮质)。在低渗裂解缓冲液中制备皮质蛋白质提取物，所述的缓冲液包含4mM Tris pH 7.4和320mM蔗糖(均来自Fluka)与蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(均来自Sigma)。

样品缓冲液为包含8M脲的Laemmli(Fluka)。通过4-12％Bis-TrisSDS-PAGE分离蛋白质并且印迹在硝化纤维膜上。将印迹与检测APP的小鼠抗淀粉状前体蛋白(APP)抗体(WO-2克隆，1∶5000；The GeneticsCompany)、C99片段和Aβ和山羊抗肌动蛋白抗体(C-11，1∶5000；SantaCruz)一级抗体共孵育并且用抗小鼠Alexa680(1∶10000；Molecular Probes)和抗山羊IRDye800二级抗体(1∶10000；Jackson)标记。使用Odyssey成像系统(Licor Biosciences)对蛋白质带进行荧光检测。使用GraphPad Prism软件从数字图像中分析对蛋白质带的像素强度。将数据表示为平均值±SEM。

将所有值对肌动蛋白(或清蛋白作为对照蛋白)归一化并且计算具体比值(C99/APP、Aβ/APP、C99/Aβ)。C99/APP比值给出了有关β-分泌酶和γ-分泌酶的活性状态的信息，因为C99为β-分泌酶的产物和γ-分泌酶的底物；在这一测定值中的改变可以指示着对这些不依赖于Aβ晚期命运的分泌酶之一的调节作用。由于在特定治疗后C99/APP水平恒定，所以C99/Aβ比值可以监测不依赖于其产生的Aβ的清除率，即随清除率增加而升高并且随其降低而降低。此外，将Aβ对APP归一化，因为其产生依赖于在个体小鼠之间改变的转基因APP表达。对每一个体动物进行比值计算。将所有获得的数据以占包括在每次实验中的未治疗的对照的％表示。

将每种剂量/时间间隔使用2-5只动物的个体实验重复2-4次。根据平均值±SEM，通过未配对t检验评价统计学差异，其中将p＜0.05视为具有统计学意义。

实施例1

单PEG-IGF-I位置异构体的色谱分离

IGF-I包含作为潜在聚乙二醇化位点的4个氨基并且预计有4种可能的单聚乙二醇化IGF-I(单PEG-IGF-I)异构体。根据反应条件的不同预计其它的衍生物被寡聚乙二醇化。研发强阳离子高压液相色谱法(IEC-HPLC)用于基于其局部电荷差异分离PEG-IGF-I或Des(1-3)-IGF-I异构体。5mgPEG-IGF-I的制备型洗脱分布图如图1中所示。该方法的结果可分离成5个主要的峰，3个峰具有基线分离并且2个峰具有部分分离。基线吸收降至色谱图的末端提示无在较高保留时间时洗脱的额外单聚乙二醇化IGF-I分子。因切换至具有不同pH的改进缓冲液B而在峰3与4之间出现额外的峰。用分析型IEC-HPLC估计各异构体的纯度和IEC级分中其它位置异构体的污染。所有单聚乙二醇化峰具有的纯度＞99％。

实施例2

单PEG-IGF-I异构体的SDS-PAGE分析

在非还原和还原条件下进行SDS-PAGE以便评估不同IGF-I分子通过分子间二硫键的潜在的不必要的交联。两种条件均产生类似的结果，这表明无大量蛋白质异常交联(图2)。SDS-PAGE分析显示峰0具有的表观分子量＞100kDa而主要检测带为在～70kDa的峰1-3；另外，在～70kDa处检测到峰4，这是预计的未聚乙二醇化IGF-I的大小(图2)。我们根据HPLC中获得的这一运行分布图和保留时间推断峰0最可能由二PEG-IGF-I和寡PEG-IGF-I组成。相反，将峰1-3命名为3种不同的单PEG-IGF-I异构体。

在对单PEG-IGF-I预计的分子量(51.6kDa)与～70kDa的表观大小之间存在偏差；然而，观察到的较高表观分子量可以解释为因使PEG-IGF-I的电泳运动相当缓慢的水结合和表观分子量增加导致的较大的PEG流体力学体积(Foser，S.等人，Pharmacogenomic J.3(2003)319)。IEC-HPLC和SDS-PAGE实验共同表明，可以认为IEC级分的纯度对进一步表征而言是足够纯的。

与rhIGF-I相对比对单PEG-Des(1-3)-IGF-I进行聚乙二醇化和分离并且类似地产生3个主要的单PEG-Des(1-3)-IGF-I峰。

实施例3

单PEG-IGF-I异构体的分析

使用HPLC在30-45分钟保留时间分离Asp-N裂解rhIGF-I的6个独立肽片段(图3A，上组)。在裂解纯化的峰1-3(图3A，下组)后，观察6个片段的不同分布和额外片段(片段7)的出现，以便在～70分钟的保留时间时洗脱。就峰1而言，特异性肽片段4随片段7的增加而减小。就峰2而言，我们观察到片段3明显减小和片段5轻度减小以及主要和次要PEG片段的出现(7和7′)。类似地，对峰3的HPLC分析产生了片段3和5的明显减小同时伴随着片段7和7′的出现。图11B表示通过rhIGF-I的Asp-N裂解获得的相应片段的肽序列。我们使用Edman N-末端肽降解分析了使用聚乙二醇化峰1、2和3获得的主要片段7的肽序列。由此半胱氨酸和聚乙二醇化氨基酸递送该肽序列中的片段。使用这种分析可以将峰1清楚地对应于在K27聚乙二醇化的rhIGF-I(图3C)。就峰2而言，将主要片段7(＞90％)对应于在K65聚乙二醇化的rhIGF-I，因为通过Edman降解证实K68为未修饰的赖氨酸(K)。相反，峰3的级分为在K68处的聚乙二醇化(序列中的缺口)，其中K65在Edman降解HPLC色谱图中产生信号(图3C)。无法通过Edman降解对次要峰7′测序，表明N-末端不易于反应，最可能的是因聚乙二醇化所致。这些数据共同表明峰1由K27聚乙二醇化异构体组成，峰2为在K65处聚乙二醇化的IGF-I且峰3为在K68聚乙二醇化且大量N-末端聚乙二醇化的IGF-I。

实施例4

rhIGF-I和单PEG-IGF-I异构体的转录谱分析

我们使用DNA微阵列测定了使用rhIGF-I或PEG-IGF-I异构体处理用人IGF-IR稳定转染的NIH-3T3细胞24小时的转录反应。因此，我们使用0.1和1μg/ml的IGF-I或1μg/ml的单PEG-IGF-I峰或获自聚乙二醇化反应的峰混合物刺激细胞。我们使用商品芯片类型(MOE 430A；Affymetrix Inc.)比较了使用对照培养物刺激的细胞的总体转录活性，该芯片包含用于约14,000种小鼠基因，包括所有已知IGF-I应答基因的探针组。

将mRNA丰度表示为正确匹配的寡核苷酸探针与在中心位置上具有错配的相应探针之间的平均差(AD)。我们仅考虑在三个同样生物样品中具有改变大于5倍并97％再现性的基因(p值＜0.03)。该分析产生了总计162个基因，86个被所有IGF-I变体上调且76个被所有IGF-I变体下调。不同单PEG-IGF-I异构体的转录活性的一般相关概况解释为图4中上调和下调基因的分级簇的形式。检查0.1μg/ml和1.0μg/ml IGF-I对各基因的诱导水平显示所选择的簇极为类似。峰3在相同浓度下产生了与未聚乙二醇化IGF-I类似的表达谱并且比PEG-IGF混合物和其它峰更有效。有意义的是，峰2引起了与PEG-IGF混合物类似的转录反应。与生物活性一致，峰1表现出了最弱的转录反应，这表明聚乙二醇化干扰了受体相互作用。

实施例5和6

rhIGF-I和单PEG-IGF-I导致的体外IGF-IR磷酸化

为了对IGF-IR活化进行体外分析，使用稳定表达人IGF-IR的NIH-3T3细胞。在血清饥饿过夜后，使用增加剂量的rhIGF-I或相应PEG-IGF-I异构体(0.003-10μg/ml)处理细胞。按照上述进行磷酸化IGF-IR的蛋白质印迹分析并且使获得的剂量响应曲线用单点结合动力学拟合，包括希尔系数(n_H)；结合曲线的定量数据如图6中的表中所示。从rhIGF-I的剂量响应曲线(图5A)得到EC₅₀为6.3nM并且几乎以全或无方式出现，其中n_H为2.27(图6)。相反，单PEG-IGF-I的峰1表现出不饱和的明显剂量响应，n_H为0.34且估计的EC₅₀为91.5nM(图5B，6)。峰2和3(图5C和5D)表现出类似的结合亲和力，其中EC₅₀值分别为13.4和21.5nM(图6)。在两种情况中，n_H是有规律性的，分别为1.27和1.19。峰混合物表现出类似的IGF-IR活化模式，其中亲和力轻度降低，EC₅₀为28.8nM且规律性的n_H为1.28(图5E，7)。最后，PEG-Des(1-3)-IGF-I峰3具有所有PEG异构体中最高的亲和力，其中EC₅₀为10.8nM且规律性的n_H为1.08(图5F，7)。该数据表明，除峰1外的所有峰均可特异性活化人IGF-IR，其与rhIGF-I相比亲和力丧失2-5倍。

实施例7

rhIGF-I对2月龄PS2APP小鼠的体内Aβ降低

将双重转基因PS2APP小鼠用于分析rhIGF-I对大脑Aβ积累的短期作用。我们使用50μg/kg rhIGF-I腹腔注射处理这些小鼠并且在注射后2小时分析了皮质Aβ。图7A表示来自2月龄小鼠的大脑提取物的蛋白质印迹。而APP、C99和对照蛋白(清蛋白)水平显示未因rhIGF-I而改变，在rhIGF-I注射后2小时Aβ水平下降。进行定量分析并且计算相应的像素强度比以便获得有关rhIGF-I对Aβ产生的潜在作用的信息。这种分析揭示出APP/对照蛋白(对照的97.5±5.7％)和C99/APP(对照的87.2±9.8％)比值未改变，表明在使用rhIGF-I处理后2小时转基因APP表达和APP加工均未改变(图7B)。相反，Aβ/APP显著降至对照的68.4±7.1％(p＜0.01)并且C99/Aβ增加至对照的157.9±16.6％(p＜0.01)，表明rhIGF-I降低了Aβ。这些数据共同表明，用rhIGF-I处理幼小PS2APP小鼠2小时主要增加了Aβ从大脑中的清除率。

实施例8

rhIGF-I对PS2APP小鼠的体内Aβ降低的时程

为了评价这种rhIGF-I对可溶性大脑Aβ的短期作用的时程，通过腹腔注射50μg/kg rhIGF-I处理无大脑斑块的幼小的PS2APP小鼠(2月龄)并且在此后2、6或24小时检测皮质APP、C99、Aβ和肌动蛋白水平。APP/清蛋白和C99/APP比值在任意研究的时间点处均未因rhIGF-I而显著改变。在注射后2小时观察到了rhIGF-I对Aβ/APP的降低，而在6和24小时后这种作用不存在(图8A)。类似地，仅在2小时时可检测到通过C99/Aβ比值监测的Aβ减少的增加，并且在6和24小时时消失(图8B)。这表明rhIGF-I对Aβ清除率的作用可能因在血流中分离的IGF-I的半衰期短而具有短的持续时间。

实施例9

峰1-3在2月龄APP和PS2APP小鼠的体内Aβ清除效率中的对比分析

在本实施例中，共同显示了PEG-IGF-I峰1-3的数据以便对Aβ降低和Aβ清除的效率进行直接比较。与rhIGF-I类似，APP/肌动蛋白(本文将肌动蛋白用作对照蛋白)或C99/APP比值未因任何浓度的峰1、2或3而改变。峰3在腹腔注射后6小时时在降低Aβ/APP方面具有最高的效率(图9A)。相反，峰1在整个测试浓度范围内均无活性并且峰2仅在所用的最高浓度(500μg/kg)下对降低Aβ/APP发挥了显著作用。类似地，正如图9B中所示，峰3仅在低剂量(15-50μg/kg)下为在增加C99/Aβ比值(作为增加的Aβ清除率的代表)方面具有活性的化合物。此外，在该评价中，峰1无活性并且峰2仅在500μg/kg下发挥出显著作用。这些数据共同表明，在该体内实验范例中峰3为最具有活性的单PEG-IGF-I异构体。图11表示了仅双重转基因PS2APP小鼠模型中的结果。

实施例10

峰3对PS2APP小鼠的体内Aβ降低的时程

在腹腔注射后6小时，50μg/kg的峰3在降低大脑Aβ水平方面发挥显著作用。为了测试这种作用维持多长时间，我们分析了来自用50μg/kg峰3处理2、6、24、48和72小时的PS2APP小鼠的大脑提取物。在整个时间期限内均未观察到APP/肌动蛋白或C99/APP比值的显著改变。相反，在腹腔注射后6、24和48小时时Aβ/APP水平显著下降(分别为p＜0.05、p＜0.001和p＜0.01)，表明峰3在至少48小时内具有降低Aβ的作用(图10A)。代表Aβ清除率不依赖于Aβ产生的C99/Aβ比值(因为C99/APP保持恒定)以极为类似的时程显著增加，在注射后至少24小时内得以充分维持(图10B)。这些数据共同表明峰3能够降低PS2APP的大脑Aβ。图12表示仅双重转基因PS2APP小鼠模型中的结果。

实施例11

与IGF结合蛋白IGFBP4(BP4)和IGFBP5(BP5)的结合

由Shimasaki，S.，Mol.Endocrinol.4(1990)1451-1458鉴定并且克隆了IGFBP4(SwissProt 22692)。由Kiefer，M.C.，Biochem.Biophys.Res.Commun.176(1991)219-225鉴定并且克隆了IGFBP5(SwissProt 24593)。两种结合蛋白均以重组方式在大肠杆菌中产生。

为了对蛋白质相互作用进行表面等离振子共振(SPR)分析，使用Biacore 3000仪器。试验和反应缓冲液为在25℃下的HBS-P(10mMHEPES，150mM NaCl，0.005％聚表面活性剂，ph 7.4)。在12℃下预冷却所有样品。在5μg/ml浓度下使IGFBP4和IGFBP5进行胺偶联。在CM5芯片上的偶联产生～700RUs的负荷信号。以1.23nM-100nM间的5个浓度注射聚乙二醇化IGF-I样品(分析物)5分钟(结合期)并且以50μl/分钟的流速用HBS-P洗涤5分钟。通过一次注射100mM HCl 1分钟再生芯片表面。

芯片、分析方式和注射的序列对应于表2中的描述。通过使用1∶1Langmuir结合模型进行数据评价。

表2：

  芯片  配体  分析物  ka(l/Ms)  kd(l/s)  KD(M)  CM5  BP4  IGF-1  4.0×10⁶  7.2×10^-4  1.8×10^-10  CM5  BP4  40kDa/NT-RRRK  5.4×10⁴  1.5×10^-3  2.8×10^-8  CM5  BP4  40kDa/RRRK  7.1×10⁴  6.8×10^-4  9.5×10^-9  CM5  BP4  组合物  6.9×10⁴  5.3×10^-4  7.7×10^-9  CM5  BP5  IGF-1  9.6×10⁶  1.6×10^-3  1.7×10^-10  CM5  BP5  40kDa/NT-RRRK  1.1×10⁵  2.1×10^-3  2.0×10^-8  CM5  BP5  40kDa/RRRK  1.5×10⁵  2.0×10^-3  1.3×10^-8  CM5  BP5  组合物  1.1×10⁵  2.5×10^-3  2.3×10^-8

缩写：

40kDa：40kDa支化PEG

40kDa/NT-RRRK：使用40kDa PEG在N-末端聚乙二醇化的RRRK

40kDa/RRRK：使用40kDa PEG在K68赖氨酸聚乙二醇化的RRRK

组合物：40kDa/NT-RRRK和40kDa/RRRK的组合物(1∶1)

这些结果表明所有聚乙二醇化IGF样品在类似范围内有效结合IGFBP4和IGFBP5。所有聚乙二醇化样品与未聚乙二醇化IGF相比均表现出显著下降的结合率常数。

从样品曲线中扣除阴性对照数据(例如缓冲液曲线)以便校准系统内在基线漂移和信躁下降。

实施例12

配体导致的IGF-IR自磷酸化

为了测定本发明多肽活化IGF-IR并且诱导IGF-IR磷酸化的能力，用本发明的多肽刺激过表达IGF-IR的细胞且随后通过ELISA分析IGF-IR磷酸化状态。

为了进行ELISA，用100μl抗人IGF-lRα(0.5mg/ml)的单克隆抗体(在含有3％BSA的PBST中以1∶350稀释)包被96-孔链霉抗生物素包被的聚苯乙烯平板(Nunc)。于室温下在平板振荡器上孵育1小时后，除去包被溶液并且用200μl PBST/孔将平板洗涤三次。

将IGF-IR转染的NIH-3T3细胞在补充了2mM L-谷氨酰胺(Gibco，目录号25030-024)和0.5％热灭活FCS(PAA，目录号A15-771)的高葡萄糖MEM Dulbecco培养基(DMEM)(PAA，目录号E15-009)中铺板。为了测定EC₅₀值，在37℃和5％CO₂条件下将使用1.3×10⁴个细胞/孔接种的96孔平板培养2天。

在使用低血清培养基培养48小时后，谨慎除去培养基并且换成用50μl相应培养基稀释的不同浓度的本发明多肽。在37℃和5％CO₂条件下孵育10分钟后，通过抽吸谨慎除去培养基并且每孔添加120μl冷裂解缓冲液(50mM Tris pH 7.5，1mM EDTA，1mM EGTA，20％甘油，1％Triton-X100，100mM NaF，1mM NaVO₄，Complete^TM蛋白酶抑制剂)。将平板与裂解缓冲液于4℃下在平板振荡器上孵育15分钟并且此后将100μl的孔内含物转入用抗人IGF-I Rα的单克隆抗体包被的ELISA平板上。于室温下在平板振荡器上将裂解物孵育1小时以使IGF-IR结合俘获抗体并且在此后谨慎抽吸。通过用每次200μl PBST/孔洗涤三次除去未结合的物质。

为了检测结合的磷酸化IGF-IR，将100μl抗人IGF-IRα的多克隆IgG兔抗体(在3％BSA/PBST中以1∶12650稀释)加入到各孔中，随后于室温下在平板振荡器上再孵育1小时。再次谨慎除去孔内含物并且用200μl PBST/孔将各孔洗涤三次。为了检测多克隆的兔抗体，将100μl HRP(CellSignaling Technology Inc.USA)偶联的抗兔IgG多克隆抗体(在3％BSA/PBST中以1∶6000稀释)加入到各孔中。于室温下在振荡器上孵育1小时后，通过用200μl PBST/孔将平板洗涤6次除去未结合的检测抗体。作为用于抗体偶联的HRP的底物，将100μl的3，3′-5，5′-四甲基联苯胺加入到各孔中，随后于室温下在平板振荡器上再孵育0.5小时。

在用25μl/孔1M H₂SO₄反应终止后通过测定在450nm波长处的吸收进行定量。

以10nM IGF-I作为100％(max)并且无IGF-I作为0％(min)对照，通过下列公式将获得的样品OD450值转化成活化百分比∶活化百分比＝(样品-min)/(max-min)。将所得到的EC₅₀(在IGF-1R半数最大活化下的多肽浓度)值概括在表3中。

表3

  样品  EC50[nM]  “STDEV”  K68-RRRK 20kDa线性  2.1  0.2  NT-RRRK 20kDa线性  29.6  1.9  组合物20kDa线性  7.6  K68-RRRK 30kDa线性  4.7  0.9  NT-RRRK 30kDa线性  44.5  5.0  组合物30kDa线性  9.2  1.1  组合物40kDa支化  16.4  0.7  K68-RRRK 20kDa支化  1.5  1.1  组合物20kDa支化  5.1  0.5  NT-RRRK 40kDa支化  19.9  1.1

缩写参见实施例11。

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序列表

<110>    弗·哈夫曼-拉罗切有限公司(F.Hoffmann-La Roche AG)

<120>    胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和聚乙二醇的缀合物

<130>    22904

<150>    EP 04030415

<151>    2004-12-22

<160>    1

<170>    PatentIn版本3.2

<210>    1

<211>    105

<212>    PRT

<213>    人(Homo sapiens)

<400>    1

Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe

1               5                   10                  15

Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly

            20                  25                  30

Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys

        35                  40                  45

Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu

    50                  55                  60

Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp

65                  70                  75                  80

Met Pro Lys Thr Gln Lys Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly

                85                  90                  95

Ser Ala Gly Asn Lys Asn Tyr Arg Met

            100                 105