一种基于肿瘤内皮细胞标志物8的人源抗体样分子TEM8－Fc及其在肿瘤治疗中的应用

摘要

本发明公开了一种基于肿瘤内皮细胞标志物8(TEM8)的人源抗体样分子TEM8－Fc及其在肿瘤治疗中的应用，属于生物制药领域。一种TEM8－Fc融合蛋白，它是人TEM8胞外区第1－227位氨基酸与人免疫球蛋白IgG1的Fc段、重链恒定区2和重链恒定区3连接形成的在CHO细胞中表达的基因重组二聚体融合蛋白；成熟的单链TEM8－Fc有432个氨基酸残基，二聚体为864个氨基酸残基。本发明的优点：副作用小、特异性高、适应症宽。动物实验表明，TEM8－Fc能显著抑制乳腺癌、结直肠癌、肝癌等肿瘤细胞在裸鼠体内的生长，并且可抑制乳腺癌、结直肠癌、肝癌等癌细胞的转移和肿瘤组织内血管生成，逆转肿瘤细胞的表型。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于肿瘤内皮细胞标志物8(TEM8)的人源抗体样分子TEM8-Fc及其在肿瘤治疗中的应用，属于生物制药领域。

背景技术

血管生成和肿瘤细胞转移是所有晚期恶性实体瘤发生和发展的必然发生的过程。与血管生成和肿瘤细胞转移的关键分子自然成为研制肿瘤治疗药物的理想靶标，研制拮抗或阻断血管生成和肿瘤细胞侵袭转移通路的药物，应具有广谱抗肿瘤的活性。

血管生长调节失控是肿瘤恶性生长和转移的主要促进因素。因此，抑制肿瘤血管生长，即“饿死肿瘤”的抗肿瘤策略已经引起了肿瘤研究者和临床医生的极大兴趣和广泛关注。从理论上讲，这种抗肿瘤策略具有以下多方面优势：①大部分实体瘤的恶性生长和转移均需要充足的血液供应，因此抑制血管生长具有广谱抗肿瘤特性；②与常规的抗肿瘤方法不同，抑制肿瘤血管生长针对的是基因型相对稳定的内皮细胞，因此在一定程度上避免了肿瘤耐药性的产生；③静脉输注的抗肿瘤血管生长药物能迅速到达并作用于肿瘤组织的血管内皮细胞，这样就避免了常规抗肿瘤药物所面临的药代动力学问题；④每个内皮细胞都支持一定数量的肿瘤细胞的生长，抑制内皮细胞增殖也将间接的抑制肿瘤细胞的生长，即所谓的“旁观者效应”。目前已经针对血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR)开发了多种抗肿瘤药物，尤其是封闭VEGF的单抗Avastin，在临床上已得到了广泛应用，这在实际上证实了抑制血管生长抗肿瘤策略的有效性。

目前抑制血管生长类药物所作用的靶点虽然在肿瘤组织有更为丰富的表达，但并非在肿瘤血管内皮特异性的表达。这在一定程度上限制了这类药物的临床应用。因此，要完全发挥抑制血管生长抗肿瘤策略的潜能，需要探索并发现肿瘤血管内皮特异性表达的分子标志物。幸运的是，最近的一项研究通过比较正常组织与肿瘤组织中血管内皮细胞基因表达的差异，发现了一类在肿瘤血管内皮细胞有较高特异性表达的分子标志物。这类标志物被命名为肿瘤内皮细胞标志物(tumor endothelial markers，TEMs)。有意义的是，在九种该类分子标志物中，有多种属于细胞膜蛋白，分子结构有明显的受体样特征。从进化上看，这类分子有很高的保守性。由于TEMs特异性表达于肿瘤细胞和胚胎发育期的某些组织和细胞，正常细胞表达水平极少甚至不表达，有些TEMs即便在伤口修复时也不表达，而表达VEGF，因此，可以推测，以TEMs为靶标开发的抑制肿瘤血管形成的药物其特异性可能要高于VEGF靶标，而药物的副作用可能较小。高度保守性、肿瘤表达特异性和受体样特征三大特性决定了该类分子可能是开发抗体类药物，抑制血管生长和治疗肿瘤的极为理想的靶标。

目前国内外还没有研制TEM8-Fc融合蛋白用于肿瘤治疗的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种安全、有效的基于TEM8的人源抗体类人工蛋白TEM8-Fc融合蛋白。

本发明要解决的另一个技术问题是提供TEM8-Fc融合蛋白和表达该融合蛋白的CHO细胞系在制备治疗癌症的药物中的用途。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种肿瘤内皮细胞标志物8的人源抗体样分子(TEM8-Fc)融合蛋白，是肿瘤内皮细胞标志物8(TEM8)胞外区第1-227位氨基酸与人免疫球蛋白IgGl的Fc段(铰链区(Hinge region)、重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)连接形成的二聚体融合蛋白；单链TEM8-Fc分子具有序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，共459个氨基酸残基；其中前27个氨基酸为ATR的信号肽；成熟的单链ATR-Fc有432个氨基酸残基，二聚体为864个氨基酸残基。

序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列与中国专利200510084233.5中的炭疽毒素受体ATR-Fc融合蛋白相同。

编码上述肿瘤内皮细胞标志物8的人源抗体样分子融合蛋白单链的基因。

所述的单链的基因，具有序列表SEQ ID No.2所示的碱基序列。

含有编码肿瘤内皮细胞标志物8的人源抗体样分子融合蛋白的基因的表达载体。

该载体为真核表达载体。

含有所述的表达载体的细胞系。所述细胞为CHO细胞。

TEM8-Fc融合蛋白用于制备治疗肿瘤的药物的用途。

所述肿瘤为乳腺癌、结直肠癌、肝癌及其他肿瘤。

所述治疗是指抑制肿瘤的生长及转移、抑制肿瘤组织内血管生成和逆转肿瘤细胞的表型。

TEM8-Fc基因工程融合蛋白，是根据中国专利200510084233.5所述的技术方法，将表达TEM8-Fc融合蛋白的基因，通过脂质体方法转染至CHO-K1细胞中，用G418筛选并获得TEM8-Fc表达水平为10-15μg/(10⁶cells·d)的基因工程CHO细胞系ATR-Fc-1D5(已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，登记入册编号为：CGMCCNo.1399，保存的细胞株名称为ATR-Fc融合蛋白CHO工程细胞株，地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，100080；电话：010-62542758；传真：010-62537796；电子邮件：cgmcc@sun.im.ac.cn)。根据中国专利ZL200310124257.X(胡显文等，动物细胞多孔微载体固定化高效培养方法及其培养基，中国专利ZL 200310124257.X)所述培养方法及培养基，无血清培养ATR-Fc-1D5基因工程CHO细胞(rCHO)，采用蛋白A亲和层析方法纯化重组蛋白(中国专利200510084233.5)。

本发明基于肿瘤内皮细胞标志物——TEM8，开发了一种完全人源化的抗体样分子TEM8-Fc，初步的研究结果表明，该抗体对移植到裸鼠的多种组织来源的人体肿瘤有超过90％的抑制率，显示出了很好的广谱抗肿瘤生长和转移的特性。

本发明的基因重组TEM8-Fc融合蛋白用于制备治疗肿瘤的药物的应用。用ELISA法首次发现，TEM8的天然配体是uPA(尿激酶型纤溶酶原激活剂)，而很多研究表明，几乎所有的恶性肿瘤，尤其是晚期，其肿瘤细胞膜上都过量表达uPA及其受体(uPAR)，uPA在结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌和肺癌等多种恶性肿瘤侵袭转移中起着关键作用，参与了肿瘤生长、血管生成和转移。鉴定TEM8-Fc与uPA的亲和性，提供了解释TEM8-Fc抑制肿瘤细胞体内生长和转移的机制，即TEM8-Fc可以在体内捕获uPA，从而阻止uPA与细胞膜上的TEM8结合，阻断了TEM8介导的与肿瘤细胞生长、迁移等有关的信号通路。动物实验证实：TEM8-Fc可明显抑制乳腺癌细胞、结肠癌细胞和肝癌细胞的生长和转移，该融合蛋白值得进一步研究并开发成治疗乳腺癌、结肠癌、肝癌及其他uPA或TEM8过度表达的肿瘤的抗体类药物。

选择肿瘤血管生成做为肿瘤治疗的靶标，具有以下优点：(1)副作用小，一般成人正常组织极少发生血管生成，因此拮抗血管生成不会导致严重的毒副作用；(2)特异性高，由于肿瘤细胞的遗传的不稳定性，其膜表面的特异性标志物的表达模式会有很大差别，例如，即便都是乳腺癌，过度表达EGFR II的患者比例只有不到30％，因此治疗晚期乳腺癌的一线用药抗-EGFR II的人源化抗体Herceptin(赫塞汀)需要筛选病人后使用才有效，而肿瘤的血管生成几乎在所有实体瘤生长和转移过程中都发挥作用，并且不存在变异问题，因此抗血管生成治疗的特异性较高；(3)适应症宽，将来的市场大。抗肿瘤血管生成，不仅局限于一种类型的癌症，在许多实体瘤的治疗中可能都有效，适应症宽。实际上，2004年FDA批准的用于治疗结直肠癌的抗VEGF的人源化抗体Avastin(阿瓦斯汀)，2005年上半年已完成了与化疗药物联合使用用于非小细胞肺癌和乳腺癌治疗的III期临床试验，取得了较好的临床疗效，有望近期获得FDA批准用于非小细胞肺癌和乳腺癌的治疗。(4)静脉输注的抗肿瘤血管生长药物能迅速到达并作用于肿瘤组织的血管内皮细胞，这样就避免了常规抗肿瘤药物所面临的药代动力学问题。(5)临床证明，肿瘤的抗血管生成治疗的确具有很好的疗效和广谱抗肿瘤的特性。此外，由于TEM8特异性表达于肿瘤细胞，因此使用TEM8-Fc作为干扰TEM8与其他蛋白之间的相互作用，抗肿瘤作用更特异，不会损伤正常组织。

下面结合附图和较佳实施方式对本发明做进一步说明，以使公众对发明内容有整体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。前述部分已经充分公开了本发明可以实施的保护范围，因此凡依照本发明公开内容进行的任何本领域公知的等同替换，均属于对本发明的侵犯。

附图说明

图1为TEM8-Fc的结构示意图。

图2(a)为SDS-PAGE检测纯化的糖基化TEM8-Fc融合蛋白。

图2(b)为SDS-PAGE检测纯化的去除糖链的TEM8-Fc融合蛋白。

图3为ELISA检测TEM8-Fc与uPA特异性结合。

图4(a)为用流式细胞仪分析肝癌细胞HepG2的表面过度表达TEM8。

图4(b)为TEM8-Fc体外抑制LMW-UK诱导的HepG2细胞的迁移。

图5(a)和图5(b)为TEM8-Fc对裸鼠接种结直肠癌细胞LS180抑制肿瘤生长的作用结果(体内抑制肿瘤生长的效应)。

图6(a)和图6(b)为TEM8-Fc对裸鼠接种乳腺癌细胞MCF-7抑制肿瘤生长的作用结果(体内抑制肿瘤生长的效应)。

图7为在MCF-7乳腺癌裸鼠荷瘤实验中，TEM8-Fc融合蛋白对肿瘤组织内抑制血管生成作用的结果。

图8为在LS180结直肠癌裸鼠荷瘤实验中，TEM8-Fc融合蛋白对肿瘤细胞逆转为正常表型的结果。

具体实施方式

实施例1.SDS-PAGE分析基因重组产物

按中国专利200510084233.5所述方法，在rCHO细胞中表达基因重组TEM8-Fc融合蛋白，并且用无血清培养基(中国专利ZL 200310124257.X)培养rCHO细胞，用nProtein A Sepharose 4 Fast Flow亲和柱(Amersham Biosciences)纯化细胞培养上清中的TEM8-Fc。TEM8-Fc融合蛋白的分子结构示意图如图1所示。如果TEM8-Fc能够在CHO细胞中正确表达，表达的蛋白预计应是同源二聚体抗体样分子，即TEM8-Fc单链在铰链区通过链间二硫键连接成二聚体(图1)。单链TEM8-Fc分子共有459个氨基酸残基，其中前27个氨基酸为TEM8的信号肽，胞外分泌到细胞培养上清中时被切除，所以实际的单链TEM8-Fc有432aa，二聚体为864aa。由于TEM8和Fc段都有糖基化位点，因此单链TEM8-Fc的分子量预期在60-65kD。亲和层析纯化得到的TEM8-Fc融合蛋白，分别在还原和非还原条件下进行SDS-PAGE分析(浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为10％)，考马斯亮蓝染色。在非还原条件下，在120-130kD处有一条蛋白带，而在还原条件下，在60-65kD处有一条明显的蛋白带，并且没有其他的蛋白带(图2(a))。由于还原条件下所有二硫键包括链间二硫键都被打断，测得的分子量为单链TEM8-Fc分子，而非还原条件下不同肽链仍通过二硫键连接，在非还原条件下的分子量正好是还原条件下分子量的两倍，表明我们获得的TEM8-Fc融合蛋白为同源二聚体抗体样分子，与预期的结果相符。

将20μg TEM8-Fc用20μl变性缓冲液(0.5％SDS，1％2-巯基乙醇)在100℃条件下煮沸10分钟变性，然后加入2μl 10×反应缓冲液(500mM磷酸钠，pH7.5，10％NP-40)和200活性单位的糖苷酶PNGase F(Sigma)。在37℃条件下孵育1小时，去除TEM8-Fc分子中的N-糖链。在还原条件下用SDS-PAGE(分离胶的浓度为12％)分析。结果表明，去糖基化的TEM8-Fc单链分子的分子量约为50kD(图2(b))，与理论值一致，表明我们得到的基因重组TEM8-Fc融合蛋白是同源二聚体的糖蛋白。

实施例2.ELISA证实TEM8与uPA或tPA的特异性结合

以基因重组尿激酶原(Pro-UK，来源：Hu Xianwen，Xiao Chengzu，Li Zuohu.Pilotproduction of u-PA with porous microcarrier cell culture.  Cytotechnology.2000.33(1～3)：13-19)、基因重组低分子量尿激酶(LMW-UK，中国专利：低分子量尿激酶突变体及其表达载体，申请号：200610065813.4，公开号CN1880449)和基因重组组织型纤溶酶原激活剂(tPA，来源：Roche公司)按0.8μg/孔包被NUNCTM酶联板，3％BSA封闭后加入TEM8-Fc融合蛋白，孵育后充分洗涤，再加入HRP标记山羊抗人IgG(H+L)酶标多抗，孵育后加入TMB试剂显色，405nm测OD值。以人源化单克隆抗体Herceptin(Roche)为阴性对照。结果如图3所示，我们首次发现，TEM8-Fc可特异性结合Pro-UK和UK(合称为uPA)，即uPA是TEM8的天然配体，而uPA几乎在所有恶性肿瘤中都过度表达，刺激肿瘤细胞的生长和迁移，并促进肿瘤组织的血管生成，因此，TEM8-Fc可捕获uPA，阻断uPA促进肿瘤细胞的增殖和迁移作用，从而抑制肿瘤的生长和转移。与此对照，用于乳腺癌(Her2阳性)治疗的anti-Her2的人源化抗体Herceptin则不能结合uPA或tPA。

实施例3.TEM8-Fc融合蛋白可抑制uPA诱导的肿瘤细胞的迁移

由于uPA在肿瘤细胞的迁移中起着举足轻重的作用，封闭uPA可能会抑制肿瘤细胞的迁移。用流式细胞仪分析肝癌细胞HepG2(ATCC No.HB8065)的表面过度表达TEM8(图4(a))，该实验中使用的anti-TEM8兔多抗购自Santa Cruz公司。采用Transwell体外细胞迁移实验(来源：Corning Costar Corporation，http://www.tc.umn.edu/～shimi002/SOPtranswell.pdf)验证TEM8-Fc具有封闭uPA从而抑制HepG2肿瘤细胞的迁移作用。

方法：HepG2细胞按每孔1×10⁵个细胞接种到Transwells的上层小室，HepG2细胞用LMW-UK(10nmol/L)作用4小时以刺激迁移，并观察TEM8-Fc(25g/mL)对LMW-UK的封闭作用。作用4小时后，迁移至下层小室的细胞用0.5％结晶紫染色并照相。

结果见图4(b)：LMW-UK能显著促进HepG2细胞的迁移，加入TEM8-Fc后，可抑制LMW-UK诱导的细胞迁移。该结果表明TEM8-Fc可能在体内阻止肿瘤的转移。

实施例4.TEM8-Fc融合蛋白对裸鼠接种人体来源的癌细胞抑制肿瘤生长的作用

方法：取对数生长期的人结肠癌细胞LS180(ATCC No.CL-187)或人乳腺癌细胞MCF-7(ATCC No.HTB-22)，用新鲜培养液DMEM(Hyclone)配制成5×10⁶个/mL的细胞悬液，每只裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司，www.vitalriver.com.cn)腋皮下接种0.2ml，接种后小鼠随机分为生理盐水组、环磷酰胺(10mg/kg)、TEM8-Fc的10、4和0.8mg/kg三个剂量组，共5组。接种第2天开始给药，给药方式：隔日皮下注射，共给药10次。给药体积为0.2ml/20g体重，末次给药后2天脱颈处死动物，解剖取瘤块，称瘤重，根据以下公式计算肿瘤生长抑瘤率：

结果：TEM8-Fc在裸鼠荷瘤实验中表现出很强的抑制肿瘤生长和血管生成的作用。TEM8-Fc治疗组抑制肿瘤的效果具有明显的剂量依赖性，随抗体给药剂量的增加，抑瘤效果提高，结肠癌荷瘤实验结果显示，TEM8-Fc 10mg/kg、4mg/kg、0.8mg/kg的抑瘤率分别为91％、85％、77％(图5)。化疗药物环磷酰胺(10mg/kg CTX)组的抑瘤率约90％，高剂量组TEM8-Fc抑瘤效果与抗癌药CTX相当，并且几乎没有明显的副作用，而CTX组小鼠体重轻，脾脏明显萎缩。乳腺癌荷瘤实验结果显示，TEM8-Fc10mg/kg、4mg/kg、0.8mg/kg的抑瘤率分别为92％、67％、54％(图6)。表明TEM8-Fc可用于治疗结直肠癌、乳腺癌等。

实施例5.TEM8-Fc融合蛋白能抑制肿瘤细胞的转移

在裸鼠荷瘤实验中，用TEM8-Fc治疗可明显减少癌细胞转移的发生率，并明显减少转移灶数量，并呈显著的剂量依赖性关系(表1)。以乳腺癌MCF-7裸鼠荷瘤实验为例，TEM8-Fc治疗组癌转移发生率明显小于对照组，并且，剂量为10.0mg/kgTEM8-Fc治疗组，没有癌细胞转移事件发生，因此，TEM8-Fc不仅能抑制肿瘤的生长，也能用于防止肿瘤细胞的转移。

表1.TEM8-Fc在裸鼠接种乳腺癌细胞MCF-7抑瘤实验中抑制肿瘤细胞的肝转移

  组别    肝转移  发生癌细胞肝转移的小鼠数(发生率％)  转移灶数量a  生理盐水组(Control)  0.8mg/kg TEM8-Fc  4.0mg/kg TEM8-Fc  10.0mg/kg TEM8-Fc    4/7(57.1)    2/7(28.6)^b    1/7(14.3)^b    0/7(0)    20.5±4.4    6.5±2.1^b    7.0±0.0    0

^a平均值±标准差，^bP＜0.05vs对照组.

实施例6.TEM8-Fc融合蛋白能抑制肿瘤组织中的血管生成

在裸鼠荷瘤实验中，用TEM8-Fc治疗可明显减少肿瘤组织中血管的生成，并呈显著的剂量依赖性关系(图7)。以结直肠癌LS180细胞裸鼠荷瘤实验为例，按照实施例4的方法进行裸鼠荷瘤实验，即取对数生长期的人结肠癌细胞LS180，用新鲜培养液DMEM(Hyclone)配制成5×10⁶个/mL的细胞悬液，每只小鼠腋皮下接种0.2ml，接种后小鼠随机分为生理盐水组、环磷酰胺(10mg/kg)、TEM8-Fc的10、4和0.8mg/kg三个剂量组，共5组。接种第2天开始给药，给药方式：隔日皮下注射，共给药10次。给药体积为0.2ml/20g体重，末次给药后2天脱颈处死动物，解剖取瘤块。用石蜡包埋瘤块，切片。免疫组化方法请参考文献：Nanda A.，et al.TEM8 interacts with the cleavedC5 domain of collagenα3(VI).Cancer Research.64，817-820，2004。简单地，石蜡切片孵育于95℃的柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中20分钟脱蜡后用辣根过氧化物酶封闭液(DAKO)处理。之后与anti-vWF(血管性血友病因子)的兔多抗(Sigma)孵育，再和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(Santa Cruz Biotechnogies)结合，用二氨基联苯胺(DAB)染色。最后切片再用苏木精复染。结果显示，TEM8-Fc治疗组能显著减少肿瘤组织中的血管密度(图7中箭头示血管内皮细胞)，并且血管随TEM8-Fc剂量增加而明显减少。因此，TEM8-Fc能抑制肿瘤组织内的血管生成。

实施例7.TEM8-Fc融合蛋白能逆转肿瘤细胞的表型

癌胚抗原(CEA)是胚胎发育期和恶性肿瘤组织特异性表达的膜蛋白，在成人正常组织中极少表达。TEM8是肿瘤内皮细胞标志物，特异性表达于肿瘤内皮细胞表面，其具体的生理功能尚不清楚，一般认为TEM8在肿瘤血管形成和肿瘤细胞侵袭中发挥了重要作用。按照实施例6所述的免疫组化方法，应用anti-CEA兔多抗(Santa CruzBiotechnogies)检测结直肠癌LS180细胞裸鼠荷瘤实验中肿瘤的组织切片中的CEA的表达发现，经TEM8-Fc治疗的结肠癌，其肿瘤组织表达的的癌胚抗原(CEA)随着TEM8-Fc给药剂量的增加而减少，在4mg/kg组和10mg/kg组的结肠癌肿瘤组织甚至没有发现CEA的表达，尤其是100mg/kg组，结肠癌细胞出现分化细胞的形态(图8)，即TEM8-Fc不仅能直接控制肿瘤的生长，而且可能促进肿瘤细胞向正常细胞转化，TEM8与CEA都是恶性肿瘤和胚胎发育期才表达的癌胚蛋白，二者之间的关系目前尚不清楚。

我们首次发现，TEM8-Fc能显著抑制乳腺癌、结肠癌、肝癌等在裸鼠体内的生长，还可抑制肿瘤血管的形成，并且具有促进肿瘤细胞向正常细胞表型转化的功能，具有广谱抗肿瘤特性。本发明提供了一种治疗晚期恶性肿瘤的、安全、有效的基于TEM8的的人源抗体类TEM8-Fc融合蛋白。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所

<120>一种基于肿瘤内皮细胞标志物8的人源抗体样分子TEM8-Fc及其在肿瘤治疗中的

应用

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>459

<212>PRT

<213>人工合成

<400>1

Met Ala Thr Ala Glu Arg Arg Ala Leu Gly Ile Gly Phe Gln Trp Leu

1               5                   10                      15

Ser Leu Ala Thr Leu Val Leu Ile Cys Ala Gly Gln Gly Gly Arg Arg

            20                  25                      30

Glu Asp Gly Gly Pro Ala Cys Tyr Gly Gly Phe Asp Leu Tyr Phe Ile

        35                  40                      45

Leu Asp Lys Ser Gly Ser Val Leu His His Trp Asn Glu Ile Tyr Tyr

    50                  55                      60

Phe Val Glu Gln Leu Ala His Lys Phe Ile Ser Pro Gln Leu Arg Met

65                  70                      75              80

Ser Phe Ile Val Phe Ser Thr Arg Gly Thr Thr Leu Met Lys Leu Thr

                85                  90                  95

Glu Asp Arg Glu Gln Ile Arg Gln Gly Leu Glu Glu Leu Gln Lys Val

            100                 105                 110

Leu Pro Gly Gly Asp Thr Tyr Met His Glu Gly Phe Glu Arg Ala Ser

        115                 120                 125

Glu Gln Ile Tyr Tyr Glu Asn Arg Gln Gly Tyr Arg Thr Ala Ser Val

    130                 135                 140

Ile Ile Ala Leu Thr Asp Gly Glu Leu His Glu Asp Leu Phe Phe Tyr

145                 150                 155                 160

Ser Glu Arg Glu Ala Asn Arg Ser Arg Asp Leu Gly Ala Ile Val Tyr

                165                 170                 175

Cys Val Gly Val Lys Asp Phe Asn Glu Thr Gln Leu Ala Arg Ile Ala

            180                 185                 190

Asp Ser Lys Asp His Val Phe Pro Val Asn Asp Gly Phe Gln Ala Leu

        195                 200                 205

Gln Gly Ile Ile His Ser Ile Leu Lys Lys Ser Cys Ile Glu Ile Leu

    210                 215                 220

Ala Ala Glu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

225                 230                 235                 240

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

                245                 250                 255

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

            260                 265                 270

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

        275                 280                 285

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

    290                 295                 300

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

305                 310                 315                 320

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

                325                 330                 335

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

            340                 345                 350

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

        355                 360                 365

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

    370                 375                 380

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

385                 390                 395                 400

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

                405                 410                 415

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

            420                 425                 430

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

        435                 440                 445

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

    450                 455

<210>2

<211>1380

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

atggccacgg cggagcggag agccctcggc atcggcttcc agtggctctc tttggccact     60

ctggtgctca tctgcgccgg gcaaggggga cgcagggagg atgggggtcc agcctgctac    120

ggcggatttg acctgtactt cattttggac aaatcaggaa gtgtgctgca ccactggaat    180

gaaatctatt actttgtgga acagttggct cacaaattca tcagcccaca gttgagaatg    240

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