一种利用糖蜜原料发酵生产琥珀酸的方法

摘要

一种利用糖蜜原料发酵生产琥珀酸的方法，属生物制造技术领域。本发明使用发明人从瘤胃中筛选得到的微生物琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC1593，在含CO2或N2的厌氧条件下和维持pH5.5～7.5的环境下，利用制糖废糖蜜(含总还原糖浓度50～100g/L)进行分批或补料分批厌氧发酵30～60h，达到产琥珀酸浓度30～60g/L，琥珀酸对消耗糖产率70％～84％，生产强度0.9～1.2g/L·h，糖利用率90％～95％。本发明突出的优点是利用廉价糖蜜原料替代纯葡萄糖作为碳源发酵生产琥珀酸，利用可再生原料，可缓解化学合成琥珀酸的石化资源紧张问题，对环境友好。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用糖蜜原料发酵生产琥珀酸的方法，属生物制造技术领域。

背景技术

琥珀酸(succsinic acid)，又称丁二酸，分子式为C₄H₆O₄，分子量为118.09，是一种常见的天然有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。

琥珀酸是工业上一种重要的四碳化合物，它作为有机合成原材料、中间产物或专业化学制品广泛应用在食品、医药、农药、染料、香料、油漆、塑料和材料工业。其最大的市场是用于表面活性剂、清洁剂、绿色溶剂、离子鳌合剂、生物可降解塑料等领域。其在食品行业中作为酸化剂、pH改良剂、风味物质和抗菌剂，以及作为原料或中间体用于医药、抗生素、氨基酸和维生素的生产(ApplMicrobiol Biotechnol，51：545-552，1999)。目前，发酵法生产琥珀酸和它大多数衍生物的合成还处在进一步研究和开发阶段。

目前已开发出多项技术将琥珀酸转化为重要的工业化学品，包括N-甲基吡咯烷酮、1，4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯、PBT树脂、己二酸等。其中许多化工产品目前都是以苯为原料合成的，苯是石油或煤化工产品，资源紧缺，不可再生。现报道大约有250种以苯为原料的化工产品可以通过琥珀酸为原料来生产。因此，全球对琥珀酸的需求不断增加。

工业上琥珀酸的生产方法主要为化学方法，主要有石蜡氧化法、轻油氧化法、丁烷氧化法、丁二腈水解法、催化加氢法以及以乙烯和一氧化碳为原料的电解氧化法。目前，国内外主要使用的是催化加氢法。以化学方法获得琥珀酸，不可避免地要消耗大量不可再生的化石原料，还具有转化率低，易污染环境等弊端。

琥珀酸的生产可通过发酵方法来进行，由于化石原料的日趋减少，用微生物发酵碳水化合物生产琥珀酸的方法日益受到人们的重视。由于发酵法生产琥珀酸是以可再生糖源(如葡萄糖)和二氧化碳作为主要原料，因此微生物发酵法生产琥珀酸，具有成本低和摆脱对石化原料依赖的优点，而且开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径，更加显示了环境友好特征。

琥珀酸是继柠檬酸后最具市场潜力的发酵有机酸产品之一，但目前都还是用化学方法生产。根据美国Michigan大学MBI研究所的估计，在未来几年内，琥珀酸的总需求将达到100万吨的水平。

目前文献报道的发酵法生产琥珀酸研究用培养基原料多为葡萄糖，无论是牛瘤胃中分离的Actinobacillus succinogenes、基因工程构建的大肠杆菌Escherichia coli生产琥珀酸的方法都是如此。使用价格低廉的碳源是降低发酵法生产琥珀酸成本的一个关键因素。目前，已有一些利用不同原料发酵生成琥珀酸的报道，比如美国Argonne在网上报道了从玉米(淀粉水解液)生产化学品琥珀酸的消息(www.ipd.anl.gov/biotech/index.html)，日本三菱化学和味之素公司也联合开发了采用以玉米淀粉为原料发酵生产丁二酸(http://www.bio168.com，2005)，但还未查到相关的研究文献。韩国Lee PC等与Kim DY等先后报道了Mannheimia succiniciproducens MBEL55E发酵乳清原料和发酵木浆水解液生产琥珀酸。发酵乳清原料产琥珀酸15.5g/L，对消耗糖产率和生产强度为93％和0.24g/L·h(Appl Microbiol Biotechnol 54：23-27，2000)。用NaOH预处理过的木浆水解液培养基分批发酵积累琥珀酸11.73g/L，对消耗糖产率和生产强度分别为56％和1.17g/L·h(Enzyme and Microbial Technology，35：648-653，2004)。本发明人从瘤胃中筛选的琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes CGMCC1593，它能发酵的糖质原料包括葡萄糖，果糖，麦芽糖，D-木糖，蔗糖，乳糖，半乳糖，乳清，及木薯、玉米、甜菜或木质纤维素的水解物或糖浆(中国专利CN200610038113.6)，后来研究发现它也很适宜于发酵糖蜜原料生产琥珀酸。

糖蜜是制糖工业的副产品，又被称为废糖蜜，包括甘蔗糖蜜与甜菜糖蜜，它含有大约40～50％总糖(主要成份是蔗糖、葡萄糖和果糖)，在发酵工业中作为较廉价的碳源原料。它与葡萄糖或淀粉水解液比较，价格低廉，已经广泛用于酵母、酒精、乳酸、柠檬酸、核黄素及多糖等产品的工业生产。到目前为止，工业上还没有利用糖蜜原料发酵生产琥珀酸的实例。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用廉价糖蜜原料发酵生产琥珀酸的方法。

技术方案：利用糖蜜原料发酵生产琥珀酸的方法，是用琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC1593在含有50～100g/L还原糖的糖蜜及其它营养物组成的培养基中发酵生产琥珀酸。

以下是本发明方法的详细描述。

糖蜜原料的预处理：

将糖蜜(含量约400～600g/L总还原糖)稀释到200～300g/L的糖浓度，然后采用硫酸、活性炭或离子交换树脂等方法进行处理。

预处理后的糖蜜发酵生产琥珀酸：

菌株：琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC1593。

种子培养基的组成为(每L)：葡萄糖5～15g，酵母膏1～10g，K₂HPO₄·3H₂O0.5～2.0g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.2～2.0g，混合维生素1～10ml，pH 6.0～7.0。混合维生素组成为：B12 5mg，B₆ 100mg，叶酸20mg，核黄素20mg，硫胺素20mg，烟酸，20mg，泛酸50mg，对氨基苯甲酸50mg，1000ml水。维生素等热敏性材料配制后用0.2μm微滤膜除菌，接种前加入。

发酵培养基的组成为(每L)：糖蜜(含总还原糖计)50～100g，酵母膏10～20g，玉米浆10～20g，MgCl₂ 0.1～0.5g，Na₂HPO₄·12H₂O 1～5g，NaH₂PO₄·2H₂O 1～5g，起始pH 5.5～7.5。

种子培养在150ml厌氧瓶中进行，装液20～80ml。发酵在150ml厌氧瓶或5L～25L搅拌发酵罐(New Brunswich 110，New Brunswick Scientific，Edison，NJ，USA)中进行。种子和发酵培养基的灭菌温度为115～121℃，15min。

将实验菌株接种到种子培养基中，于30～40℃在充满CO₂的环境中静止或震荡培养16～40h。

按1％～10％的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，在充满CO₂或N₂气体的环境下，30～40℃静止或震荡(或搅拌)厌氧发酵30～60h，并用氨水、碳酸盐或碱溶液调节维持发酵液pH5.5～7.5。

所用糖蜜原料为制糖工业的废糖蜜，包括甘蔗糖蜜及甜菜糖蜜。将原糖蜜稀释到200～300g/L的糖浓度，然后用硫酸溶液调节pH2～4酸化处理，离心取上清液用NaOH调pH6.5；或采用离子交换树脂处理：加732型阳离子树脂到200～300g/L糖浓度的稀释糖蜜中，处理后过滤除去树脂，再用NaOH调pH6.5。

分析方法：

将培养液离心，采用高效液相色谱法分析上清液中的琥珀酸等代谢产物及糖类物质。采用美国Waters高效液相色谱仪，Waters RI检测器，Breeze色谱工作站。其中，琥珀酸，乙酸，乳酸和甲酸等有机酸的测定使用Aminex HPX-87H离子色谱柱(300mm×7.8mm，9μm；Bio-Rad Chemical Division，Richmond，Calif.)，流动相8mM硫酸；柱温55℃；流速0.5ml/min；进样量10μL。葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖等糖类含量的测定采用Zobax NH₂氨基柱(250mm×4.6mm，5μm；Agilent，USA)，流动相：75％乙腈；流速1ml/min进样量10μL。

糖蜜总还原糖测定采用DNS法，测定时选用葡萄糖为还原糖标准物。

琥珀酸的对糖产率定义为每消耗1克还原糖所能产生的琥珀酸克数，并以百分数表示。

糖利用率定义为消耗糖所占投入糖的百分比(对于糖蜜，所述的糖以总还原糖计算)。

有益效果：

本发明利用从瘤胃中筛选的琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenesCGMCC1593，它也很适宜于发酵糖蜜原料，用其发酵糖蜜生产琥珀酸的产物浓度，对糖产率和生产强度分别达到30～60g/L，70％～84％和0.9～1.2/L·h，糖利用率90％～95％，很适用于低成本琥珀酸的工业化生产。本发明突出的优点是利用廉价糖蜜原料发酵生产琥珀酸，糖蜜作为一种价格低廉的粗原料可以替代纯葡萄糖作为碳源用来发酵生产琥珀酸，是一种利用可再生原料的生产方法，可缓解化学合成琥珀酸的石化资源紧张问题，对环境友好。并且由于糖蜜中还含有一些可供微生物利用的氮源与其他营养成份，因而也能够显著减少发酵的培养基成本。

具体实施方式

以下是琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC1593利用糖蜜原料发酵生产琥珀酸的实施例。但本发明并不限于所列出的几个实例。

实施例1

种子培养基(每L)：葡萄糖5g，酵母膏5g，K₂HPO₄·3H₂O 1.0g，NaH₂PO₄·2H₂O1.0g，混合维生素1ml，pH7.0。37℃厌氧培养24h。

发酵培养基(每L)：处理甘蔗糖蜜(总还原糖)65g，酵母膏15g，玉米浆20g，MgCl₂ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 1.5g，NaH₂PO₄·2H₂O 1.5g，pH 6.5。37℃厌氧培养48h。

糖蜜的处理方法如下：

首先，将原糖蜜(约510g/L还原糖)用自来水稀释到300g/L的糖浓度(以下简称稀释后的糖蜜)，然后分别采用以下方法进行处理。

(1)硫酸处理：稀释后的糖蜜用1mol/L的硫酸溶液调节pH3.5，静止6h，离心，取上清液用5mol/L的NaOH调pH6.5。

(2)亚铁氰化钾处理：将0.1g亚铁氰化钾加入到100ml稀释后的糖蜜中，用5mol/L的NaOH调pH6.5，煮沸30min，离心，取上清液待用。

(3)活性炭处理：将5g颗粒活性碳加入到100ml稀释后的糖蜜中，50℃处理15min，过滤除去活性炭，用5mol/L的NaOH调pH6.5。

(4)大孔吸附树脂处理：取处理后的大孔吸附树脂(型号D4006)10g，加入到100ml稀释后的糖蜜中，摇床振荡6h(30℃，250rpm)，过滤除去树脂，用5mol/L的NaOH调pH6.5。

(5)732强阳离子树脂处理：取处理后的732型阳离子树脂10g，加入到100ml稀释后的糖蜜中，摇床振荡6h(30℃，250rpm)，过滤除去树脂，用5mol/L的NaOH调pH6.5。

表1不同处理糖蜜方法对琥珀酸发酵的影响(在厌氧瓶中发酵)

处理糖蜜方法  琥珀酸  (g/L)  乙酸  (g/L)  甲酸  (g/L)  琥珀酸产率  (％)  糖利用率  (％)未处理硫酸处理亚铁氰化钾处理活性炭处理大孔吸附树脂处理732阳离子树脂处理  44.2  50.1  45.2  45.7  43.4  49.6  6.2  6.5  5.9  6.1  5.8  7.0  1.7  1.8  1.5  0.8  0.9  2.2  79.7  81.6  78.6  80.2  78.5  81.0  85.3  94.5  88.5  87.7  85.1  94.2

比较以上五种处理方法，其中以硫酸处理和732阳离子树脂处理两种方法的处理效果较好，糖利用率有较大提高，而其它几种方法处理效果不显著。经过硫酸处理后的甘蔗糖蜜，以65g/L的初糖浓度发酵48h，能够产生50.1g/L的琥珀酸，对消耗糖产率81.6％，糖利用率达94.5％，生产强度1.04g/L·h，发酵产量比使用未处理甘蔗糖蜜提高13.3％。

实施例2

按实施例1方法，在厌氧瓶发酵实验中，使用硫酸处理甘蔗糖蜜，初始还原糖浓度为65g/L，在发酵培养基中分别加入不同的无机和有机氮源(其总含氮量基本相似)，其含量分别为(每L)：NH₄Cl 5.3g、KNO₃ 9.6g、蛋白胨12g、玉米浆(固形物≥55％)25g、酵母膏15g和干酵母粉12g。其各种氮源对发酵甘蔗糖蜜生产琥珀酸的影响见表2所示。

表2添加不同氮源对发酵甘蔗糖蜜生产琥珀酸的影响(在厌氧瓶中发酵)

    氮源    琥珀酸    (g/L)    乙酸    (g/L)    甲酸    (g/L)  琥珀酸产率  (％)  糖利用率  (％)    未添加    NH₄Cl    KNO₃    蛋白胨    玉米浆    酵母膏    干酵母粉    29.4    30.7    31.8    39.7    45.1    49.7    44    3.8    4.2    4.3    5.6    6.0    6.4    5.8    1.0    0.9    1.4    1.9    1.6    1.8    1.7  79.5  78.0  82.2  78.4  81.5  81.2  78.8  56.9  60.6  59.5  78.3  85.2  94.1  85.9

比较以上几种氮源，其中以酵母膏最好，当酵母膏浓度为15g/L时，琥珀酸产量达到49.7g/L，对消耗糖产率81.2％，糖利用率达94.1％，生产强度1.03g/L·h。

实施例3

按实施例1方法，在厌氧瓶发酵实验中，使用硫酸处理甘蔗糖蜜，初始还原糖浓度分别为35，50，65，80，100g/L时，结果如表3所示：

表3不同初始还原糖浓度对发酵甘蔗糖蜜生产琥珀酸的影响(厌氧瓶发酵)

  初始还原糖浓度  (g/L)    琥珀酸    (g/L)    乙酸    (g/L)    甲酸    (g/L)  琥珀酸产率  (％)  糖利用率  (％)  35  50  65  80  100    27.5    39.7    50.6    44.3    37.2    4.1    4.9    6.9    6.0    4.5    0.8    1.2    1.6    1.4    1.5  78.4  79.9  83.7  81.9  82.5  54.5  76.4  93.0  83.2  69.4

由上表可以看出，以初始还原糖浓度为65g/L时琥珀酸的产量为最高，达到50.6g/L，琥珀酸对消耗糖产率83.70％，糖利用率93.0％，生产强度1.05g/L·h。

实施例4

按实施例1方法，使用硫酸处理甘蔗糖蜜，初始还原糖浓度为65g/L，在5L搅拌发酵罐(New Brunswich 110，New Brunswick Scientific，Edison，NJ，USA，使用两组圆盘六平直叶涡轮搅拌浆)中进行分批发酵。接种量5％，发酵温度37℃，搅拌转速200r/min，通气为100％CO₂。实验结果如表4所示：

表4 5L搅拌发酵罐分批发酵甘蔗糖蜜生产琥珀酸结果

 发酵时间h  残糖  g/L  琥珀酸  g/L    乙酸    g/L    甲酸    g/L    0    16    24    40    48  64.4  27.2  15.4  7.8  5.7  0.6  28.5  38.1  45.2  46.4    0    6.1    6.7    6.9    6.94    0    2.8    2.6    2.5    2.4

实施例5

按实施例4方法，使用硫酸处理甜菜糖蜜，初始还原糖浓度为65g/L，在5L搅拌发酵罐中进行分批发酵。实验结果如表5所示：

实验结果如表5所示：

表5 5L搅拌发酵罐分批发酵甜菜糖蜜生产琥珀酸结果

发酵时间h  残糖  g/L 丁二酸  g/L  乙酸  g/L    甲酸    g/L    0    16    24    40    48  64.5  32.9  21.4  12.7  8.9  0.2  24.3  33.7  41.2  44.9  0  3.7  5.2  6.5  7.0    0    2.7    3.2    3.1    2.8

实施例6

在5L搅拌罐中分别进行处理甘蔗糖蜜的补料分批发酵，初始还原糖浓度为35g/L，当发酵液残糖降为10g/L时，用蠕动泵以一定速度流加总还原糖浓度为300g/L的糖蜜溶液将发酵液中的糖浓度控制在10～15g/L。实验结果如表6所示：

表6 5L搅拌发酵罐补料分批发酵甘蔗糖蜜生产琥珀酸结果

发酵时间h  残糖  g/L  琥珀酸  g/L   乙酸    g/L    甲酸    g/L    0    16    24    40    48  34.26  13.8  9.6  11.7  8.6  0.3  30.4  41.9  52.9  55.1    0.05    5.25    7.14    8.45    8.77    0    2.25    2.97    2.74    2.68

补料分批发酵，48h总投入糖蜜还原糖浓度按最终体积计为86.1g/L，发酵剩余还原糖浓度为8.6g/L，产琥珀酸55.1g/L，对消耗糖产率71.10％，糖利用率90.0％，生产强度1.15g/L·h。

实施例7

在25L规模的搅拌罐(镇江东方生物工程公司发酵罐)上进行补料分批发酵，发酵条件同实施例6。与实施例6不同的是，补料采用的是间歇补料，分别于发酵12、19、25、36小时分四次补入已灭菌的含糖300g/L补料培养液约600ml。实验结果如表7所示：

表7 25L搅拌发酵罐补料分批发酵甘蔗糖蜜生产琥珀酸结果

发酵时间h  残糖  g/L  丁二酸  g/L    乙酸    g/L    甲酸    g/L    0    12    19    25    36    48    60  29.3  16.2  15.5  13.8  20.8  14.8  10.4  0.4  13.5  23.2  28.2  38.2  44.1  48.2    0    4.3    5.8    6.5    7.7    8.0    8.3    0    2.7    2.8    3.2    2.9    1.6    1.5

总投入糖蜜还原糖浓度按最终体积计为68g/L，发酵48h，产丁二酸44.1g/L，生产强度0.92g/L·h，对消耗糖产率82.90％，糖利用率78.24％。延长发酵至60h时产丁二酸达到48.2g/L，对消耗糖产率83.68％，糖利用率84.71％。

实施例8

按实施例6方法，发酵液含丁二酸55.1g/L，乙酸8.77g/L，甲酸2.68g/L。将发酵液加热90℃以上30min，然后离心，去除菌体及蛋白，得到预处理液。取上述发酵预处理液1000ml(测定预处理后发酵液含丁二酸58.96g/L)，在不断搅拌下，加40％CaCl₂溶液，50～80℃下进行钙化2～5h，将滤饼丁二酸钙配成浓度30％左右的溶液，在60～80℃下，缓慢滴加25％硫酸进行酸解，过滤、并水洗滤饼硫酸钙，酸解滤液用0.1％～2％的活性炭，70～80℃，脱色30～60min，过滤得脱色滤清液于70～80℃，0.08～0.1MPa真空下浓缩后，置冰箱中冷却析出结晶，滤出湿晶于60～65℃烘箱干燥得到白色粗晶，干重40.15g，测其纯度含丁二酸96.99％，计算总提取收率66.05％。样品经HPLC检测为一单峰，证明无杂酸，红外光谱与标准品一致。