鸡肾型传染性支气管炎HN99株病毒

摘要

鸡肾型传染性支气管炎HN99株病毒，在电镜下见有冠状病毒粒子，直径90～105nm，有囊膜，周围有长约18nm的梨状突出，呈放射状排列；病毒分离物对NDV La Sota株病毒的繁殖产生干扰；病毒分离物对1％鸡红细胞不产生凝集；回归SPF鸡试验可出现呼吸道症状和肾肿、花斑肾等病变；特异性血清中和结果证明，病鸡的病毒分离物与HN99阳性血清呈阳性反应，而与NDV La Sota株、IBDV B87株、AIV H9N2株均呈阴性反应；HN99株阳性血清与T株、湖北株、天津株和山东株呈阳性反应，与其他株病毒均呈阴性反应。该毒株无外源病原污染，有较好的免疫原性，是一株效果良好的病毒株。

说明书

技术领域

本发明涉及一种家禽传染性病毒，尤其涉及一种鸡肾型传染性支气管炎病毒。

背景技术

1999年，河南省荥阳某养鸡场爆发以呼吸道症状为临床特征、以肾脏肿胀、尿酸盐沉积为解剖特征的传染病，从鸡群典型病例的肾脏和输尿管中分离到一株病毒，代号为HN₉₉株。通过SPF鸡胚传代，SPF雏鸡回归复壮后，测定其EID₅₀为10^-6.40/0.1ml；我们对发病鸡的肾脏进行了组织学观察，用电镜观察了该病毒的冠状病毒粒子的形态和大小，进行了生物学特征试验如血凝性、对NDV的干扰试验，测定了对热、酸、化学试剂(氯仿、乙醚等)的敏感程度和其他理化试验。用Holte、Gray和Ausc-T等国际古典肾型病毒株和河南、湖北、北京、天津、哈尔滨等地方毒株等进行了特异性试验和血清中和试验。试验结果证实该病毒株为肾型传染性支气管炎病毒，HN₉₉病毒株与传统的呼吸型传染性支气管炎病毒M₄₁株、H120株、H52株的血清型不同，是一株新的病毒株。用传统的M₄₁株或H120株、H52株制备的疫苗不能预防HN₉₉株病毒所致的肾型传染性支气管炎，只有用HN₉₉株病毒制备的疫苗才能预防肾型传染性支气管炎。

发明内容

本发明目的在于提供一种新型的鸡肾型传染性支气管炎HN₉₉株病毒。

本发明公开了一种新型的鸡肾型传染性支气管炎HN₉₉株病毒，该病毒株于2006年5月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1729。

该病毒具有以下特征：

(1)、在电镜下见有冠状病毒粒子，直径90～105nm，有囊膜，周围有长约18nm的梨状突出，呈放射状排列；

(2)、发病鸡症状除呼吸道症状外，大部份死鸡均有肾脏肿大、尿酸盐沉积、花斑肾等病变，用10日龄鸡胚接种病毒，并经盲传5代后，可见24～72小时之间死亡的鸡胚均有充血或出血、孵育至第17天的鸡胚有3/5呈现发育小、蜷曲、僵化、尿酸盐沉积；

(3)、病毒分离物对NDV La Sota株病毒的繁殖产生干扰；

(4)、病毒分离物对1％鸡红细胞不产生凝集；

(5)、回归SPF鸡试验可出现呼吸道症状和肾肿、花斑肾等病变；

(6)、特异性血清中和结果证明，病鸡的病毒分离物与HN₉₉阳性血清呈阳性反应，而与NDV La Sota株、IBDV B₈₇株、AIV H₉N₂株均呈阴性反应；

(7)、将HN₉₉株阳性血清与100个EID₅₀的M₄₁株、Holte株、Gray株、T株和地方分离株湖北株、哈尔滨株、山东株、北京株、上海株、天津株等病毒做血清中和试验，结果显示，HN₉₉株阳性血清与T株、湖北株、天津株和山东株呈阳性反应，与其他株病毒均呈阴性反应。

本发明所述的鸡传染性支气管炎病毒株于2006年5月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称：CGMCC，保藏编号：CGMCC No.1729，分类命名：鸡肾型传染性支气管炎病毒，英文名称为Avain nephropathogenic Infectious bronchitis virus HN99 Strain，拉丁文名称为Tarpeianephrite pulli，保藏单位地址：北京市海淀区中关村北一条13号，邮编：100080。

具体实施方式

本发明采用以下方法进行病毒的分离、培养、鉴定：

(一)、病毒分离培养

无菌采集病鸡肺、肾，称重后按1∶5重量比添加灭菌生理盐水研磨，以3000rpm离心15分钟，取上清液，按每毫升加青霉素2000IU、链霉素2000μg，4～8℃作用12小时备用。取上清液尿囊腔接种10日龄SPF胚10个，每胚0.2ml，剔除30小时内死亡的鸡胚。从接种后30小时起，每隔4～6小时观察1次，挑出死亡胚，放2～8℃冷存，至72小时取出所有胚，无菌收取尿囊液，加入青链霉素各1000IU/ml。其余5枚继续孵化5天，观察并记录胚胎病变。如此连续盲传3代，-70℃以下保存，将此病毒液按1∶2-3的比例(V/V)加入蔗糖牛奶保护剂，用真空冷冻干燥机进行冻干后，保存于-80℃低温冰箱内保存。

(二)、病毒鉴定

1.电镜检查结果

HN₉₉毒株在电镜下见有冠状病毒粒子，直径90～105nm，有囊膜，周围有长约18nm的梨状突出，呈放射状排列。对照尿囊液未见有上述病毒粒子存在。

2.HN₉₉、HX病毒血凝性试验EID₅₀测定和对NDV的干扰试验

HN₉₉未经胰酶处理的鸡胚分离物对1％的鸡红细胞不发生凝集(HA试验阴性)，而HX病毒分离物对1％的鸡红细胞发生凝集，HA为1∶4，证明有血凝性的病毒污染，因此舍弃不再做其它试验。

经胰酶处理的HN₉₉鸡胚病毒分离物对1％的鸡红细胞发生凝集，平均凝集价HA为1∶2。

经磷酸酯酶C处理后的HN₉₉鸡胚病毒分离物可使1％的鸡红细胞发生凝集，平均凝集价HA为1∶4。

病毒分离物的EID₅₀测定  将HN₉₉鸡胚病毒尿囊液，测定其EID₅₀，结果为10^-6.0～10^-7.0/0.1ml。

3.对NDV的干扰试验

对NDV的干扰试验证明，加分离毒HN₉₉的HA为1∶128，不加分离毒的HA为1∶1024，说明分离毒HN₉₉能抑制NDV La Sota在鸡胚内增殖。该试验结果表明，分离毒HN₉₉符合IBV的生物学特性。

4.理化试验

病毒分离物加入20％的乙醚，在2～8℃处理24小时后接种鸡胚，对鸡胚已无感染力。证明病毒物对乙醚敏感。

向病毒分离物内加入氯仿，使其最终浓度为4.8％，在4℃温度下充分混合30min，接种敏感鸡胚，对鸡胚的EID₅₀仅为10^-3.5/0.1ml，比未加氯仿的对照组(EID₅₀为10^-6.30/0.1ml)下降约3个滴度，证明病毒分离物对氯仿敏感。

将病毒分离物PH值调至3.0，用敏感鸡胚测定EID₅₀为10^-5.5/0.1ml，比对照仅下降10^-0.5左右，病毒对鸡胚仍具有一定的感染力，证明病毒分离物对酸有耐受性。

病毒分离物56℃下经30分钟，对敏感鸡胚已无感染力，证明病毒分离物不耐热。

5.动物回归试验

用7日龄SPF鸡10只，用点眼、滴鼻和气管内接种HN₉₉鸡胚病毒尿囊液各0.2ml，接种后观察14日。接种后从第48小时开始，有8只鸡精神欠佳，饮食减少，病鸡出现咳嗽、甩鼻等现象，其中1只鸡死亡。对有症状的鸡进行解剖，可见气管、肺脏有充血病变。病死鸡有肾肿，花斑肾，输尿管内有尿酸盐沉积等症状，对此病死鸡的肾脏作了组织切片，进行组织学观察，见肾脏的主要病变是肾曲管发生颗粒变性、空泡变性和玻璃样变，间质水肿，内有淋巴细胞等浸润，有的肾实质组织坏死，形成大小不等的病灶区。

6.特异性血清中和试验

用HN₉₉抗传染性支气管炎阳性血清分别和病毒分离物HN₉₉、NDV LaSota、IBDV B₈₇、AIV H₉N₂和M₄₁株病毒用鸡胚进行中和试验，结果仅有病毒分离物HN₉₉与HN₉₉抗传染性支气管炎血清呈现阳性反应，其中和物接种10日龄SPF鸡胚，孵化至144小时后，未发现鸡胚有任何病变，而HN₉₉株病毒液阳性对照的鸡胚有死亡、或发育小、蜷缩、僵化、尿酸盐沉积等症状。NDV La Sota、IBDV B₈₇、AIV H₉N₂与抗传染性支气管炎呈现阴性反应，其中和物接种SPF鸡胚后胎儿均有充血、出血、水肿、死亡等症状。HA试验表明，NDV La Sota株和AIV H₉N₂的鸡胚尿囊液均有1∶128～512的血凝价，结果如下表：

特异性血清中和试验

将HN₉₉阳性血清与100个EID₅₀的M₄₁株、Holte株、Gray株、T株、湖北株、HB株、BJ株、TJ株、SH株、SD株等病毒液等量混合，在20～25℃条件下中和1小时，接种10日龄SPF鸡胚6个，每胚0.2ml，同时设病毒对照组和正常对照组，在37℃继续孵化，观察至144小时，以试验组至少5/6健活、病毒对照组至少50％出现典型病变或死亡、正常对照组全部健活为标准。结果如下表：

用M₄₁株、T株、HO株、G株、HN₉₉阳性血清作1∶8(V/V)稀释，与100个EID₅₀HN₉₉株病毒液等量混合，在20～25℃条件下中和1小时，接种SPF鸡胚6个，每胚0.2ml，同时设病毒对照和正常对照，在37℃继续孵化，观察至144小时，以试验组至少5/6健活、病毒对照组至少50％出现典型病变或死亡、正常对照组全部健活为标准。结果如下表：

本发明采用以下方法对病毒HN₉₉株进行纯化和免疫原性试验：

用鸡胚肾细胞终点稀释法对IBV HN₉₉进行了纯化试验，并将其回归SPF鸡胚，其毒价基本无变化。用该毒株的鸡胚病毒液制成灭活苗，免疫SPF鸡进行免疫原性测定，证明IBV HN₉₉株有较好的免疫原性。

1、SPF鸡胚肾细胞(CEK)的制备

用18日龄的SPF鸡胚，无菌操作取出鸡胚肾脏，用hank’s液洗涤3次，用剪刀剪成小块，加入体积百分比0.25％的胰酶，于37℃水浴消化18～20分钟，弃去胰酶，再用hank’s液洗一次，加入含体积百分比8～10％犊牛血清的1640培养液，用吸管反复吹打细胞后，用4～6层无菌纱布过滤至细胞培养瓶和细胞培养板，于37℃ CO₂培养箱培养，待长成良好的单层后接毒。

2、传代与纯化

将HN₉₉株病毒液接种于长成单层的SPF鸡胚肾细胞，置37℃ CO₂培养箱继续培养，48小时后细胞逐渐出现病变，如圆缩或拉网变长，至96小时后收毒，反复冻融3次，用此法将HN₉₉株病毒传了4代。将第3代细胞毒作10倍系列稀释，取10^-5、10^-6、10^-7、10^-8稀释度分别接种于SPF胚CEK单层，每滴度10个孔。培养96小时后，将最高稀释度有病变的孔扩大培养，测定EID₅₀后进行第二次终点稀释。将第二次终点稀释后得到的细胞病变液接种9～10日龄SPF胚，进行病毒复壮和增殖。

3、HN₉₉株病毒的增殖与鉴定

将纯化的HN₉₉病毒液，接种9～10日龄SPF鸡胚，接种后剔除30小时以前的死胚，30小时后每隔4～6小时观察一次，挑出死亡胚，放2～8℃保存，至72小时挑出所有胚。无菌收取尿囊液，并进行各项生物学特性试验、电镜观察、动物回归病毒试验、理化试验、特异性试验和血清中和试验、无菌检验，选择无菌生长、EID₅₀≤10^-6.0/0.1ml、各项试验合乎要求的HN₉₉株病毒尿囊液，分装冻干保存，作为毒种。

将纯化的毒株送美国SPAFA济南试验室，进行了外源病原检测，结果表明，该毒株无外源病原污染。

4、HN₉₉株病毒纯化后的免疫原性试验

将HN₉₉株纯化，选择无菌检验合格、EID₅₀≤10^-6.0/0.1ml的HN₉₉株病毒尿囊液，经灭活后加入4％(V/V)的灭菌后的吐温-80，制成水相。然后按水相∶油相为1∶3(V/V)的比例，用高速组织捣碎机乳化成油乳剂。

将HN₉₉株油乳剂按0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml 5组不同的剂量免疫28日龄SPF鸡，每组8只。3周后，免疫鸡和条件相同的4只对照鸡一起，攻击HN₉₉强毒，每鸡气管内注射0.2ml的HN₉₉株病毒尿囊液0.2ml，观察14日，结果如下表。

HN₉₉株不同免疫剂量试验结果

免疫剂量(ml)    免疫鸡免疫只数攻毒剂量(ml)  攻毒免  疫保护  结果对  照发病  品种  日龄0.1  SPF  21    8    0.2    6/8    4/40.2  SPF  21    8    0.2    8/8    4/40.3  SPF  21    8    0.2    8/8    4/40.4  SPF  21    8    0.2    7/7    4/40.5  SPF  21    8    0.2    8/8    4/4

HN₉₉株不同免疫剂量的试验证明，该毒株免疫0.1ml的免疫鸡攻毒后可保护6/8，免疫0.2～0.5ml的免疫鸡攻毒后均可获全保护。对照鸡发病4/4，鸡只出现咳嗽、甩鼻，解剖后有肾肿、支气管、肺脏充血或出血等不同症状。试验表明，HN₉₉株有较好的免疫原性，是一株效果良好的病毒株。