鸡传染性支气管炎病毒HN99株的分离鉴定及生物学特性研究

摘要

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)是由冠状病毒科、冠状病毒属的鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病。上世纪30年代在美国爆发以来，现在已经成为世界各地流行的主要禽病。IBV是单股RNA病毒，该病毒基因可由于点突变和重组而发生变异，因此IBV的血清型较多，已达30余种之多，常见的有。M41、Conn、Iowa97、Gray、Hotle、JMK、Clark333、SE17、Florida、Arkanass99和Australian T等，不同血清型毒株之间仅有部分或无交叉保护作用，从而给本病的防治带来困难。我国目前虽然已广泛使用IB疫苗，但由于IBV的易变异型，IB仍然呈高度流行趋势，尤其是在已免疫鸡群中也常常爆发IB，造成严重的经济损失。 近年来，河南各地养鸡场在进行了IB的常规免疫程序后，仍爆发了严重的疑似IB的传染性疾病，给全省的养鸡业造成严重的损失。为查明引发该类疾病的确切病因，找出确切的病原，我们对河南某发病鸡场疑似IB的典型病例展开了病原的实验室分离和鉴定工作，并对其生物学特性进行了研究。 无菌采集发病鸡的气管、肺脏、肾脏等组织，采用鸡胚盲传观察病毒对鸡胚的致病作用，病毒盲传至第2代后鸡胚出现死亡和侏儒胚；尿囊液经磷酸酯酶C处理后能够凝集1％的鸡红细胞；病毒纯化后经外源病毒检测，无外源病毒污染；将病毒盲传至E8代时，病毒的EID50逐渐增强到106.5/0.1mL，；病毒能够干扰NDV在鸡胚中的增殖；病毒可致SPF雏鸡发病，引起肾脏肿大、花斑肾、尿酸盐沉积等肾脏病变；电镜下可见到直径90～105am的冠状病毒粒子；理化特性测定表明，该毒株对乙醚和氯仿敏感，耐酸不耐碱，对热敏感。初步证实分离的病毒为鸡传染性支气管炎病毒，命名为HN99株。 对HN99株的S1基因进行克隆与测序，使用DNAStar软件进行序列分析。结果显示，HN99株与常见的.M41、Gray、Holte、H120、H52、Conn等毒株的S1基因同源性不高，分别为79.4％、72.7％、77.4％、79.1％、78.3％，而与T株的同源性高达99.6％，遗传进化关系也揭示HN99株与T株的亲缘关系较近，而与其它毒株的关系较远。证实HN99株为一新的IBV变异株。 利用病毒中和试验和HI试验对HN99株进行了血清分型，结果表明HN99株不属于常见的M41、Conn、Gray等血清型，而HB、JS、SD等地方分离株则属于HN99株血清型，表明HN99株血清型具有一定的地域覆盖性；交叉保护试验证实了血清分型的结果；用HN99株和M41株制备的二价疫苗免疫试验鸡后，不仅产生了较高的抗体水平，而且能够同时抵御HN99株血清型和M41株血清型毒株的攻击，表明HN99株有较好的免疫原性，为利用地方分离株进行IB的防制奠定了基础。

目录

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致谢

摘要

文献综述

1传染性支气管炎概述

2 IB病原学研究进展

2.1 IBV的分类地位及形态结构

2.2 IBV的理化特性

2.3 IBV的血凝特性

2.4 IBV的培养特性

2.5 IBV的致病性与临床型

2.6 IBV的分型

3 IBV分子生物学研究进展

3.1 IBV的基因组

3.2 IBV的主要结构蛋白及功能

3.3 IBV的复制机制

3.4 IBV的转录机制

3.5 IBV的遗传变异

4 IB疫苗的研究进展

4.1弱毒活疫苗

4.2灭活疫苗

4.3亚单位疫苗

4.4核酸疫苗

4.5活载体疫苗

引言

试验一鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1病毒的分离

2.2病毒的纯化

2.3病毒EID50的测定

2.4红细胞凝集试验

2.5 NDV干扰试验

2.6对SPF鸡的致病力试验

2.7理化试验

2.8电镜观察

3结论与讨论

试验二传染性支气管炎病毒S1基因的克隆和序列分析

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1 S1基因的RT-PCR扩增

2.2 S1基因的克隆及酶切鉴定

2.3 HN99株S1基因的序列测定及分析

2.4 HN99株S1基因同源性分析

2.5 HN99株S1基因遗传进化关系分析

3结论与讨论

试验三鸡传染性支气管炎病毒血清学和免疫学特性研究

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1 HI抗原制备

2.2HI抗原特异性

2.3阳性血清的制备

2.4 HI交叉试验

2.5交叉中和试验

2.6灭活疫苗的制备

2.7疫苗抗体水平测定

2.8免疫交叉保护

3结论与讨论

全文总结

参考文献