表达肠毒素大肠杆菌黏附素基因的重组菌及其在卵黄抗体饲料中的应用

摘要

本发明属于动物营养与饲料科学技术领域，同时涉及动物分子生物学技术的应用。具体地，本发明涉及一种表达猪肠毒素大肠杆菌K88和F18黏附素基因faeG和fedF的重组大肠杆菌的构建及其在制备卵黄抗体饲料中的应用。该表达肠毒素大肠杆菌K88ac黏附素基因faeG和F18ac黏附素基因fedF重组质粒的大肠杆菌是利用连接肽构建faeG和fedF融合基因，并将此融合基因插入原核表达载体pET28a中构建而成的。本发明的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET－8818，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M207090。本发明还公开了保藏号为CCTCC NO：M207090的重组大肠杆菌在制备卵黄抗体饲料中的应用。

说明书

技术领域

本发明动物营养学与饲料科学技术领域，同时涉及动物分子生物学的应用。具体地，本发明涉及一种表达猪肠毒素大肠杆菌K88和F18黏附素基因faeG和fedF的重组菌及其在制备卵黄抗体饲料中的应用。

背景技术

在规模化养猪生产中，肠毒素大肠杆菌(简称ETEC)是引起新生仔猪和断奶仔猪腹泻主要的致病因素。K88是引起断奶仔猪腹泻ETEC中最主要的一种菌毛基因型(Osek J等.Rapid and specificdifferentiation of enterotoxin-producing Escherichia coli strains from other gram-negative enteric bacteriausing multiplex PCR.Berl Munch Tierarztl Wochenschr，2000，113：265-70)；其中以K88ac亚型最为常见。在丹麦，Ojeniyi等(Ojeniyi B等.Detection of fimbrial and toxin genes in and their prevalence inpiglets with diarrhea.The applfication of colony hybridization assay，polymerase chain reaction andphenotype assays.J Vet Med B，1994，41：49-59)；在德国，Wittig等(Wittig W等.Prevalence of thefimbrial antigens F18 and K88 and of enterotoxins and verotoxins among Escherichia coli isolated fromweaned pigs.Zentralbl Bakteriol，1995，283：95-104)；国内的成大荣(成大荣.断奶仔猪源人肠杆菌毒力因子的分子流行病学及F18菌毛部分特性的研究.[博士学位论文].扬州：扬州大学图书馆，2005)的调查表明，F18是引起断奶仔猪水肿病和腹泻的另一主要的致病性大肠杆菌，与致断奶仔猪腹泻ETEC相关的2134P、8813、8199等大多属于F18ac(Wittig W等.Expression and plasmid transfer ofgenes coding for the fimbrial antigen F107 in porcine Escherichia coli strains.Zentralbl Bakteriol，1994，281：130-139)。

用提纯的K88或F18菌毛免疫母鸡，制备针对ETEC K88或F18的卵黄抗体，体外可以阻断K88或F18菌株对仔猪肠细胞的黏附，添加于饲料中，可以有效降低仔猪腹泻率，并在一定程度上改善仔猪的生长性能(Yokoyama H等.Passive protective effect of chicken egg yolk immunoglobulinsagainst experimental enterotoxigenic Escherichia coli infection in neonatal piglets.Infect Immun，1992，60：998-1007；Imberechts H等.Chicken egg yolk antibodies against F18ab Fimbriae of Escherichiu coliinhibit shedding of F18 Positive E.coli by experimentally infected pigs.Vet Micro，1997，54：329-341；Marquardt R R等.Passive protective effect of egg-yolk antibodies against enterotoxigenic Escherichiucoli K88⁺ infection in neonatal and early-weaned piglets.FEMS Immunol Med Microbiol，1999，23：283-288)。然而，上述资料中主要采用直接从ETEC菌株中分离提纯的方法制备菌毛蛋白抗原，由于一般ETEC的菌毛表达量十分有限，而且一些菌毛体外表达微弱甚至不表达，因而由分离提纯的方法获得的菌毛抗原量少，成本高，不适用于卵黄抗体的规模化生产。

faeG基因编码K88菌毛的主要结构蛋白和黏附素(Gaastra W等.The nucleotide sequence of thegene encoding the K88ab protein subunit of porcine enterotoxigenic Escherichia coli.FEMS MicrobiolLett，1981，12：41-46)。此蛋白不仅含有大量原K88菌毛抗原决定簇(Gaastra W等.The nucleotidesequence of the K88ad protein subunit of porcine enterotoxigenic Escherichia coli.FEMS Microbiol Lett.1983，18：177-183)，而且是K88受体的主要结合位点(Bakker D等.Characterization of the antigenicand adhesive properties of FaeG，the major subunit of K88 fimbriae.Mol Microbiol，1992，6：247-255)。fedF编码的蛋白不仅是F18菌毛合成所必需的亚单位，还是产生黏附作用的主要蛋白(Smeds A等.Mapping the binding domain of the F18 Fimbrial adhesin.Infect Immune，2003，71：2163-2172)。faeG和fedF基因编码的蛋白均具有较好的抗原性.是设计ETEC亚单位疫苗的首选目标基因。

将ETEC K88黏附素基因faeG重组到含有T7噬菌体强启动子的表达载体，并转化于能使表达蛋白稳定存在的受体菌BL21(DE3)中，可以获得稳定高效表达K88ac菌毛亚单位蛋白的重组菌株，其FaeG表达量约占菌体总蛋白的30％，并具有较好的免疫原性(赵主江等.K88菌毛蛋白亚基基因克隆、表达及重组蛋白抗血清制备.上海农业学报，2000，16：38-41)。Smeds等(Smeds A等.Characterization of the adhesin of Escherichia coli F18 Fimbriae.Infect Immune，2001，69：7941-7945)对大肠杆菌F18菌毛菌毛的特性分析表明，抗FedF抗体能够抑制大肠杆菌对猪肠细胞的黏附；且FedF-MBP(麦芽糖结合蛋白)融合蛋白能与猪肠细胞发生特异性黏附(成人荣.断奶仔猪源大肠杆菌毒力因子的分子流行病学及F18菌毛部分特性的研究.[博士学位论文].扬州：扬州大学图书馆，2005)。

基于以上的发现，我们利用PCR技术扩增faeG和fedF的融合基因，并构建表达该融合基因的重组菌株，并以免疫蛋鸡制备卵黄抗体的方式比较重组蛋白与天然蛋白的免疫原性及其制备的卵黄抗体应用效果。

发明内容

本发明的第一个目的是构建表达肠毒素大肠杆菌K88ac黏附素基因faeG和F18ac黏附素基因fedF双基因的重组菌株，获得一种免疫原性较好生产成本更低的双价重组菌毛蛋白抗原

本发明的第二个目的是上述的双价重组菌毛蛋白抗原在制备抗ETEC卵黄抗体中的应用，其中的应用主要是在制备卵黄抗体饲料中的应用。

本发明通过以下技术方案实施：

一种表达K88ac和F18ac双价抗原的重组菌株是将扩增获得的faeG和fedF融合基因插入原核表达载体pET28a的SacI与HindIII位点构建而成，含有该质粒的大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)/pET-8818，已于2007年6月28日递交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCCNO：M207090。

所述的重组质粒，它是利用连接肽构建faeG和fedF融合基因，并将该融合基因插入原核表达载体pET28a中构建的。该重组质粒是pET-8818。

一种K88ac黏附素基因faeG和F18ac黏附素基因fedF的双价重组菌毛蛋白，是由保减号为CCTCCNO：M207090的大肠杆菌所表达的产物。

本发明的技术方案如下(详细技术步骤参见“具体实施方式”部分)：

下列技术步骤中未经特别说明的方法均参照J.萨姆布鲁克(J.萨姆布鲁克，E.E弗里奇，T.曼尼阿蒂斯著，金冬雁等译。分子克隆实验指南。北京：科学出版社，1989年版)。

一、表达K88ac黏附素基因faeG和F18ac黏附素基因fedF基因重组质粒pET8818的构建

根据Genebank中已报道的faeG基因序列(登录号M29375)和fedF基因序列(登录号AY970782)设计带有限制性内切酶酶切位点的引物，其中在faeG的下游引物和fedF的上游引物设计中引入连接肽(Gly₄Ser)₃序列。以大肠杆菌K88ac标准菌株C83715和大肠杆菌F18ac菌株2134P的基因组为模板，通过PCR扩增的方法构建由(Gly₄Ser)₃连接faeG和fedF的融合基因，命名为faeG-linker-fedF。

将融合基因faeG-linker-fedF的PCR扩增产物插入至pMD-18T克隆载体中，构建含有融合基因faeG-linker-fedF的克隆质粒，经PCR和酶切鉴定证实构建正确，命名为pMD-8818。分别用SacI和HindIII酶切pMD-8818后，将纯化回收的酶切产物与用同样酶切的pET28a(+)表达载体质粒连接，获得融合基因的原核表达质粒，经PCR与酶切鉴定证实构建正确，命名为pET-8818。

二、FaeG-FedF融合蛋白的诱导表达及提取纯化

将测序正确的重组质粒pET-8818，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，构建重组菌BL21(DE3)/pET-8818，并利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)进行诱导表达。通过对BL21(DE3)/pET-8818表达产物的可溶性分析发现BL21(DE3)/pET8818诱导表达产物以包涵体形式存在，采取超声波破碎法提取包涵体，通过包涵体的变性和复性纯化BL21(DE3)/pET-8818表达产物FaeG-FedF融合蛋白。SDS-PAGE检测提纯后的菌毛蛋白纯度，Bradford法测定蛋白质浓度。

三、卵黄抗体的制备工艺

将提纯的FaeG-FedF融合蛋白溶液中加入灭菌的吐温-80至终浓度为4％，充分混合后再与等体积的白油佐剂(94％白油，6％司本-80，2％硬脂酸铝)混合，并充分乳化制成蛋白浓度为500μg/mL的油乳苗。在20周龄开产蛋鸡胸肌两侧分别多点注射500μL浓度为500μg/mL的FaeG-FedF融合蛋白油乳苗，两周后同样方法加强免疫两次，二免后一周开始收集鸡蛋。采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)监测卵黄抗体效价。

四、FaeG-FedF融合蛋白免疫制备的卵黄抗体应用效果评价

通过卵黄抗体体外抑制ETEC K88ac和F18ac粘附试验，验证融合蛋白FaeG-FedF免疫制备的卵黄抗体抑制ETEC K88ac和F18ac粘附猪肠上皮细胞的作用。选择144头24±3日龄断奶仔猪，按血缘、断奶重、性别和日龄等相对一致原则随机分为2组，每组各72头。口粮中分别给予1.5％的普通全蛋粉利1.5％FaeG-FedF融合蛋白免疫制备的喷雾干燥高免全蛋粉，进行断奶仔猪饲养试验。试验结束后添加1.5％高免全蛋粉显著降低了仔猪腹泻率(P＜0.05)和腹泻指数(P＜0.01)，并提高仔猪的饲料转化率(P＜0.05)。

附图说明

图1显示了表达K88ac和F18ac菌毛蛋白融合基因的重组质粒pET-8818构建图

图2显示了表达K88ac和F18ac菌毛蛋白融合基因的重组质粒pET-8818的酶切鉴定结果，图中：1，2：pET-8818/NcoI+SacI；M1：DL2000 DNA Ladder；M2：DL15000 DNA Ladder

图3显示了表达K88ac和F18ac菌毛蛋白融合基因重组菌BL21(DE3)/pET-8818诱导表达结果；图中：1：IPTG诱导后的BL21(DE)/pET-8818；2：BL21(DE)/pET-28a；M：Protein markerSM-0431(MBI)

图4显示了以融合蛋白FaeG-FedF为免疫原制备卵黄抗体工艺流程图

图5显示了卵黄抗体体外抑制ETEC(肠毒素大肠杆菌)K88ac粘附试验结果，图中：C为对照组；T为试验组

图6显示了卵黄抗体体外抑制大肠杆菌F18ab和F18ac粘附试验结果。图中：C1为F18ac对照组；C2为F18ab对照组；1为F18ac试验组；2为F18ab试验组

具体实施方式

下列具体实施例中未经特别说明的方法均参照J.萨姆布鲁克(J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯著，金冬雁等译。分子克隆实验指南。北京：科学出版社，1989年)。

实施例1：表达K88ac黏附素基因faeG和F18ac黏附素基因fadF基因重组质粒pET8818的构建

1材料和方法

1.1菌株和质粒载体

大肠杆菌K88ac标准菌株C83715购自中国兽医药品监察所。大肠杆菌F18ac菌株2134P由扬州大学兽医院成大荣教授惠赠。

大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)以及质粒载体pET-28a购白Novagen公司。

克隆载体pMD18-T购自大连宝生物公司(Takara)。

1.2培养基

LB肉汤(LB Broth)：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，蒸馏水定容至1000mL，调节pH值至pH7.0，121℃1.05kg/cm²高压蒸汽灭菌20min，室温保存备用。

LB营养琼脂(LB Nutrient Agar)：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，蒸馏水定容至1000mL，调节pH值至7.0，另加15g琼脂粉，121℃1.05kg/cm²高压蒸汽灭菌。倾倒平板，待培养基凝固后倒置于4℃保存备用。若制备抗性平板，则待培养基温度降至50℃左右时，加入相应的抗生素(具体加入的抗生素由下面的实施步骤确定)后倾倒平板即可。

胰酶消化大豆肉汤(Tryptone soyabroth，TSB)：胰酪蛋白胨17g，植物蛋白胨3g，NaCl5g，K₂HPO₄2.5g，葡萄糖2.5g，用蒸馏水定容至1000ml，调节pH值至7.4，121℃1.05kg/cm²灭菌20-30min备用。

1.3试剂

Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂、PCR Buffer以及Protein Molecular Weight Marker均为Fermentas公司产品。

DNA Ladder DL2000、DNA Ladder DL15000、限制性内切酶NcoI、SacI、SalI和HindIII，T4 DNA连接酶等为大连宝生物工程有限公司(Takara)产品。

DNA回收试剂盒、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)、胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉等为上海生工生物工程有限公司产品。

1.3融合基因faeG-linker-fedF的构建

1.3.1引物设计

根据Genebank中已报道的faeG基因序列(登录号M29375)设计引物faeG-U和faeG-D，其中上游引物faeG-U引入SacI酶切位点，下游引物faeG-D引入连接肽(Gly₄Ser)₃序列，扩增834bp N端带有(Gly₄Ser)₃的faeG基因，命名为faeG-linker。根据Genebank中已报道的fedF基因序列(登录号AY970782)设计引物fedF-U和fedF-D，其中上游引物fedF-U引入连接肽(Gly₄Ser)₃序列，下游引物fedF-D引入HindIII酶切位点，扩增879bp C端带有(Gly₄Ser)₃的fedF基因，命名为linker-fedF以faeG-linker和linker-fedF的PCR回收产物为模板，用faeG-linker上游引物和linker-fedF下游引物通过PCR扩增的方法将两个目的片断串联起来，最终获得1668bp由(Gly₄Ser)₃连接.faeG和fedF的融合基因，命名为faeG-linker-fedF。上述引物均由上海生工生物工程公司合成。引物序列如下(引物的下划线为酶切位点，英文字母的加粗斜体部分为连接肽(Gly₄Ser)₃的序列)：

faeG-U：5’-TTTGAGCTCATGGCTGGTGATTTCAATGG-3’

faeG-D：5’-GCTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCGTAATAAGTTATTGCTACGTTCAG-3’

fedF-U：5’-GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGAGCCAAGTAGACAAGTCTGTT-3’

fedF-G：5’-TTTAAGCTTTTACTGTATCTCGAAAACAATGGGCAC-3’

1.3.2K88ac和F18ac黏附素基因DNA模板的制备

从以K88ac标准菌株C83715和大肠杆菌F18ac菌株2134P的TSB平板中挑取单菌落上分别装有3mLTSB培养基的细菌瓶中，37℃振荡过夜。分别从3mLC83715和2134P的菌液中各吸取500μL于2个1.5mL的灭菌离心管中，12000r/min离心30s，弃尽上清。分别加入200μL ddH₂O，用微量移液器吹打均匀，100℃水浴5min。12000r/min离心5min，取上清为模板。

1.3.3融合基因faeG-linker-fedF的PCR扩增

利用faeG-U和faeG-D扩增faeG-linker片断，利用fedF-U和fedF-D扩增linker-fedF片断，然后以faeG-linker和linker-fedF的PCR回收产物为模板，用faeG-linker上游引物和linker-fedF下游引物扩增。PCR扩增条件为：94℃5min变性后进入循环，循环参数为：94℃40s，58℃45s，72.0℃1min，35个循环后72℃延伸10min。反应结束后于1.0％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测。1.4表达K88ac黏附素基因faeG和F18ac黏附素基因fedF基因重组质粒的构建

按照图1所示的路线，构建表达K88ac黏附素基因faeG和F18ac黏附素基因fedF基因重组质粒pET8818。

将融合基因faeG-linker-fedFDNA片断插入到克隆载体pMD18-T中，构建克降质粒pMD-8818将克隆质粒pMD-8818用限制性内切酶SacI和HindIII进行酶切并回收酶切产物，将回收纯化的pMD-8818酶切产物与用同样酶进行酶切的pET28a(+)表达载体质粒连接，构建含有融合基因faeG-linker-fedF的重组质粒pET-8818，并进行酶切鉴定。将酶切鉴定正确的重组质粒pET-8818迭至大连宝生物公司(Takara)测序。

2实施效果

重组质粒pET-8818酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳后，观察到约1700bp与5200bp左右两条带(图2)，表明重组质粒构建正确。同上采取双向测序，将测序结果与目的基因序列在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上进行BLAST比对，结果显示，faeG部分的序列回源性为99％，linker部分和fedF部分的序列同源性达100％。

实施例2：FaeG-FedF融合蛋白的诱导表达及提取纯化

1材料与方法

1.1试剂

胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(lsopropyl-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)、β-巯基乙醇、十二烷基肌氨酸钠(简称SKL)、聚乙二醇4000(简称PEG4000)、氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽为上海生工生物工程有限公司产品。

1.2抗体

鼠抗His·Tag抗体为Novagen公司产品，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，购白SBA公司。

1.3缓冲液

BufferA：50mol/LTris，0.5mol/LEDTA，50mol/LNaCl，5％甘油，调节pH至pH8.0，使用时添加0.5mmol/L的二硫苏糖醇。

TE(pH8.0)：10mmol/L Tris·Cl，1mmol/L EDTA。

PBS(pH7.4)：PBS：称取8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa₂HPO₄，0.24g KH₂PO₄，溶于800mL ddH₂O中，调pH至7.2，定容至1000mL。

1.3融合蛋白FaeG-FedF的诱导表达及SDS-PAGE检测

将重组质粒pET-8818转化至大肠杆菌BL21(DE3)受体菌中，并以1％的量接种到装有3mLLB(含30pg/mL Kan)培养基的细菌瓶中，37℃振荡培养8h或过夜。将重组菌BL21(DE3)/pET-8818的培养物再以1％体积的量分别接种到两个装有3mL LB(含30μg/mL Kan)培养基的细菌瓶中。其中一个37℃振荡培养7h，作为未诱导的对照，另一个37℃振荡培养3h后开始诱导，添加IPTG至终浓度1mmol/L，继续37℃振荡培养4h。结束后各取出500μL菌液于新的1.5mL离心管中，12000r/min离心30s。去上清，加入50μL样品溶解液，用枪吹打均匀。100℃水浴5min，12000r/min离心5min，取10μL上清进行SDS-PAGE检测。此外，以鼠抗His·Tag抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗，用Western blotting检测表达产物

1.4表达产物可溶性分析

将上述诱导表达的重组菌BL21(DE3)/pET-8818培养物以1％体积的量接种到一个装有5mLLB(含30μg/mL Kan)培养基的细菌瓶中，37℃振荡培养8h，4℃放置过夜。将菌液倒入装有50mLLB(含30μg/mL Kan)培养基的盐水瓶中，在37℃诱导表达。将菌液转入两个50mL离心管中，4℃，8000r/min离心5min。弃上清，菌体用1/10体积的Buffer A重悬，180w超声波处理8次，间隔10s/次。4℃，12000r/min离心10min，将上清转入另一新的50mL离心管中，沉淀用等体积的Buffer A重悬。从上清和沉淀中各取50μL加入等体积的样品溶解液，处理好样品进行SDS-PAGE检测

1.5融合蛋白FaeG-FedF的提取纯化

将200mL的重组菌BL21(DE3)/pET-g818培养物5000r/min离心10min收集菌体，再将菌体重悬于20mL的Buffer A中，并添加0.05％的溶菌酶，37℃温育15min，然后进行超声波破碎。超声强度设为180W，冰浴超声破碎10次左右，每次20s-30s，间隔2min，直至溶液变为清亮为佳。将破碎后的混合液12000r/min离心10min，去上清，PBS缓冲液(pH7.4)洗涤沉淀3次，收集沉淀。

将上述收集的沉淀重悬于含0.3％SKL的Buffer A中，充分振荡混匀后室温静置30min-2h。将溶液分装至透析袋内，加入终浓度为0.2％的PEG4000与1mmol/L氧化型：还原型谷胱甘肽(摩尔比为1∶4)帮助变性的蛋白质复性即恢复天然构象，用大于20倍体积的TE(pH8.0)进行4℃搅拌透析复性、纯化，每4h换液一次，换液6次后收集蛋白溶液，过滤除菌后分装置-20℃冻存。用SDS-PAGE检测提纯后的菌毛蛋白纯度，Bradford法测定蛋白质浓度。

2实施效果

将重组质粒pET-8818转化至载体菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导后，SDS-PAGE检测发现，与在60kDa左右处出现一条明显的蛋白带，与预测的分子量大小一致，其表达量占菌体总蛋白的30％左右(图3)。

在本发明中，faeG-fedF融合基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达产物主要以包涵体形式存在

用鼠抗His·Tag抗体对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-8818诱导表达后的总蛋白进行Westernblotting检测，可以检测到大小约为60kDa的特异性阳性反应条带，表明BL21(DE3)/pET-8818诱导分泌的蛋白均能被鼠抗His·Tag抗体所识别，确证faeG-fedF融合基因在大肠杆菌BL21中表达成功。1L重组菌BL21(DE3)/pET8818菌液中可提取200mg以上的faeG-fedF融合蛋白。

实施例3：以FaeG-FedF融合蛋白为免疫原制备卵黄抗体

1材料与方法

1.1佐剂

白油佐剂：94mL白油，6mL司本-80，2g硬脂酸铝，混合均匀后，121℃1.05kg/cm²高压灭菌30min，冷却至室温备用。

1.2抗体

K88ac阳性血清抗体由中国科学院武汉病毒研究所实验动物中心制备，F18“a”单因子血清由扬州大学兽医院成大荣教授惠赠，辣根过氧化物酶标记的鼠抗鸡IgG购自Sigma公司

1.3缓冲液

PBSI缓冲液：NaCl10.0g；KH₂PO₄0.25g； Na₂HPO₄·12H₂O3.58g；KCL0.25g，溶于900mL蒸馏水中，1mol/LHCl调pH至7.2，用蒸馏水定容至1000mL，于121℃高压灭菌15min备用

PBSII缓冲液：NaCl8.0g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g，KCl0.2g，溶于900mL蒸馏水中，1mol/L HCl调pH至7.4，用蒸馏水定容至1000mL，于121℃高压灭菌15min备用

PBSIII缓冲液：NaCl8.0g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g，KCl，0.2g，溶于400mL.蒸馏水中，1mol/LHCl调pH至7.4，用蒸馏水定容至500mL，于121℃高压灭菌15min备用

PBSIV缓冲液：NaH₂PO₄·2H₂O4.37g，Na₂HPO₄·12H₂O25.81g，溶于900mL蒸馏水中，1mol/LHCl调pH至7.2，用蒸馏水定容至1000mL，于121℃高压灭菌15min备用

包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液)：NaHCO₃2.93g；Na₂CO₃1.95g；溶于900mL蒸馏水中，10mol/LNaOH调pH至9.6，用蒸馏水定容至1000mL

洗涤液(PBS-T)：含0.05％吐温-20的PBSII

保温液(PBS-BSA)：含3％牛血清白蛋白的PBSII

底物液：邻苯二胺40mg，溶于100mLpH5.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液(0.2mol/LNa₂HPO₄51.4mL，0.1mol/L柠檬酸48.6mL，蒸馏水100mL混匀即可)，在加入30％H₂O₂0.15mL即可，现配现用

终止液：2mol/LH₂SO₄溶液(浓硫酸22.2mL，蒸馏水177.8mL，混匀即可)

1.4 FaeG-FedF融合蛋白油乳苗的制备

将提纯后的FaeG-FedF融合蛋白溶液中加入121℃高压灭菌30min的吐温-80至终浓度为4％，充分混合后再与等体积的白油佐剂混合，并充分乳化制成蛋白浓度为500μg/mL的油乳苗。

1.5蛋鸡的免疫

选择1700只28周龄左右海兰褐蛋鸡随机分为三组，空白组200只，FaeG-FedF融合蛋白组1000只。空白组每只鸡分别胸肌注射1mL(两侧各500μL)生理盐水；FaeG-FedF融合蛋白组则胸肌注射1mL FaeG-FedF融合蛋白油乳苗。首免2周后，各组分别用1mL生理盐水与1mLFaeG-FedF融合蛋白油乳苗加强免疫一次；间隔2周再采用同样方式进行第三次免疫。

1.6喷雾干燥全蛋粉的制备

收集鸡蛋，经喷雾干燥(140□进气，65□出气)加工成全蛋粉。取1g卵黄粉，用4mLPBSII混合，再加入8mL氯仿，室温放置1h，然后3000×g离心20min，取上清进行效价测定。

1.7间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价

二免后每周各组均随机采集30枚鸡蛋样品，间接酶联免疫吸附试验监测卵黄抗体效价的变化。当卵黄抗体水平达到要求后便开始收集鸡蛋，进行喷雾干燥。

用方阵滴定法确定最佳抗原包被量与抗体稀释度。取酶标板(8×12孔)，横排将抗原从1∶20倍比稀释到1∶2560，竖排将抗体从1∶20倍比稀释至1∶640，进行ELISA试验。整个实验重复三次，综合三次试验结果，以OD₄₂₀值大幅度降低时抗原稀释度的前—稀释度对应的蛋白含量为最佳抗原包被浓度，以最佳抗原包被浓度下阳性抗体OD₄₂₀值大幅度降低时血清稀释度的前—稀释度对应的为抗体最佳稀释度。

用100μL最佳包被浓度的K88ac菌毛蛋白溶液包被96孔聚乙烯板，4℃过夜(18h-24h)，弃去，用洗涤液冲洗3次，每次3min，弃去，然后用150μL的保温液37℃温育1h，弃去，如前洗涤3次，每孔加入100μL待测抗体(用PBSII进行1∶10、1∶20、1∶40等等的倍比稀释)37℃温育1h，弃去，如前洗涤5次，每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的酶标二抗稀释液(1∶15000，洗涤液稀释)，25℃包被30min，弃去，如前洗涤5次，最后每孔加入100μL底物液，显色后用50μL终止液终止反应，酶标仪检测OD₄₅₀值。样品OD₄₅₀值与阴性值之比大于2.1判为阳性，并以出现阳性反应的最高稀释度为抗体效价。

2实施效果

通过蛋鸡免疫试验证明重组蛋白FaeG-FedF具有免疫原性，能够引起蛋鸡免疫应答反应，并可以诱导产生抗ETEC K88和F18的特异性卵黄抗体。

实施例4：卵黄抗体应用效果评价

1材料与方法

1.1菌株

大肠杆菌K88ac标准菌株C83715购自中国兽医药品监察所。大肠杆菌F18ac菌株2134P和F18ab菌株F107/86由扬州大学兽医院成大荣教授惠赠。

1.2溶液

Giemsa染液：称Giemsa粉末0.5克，加几滴甘油研磨，再加入甘油(使加入的甘油总量为33mL)。56□中保温90-120min。加入33mL甲醇，置棕色瓶中保存，此为Giemsa原液。使用时用PBS稀释10倍。

1.3喷雾干燥全蛋粉

普通全蛋粉(SDEP)：收集品种和饲养条件一致的未免疫蛋鸡的鸡蛋，制备而成的喷雾干燥全蛋粉。

高免全蛋粉：含有由复性后FaeG-FedF融合蛋白抗原制备的特异性卵黄抗体的喷雾干燥全蛋粉，抗K88效价1∶17959，抗F18效价1∶8000。

1.4卵黄抗体体外抑制ETEC K88ac和F18ac粘附试验

卵黄抗体体外抑制ETEC K88ac和F18ac粘附试验是采用Yokoyama等(Yokoyama H等.Passiveprotective effect of chicken egg yolk immunoglobulins against experimental enterotoxigenic Escherichiacoli infection in neonatal piglets.Infect Immun，1992，60：998-1007)方法。首先分离制备新生存猪和断奶仔猪空肠上皮细胞，将1mL浓度为10⁶个/mL的肠上皮细胞悬液与1mL菌体浓度为10⁸CFU/mL的ETECC83715或2134P或F107/86菌体悬液混合后，玻片自然干燥、冰乙醇固定、Giemsa染液染色，在1000倍光学显微镜下观察。测定20个上皮细胞上粘附的细菌总数，计算平均每个细胞粘附的细菌数，作为对照组。将1mL菌体浓度为10⁸CFU/mL的ETEC C83715或2134P或F107/86菌体悬液与1mL由FaeG-FedF融合蛋白免疫制备的卵萸抗体液(抗K88效价1∶17959，抗F18效价1∶8000)混合，37℃温浴30min，再加入1mL上皮细胞悬液，37℃温浴30min，同样测定20个上皮细胞上粘附的细菌数，作为试验组记录结果。上述试验重复3次。

1.5预防断奶仔猪腹泻试验

1.5.1实验动物的选择与分组

选择144头24±3日龄三元杂交杜×长×大断奶仔猪，按血缘、入试重、性别和日龄等相对一致原则随机分为2组，每组各72头，分6栏饲养，以栏为重复，每栏12头，公母比例一致

1.5.2试验日粮

本试验采用单因子设计，日粮中添加1.5％的普通全蛋粉(SDEP)为对照组，添加1.5％的高免个蛋粉为试验组

试验持续28天，分为两阶段：前期为断奶后0-14，后期为断奶后15-28d。前期各组饲喂不同处理的日粮，后期各组的日粮一致。断奶后0-14d，参照NRC(1998)3-5kg生长猪饲养标准配制，并参考了理想蛋白质模式。断奶后15-28天，参照NRC(1998)5-10kg生长猪饲养标准。两组日粮营养水平基本一致。

1.5.3试验猪的饲养管理

所有饲养试验都在保育舍进行，均为漏缝地板，通风良好，具有较好的保温或防暑设备，环境温度基本维持在20-28℃。每天饲喂4次，每次以吃饱略剩料为限，自由饮水。做好防暑或保温措施，其余常规管理和免疫程序按规模化猪场养殖程序进行。及时发现病猪并予以治疗和记录，病程超过3日症状严重不愈者及时剔除，记录淘汰猪的耳号和体重。

1.5.4腹泻情况记录和生长性能的测定

试验前期每日晨记录仔猪粪便状况，按干、软、稀、水样分成0、1、2、3四级记录。统计时干便及软便为正常，稀便和水样便记为腹泻。

腹泻率＝试验期内仔猪腹泻头次数/(试验天数×猪头数)。

腹泻指数＝粪便评分之和/供试猪总头数，该指数越高，代表腹泻越严重。

粪便分值计算如下：0分：粪便干燥(正常)；1分：粪便软而成形；2分：粪便呈黄色液体(中度腹泻)；3分：粪便呈水样喷射状(重度腹泻)。

仔猪断奶重作为入试重，断奶后隔周于晨饲前逐头称重并记录体重。试验期内以栏为单位记录每日饲料消耗量。

1.5.5数据分析

平均日增重、采食量和料肉比等数据用表示，采用SAS统计分析的般线性模型，进行单因素方差分析(GLM程序)，并对差异显著因子(P＜0.05)水平的均值进行邓肯氏多重比较腹泻率和腹泻指数均采用x²检验(FREQ程序)。

2实施效果

2.1卵黄抗体对ETEC体外粘附细胞的抑制作用

在显微镜下(×1000)观察发现，肠上皮细胞较大呈圆形，Giemsa染色后显紫色；而细菌很小呈短杆状，显蓝色。未经卵黄抗体处理的ETECK88ac菌悬液与小肠上皮细胞作用后，较多的K88ac菌附着于细胞上；而经高免全蛋粉处理后的K88ac菌悬液与肠细胞作用后，只见零星的1-2个细菌附着于细胞上，有的细胞上甚至未见到细菌粘附(图5)。

表1卵黄抗体对肠毒素大肠杆菌K88ac体外细胞粘附的影响

处理粘附的细菌数¹⁾对照组试验组7.6±0.4^A1.0±0.2^B

¹⁾大写字母表示α＝0.01水平上的差异显著性

在3次重复试验，每组共观察的60个肠上皮细胞中，无抗体的对照组平均每个上皮细胞粘附7.6±0.4个K88ac；而试验组较对照组均极显著抑制了K88ac对肠上皮细胞的粘附作用，平均每个上皮细胞分别仅粘附1.0±0.2个细菌(p＜0.01)(见表1)。由FaeG-FedF融合蛋白免疫获得的卵黄抗体粉对细菌粘附肠上皮细胞均具有显著抑制作用。

表2卵黄抗体对F18ab和F18ac体外细胞粘附的影响

处理粘附的细菌数¹⁾F18ac对照组F18ac试验组F18ab对照组F18ab试验组9.1±0.3^A1.4±0.1^B8.9±0.2^A3.1±0.1^B

¹⁾大写字母表示α＝0.01水平上的差异显著性

²⁾本试验中高免全蛋粉抗F18ac的效价为1∶8000

高免全蛋粉是由融合蛋白FaeG-FedF免疫蛋鸡制备的喷雾干燥全蛋粉，具有抗K88ac FaeG卵黄抗体和抗F18ac FedF卵黄抗体。将高免全蛋粉处理后的F18ab菌株F107/86和F18ac菌株2134P的菌悬液分别与断奶仔猪空肠上皮细胞作用后，显微镜下观察发现(图6)，细胞上粘附的F18ab和F18ac细菌数都较少。

同样进行3次重复试验，计算每组观察的60个上皮细胞的细菌粘附数，结果发现(见表2)，与F18ac对照组相比，经高免全蛋粉处理后的试验组F18ac粘附于肠上皮细胞上的数量极显著减少(P＜0.01)；同样经高免全蛋粉处理后的试验组F18ab对肠上皮细胞的粘附也明显低于F18ab对照组(P＜0.01)。由此表明，高免全蛋粉不仅可以抑制同源菌株F18ac的粘附作用，还可以阻断异源菌株F18ab对肠上皮细胞的粘附。

2.2卵黄抗体对断奶仔猪腹泻情况的影响

正如表3所示，试验0-14d，即断奶后1-2周，添加了由FaeG-FedF免疫制备的高免全蛋粉的试验组腹泻率和腹泻指数均极显著低于对照组(P＜0.01)。试验全期结果则与0-14d的结果一致。

表3各组仔猪腹泻的影响

指标处理P值

对照组    试验组腹泻率(％)腹泻指数0-14d15-28d0-28d0-14d15-28d0-28d5.51^A2.383.95^A1.68^A0.702.39^a2.42^B1.822.12^B0.80^B0.561.36^b＜0.010.7191＜0.010.010.800.02

¹⁾小写字母表示α＝0.05水平上的差异显著性，大写字母表示α＝0.01水平上的差异显著性

2.2卵黄抗体对断奶仔猪生长性能的影响

从表4可以看出，各阶段两组均表现出较好的生长速度，仔猪7周龄体重均能达到15kg以上，两组之间平均日增重和采食量不存在显著差异(P＞0.05)。然而，在试验各阶段，试验组的料肉比均显著低于对照细(P＜0.05)。

表4各组仔猪生长性能的影响

指标处理普通全蛋粉组融合蛋白FaeG-FedF组入试重kg14日重kg结束重kg0-14d  平均日增重g/d       采食量g/d       料肉比15-28d 平均日增重g/d       采食量g/d       料肉比¹⁾0-28d  平均日增重g/d       采食量g/d       料肉比6.6±0.19.5±0.215.9±0.5207±15288±181.40±0.09^a457±22724±151.59±0.02^A332±16506±291.53±0.03^A6.6±0.19.7±0.316.4±0.6221±18278±201.26±±0.11^b475±32713±361.50±0.05^B348±21495±621.42±0.06^B

¹⁾小写字母表示α＝0.05水平上的差异显著性，大写字母表示α＝0.01水平上的差异显著性