人白细胞介素24增强抗结核的作用

摘要

本发明公开的人白细胞介素24具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，该序列含有人白细胞介素24蛋白分子的601个碱基。人白细胞介素24的重组质粒pVAX1－IL－24，其构建包括用PCR法将人IL－24cDNA从pcDNA3.1－IL－24扩增与纯化，得纯化的PCR产物，构建到真核表达载体pVAX－1上，还包括重组质粒pVAX1－IL－24的构建和制备步骤。本发明构建的pVAX1－IL－24系真核表达载体，可以在机体内表达IL－24蛋白，产生Th1型细胞免疫作用，其联合结核DNA疫苗Ag85B一起免疫，比单独用DNA疫苗Ag85B免疫，具有更强的抗结核感染作用，增强Ag85B抵抗结核感染的免疫保护作用，即IL－24具有作为一种免疫佐剂，具有增强抗结核的免疫保护的作用。

说明书

技术领域

本发明属于分子微生物学以及分子和感染免疫领域，特别是涉及一种人白细胞介素24(Interleukin-24，IL-24)增强抗结核的作用。

背景技术

结核病(Tuberculosis，TB)是一种严重危害人类健康的传染病，由结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起。目前全球结核病疫情仍十分严峻，据世界卫生组织估计，2005年有880万新结核病例，740万例在亚洲和撒哈拉以南非洲。共有160万人死于结核，包括感染艾滋病毒的195 000名患者。在全球22个结核高负担国家中，我国位居第二，仅次于印度^[1]。接种卡介苗(BCG)是目前预防结核病的主要措施，但大规模的疫苗控制试验表明其保护效力不够理想。BCG免疫效果不稳定，对成人没有保护作用，可干扰皮肤结核菌素试验结果，并且不能用于免疫功能缺损患者^[2]。因此，需要发展更有效的疫苗来控制结核病。

近20年国际组织提出控制结核病主要方法有：①发现和治疗痰菌阳性者；②新生儿接种卡介苗(BCG)，约80％获得保护力。BCG作为疫苗具有抗结核病的功效首先在印度提出，毫无疑问BCG能保护婴儿，但这种保护作用的持久性很有限，好象不能持续到成年；而且，卡介苗是活疫苗，苗内活菌数直接影响免疫效果。尽管早期用BCG接种在儿童中具有非常好的效果，然而靠接种来提供终生保护的概念并非出自BCG，这和BCG不能在人体中持续存在超过三年的事实有关^[3]。因此，BCG最终就丧失了其使效应T细胞及非特异性巨噬细胞活化的能力。它和野生型TB相反，后者能在宿主体内持续存在直至宿主死亡。在许多例子中也显示，持续低水平结核感染能使包括老年在内的免疫抑制期的感染加剧。

目前结核病疫苗的研究一方面集中于改善BCG的免疫原性，另一方面则集中于开发新型疫苗以代替传统BCG。但DNA疫苗在单独注射时难以发挥保护作用，因此如何提高其免疫保护能力迫在眉睫^[4]。

白细胞介素24(Interleukin-24，IL-24)，最先于1995年从人的黑色素瘤HO-1细胞中分离得到克隆，该基因在诱导分化的黑色素瘤细胞中高表达，并能促进黑色素瘤细胞分化，因此最初命名为MDA-7(黑色素瘤分化相关基因-7 melanoma differentiation-associatedgene-7)^[5]。IL-24可诱导人外周血单个核细胞产生高水平IFN-γ、IL-6、TNF-α，以及少量IL-1β、IL-12和粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，提示IL-24是一种免疫调节分子，主要表现为对TH1型细胞因子的诱导，具有抗肿瘤作用和抗感染作用^[6]。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种增强抗结核DNA疫苗Ag85B保护效果的细胞因子，利用构建用于增强人机体免疫应答的细胞因子pVAX1-IL-24质粒，通过肌肉注射方式与抗结核DNA疫苗Ag85B共同免疫，使被免疫者能够抵抗结核杆菌的感染。从而为其开辟了在抗结核感染中制备新型有效的抗结核DNA疫苗的新途径。

本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：

本发明提供的人白细胞介素24具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，该序列含有人白细胞介素24蛋白分子的601个碱基。

人白细胞介素24的重组质粒pVAX1-IL-24，其构建包括用PCR法将人IL-24cDNA从pcDNA3.1-IL-24扩增与纯化，得纯化的PCR产物，构建到真核表达载体pVAX-1上，其特征是包括以下步骤：

(1)重组质粒pVAX1-IL-24的构建和获得：

将纯化的PCR产物和载体pVAX1用BamHI和XhoI双酶切后，分别回收酶切产物，用T4DNA连接酶定向将IL-24基因片段与pVAX-1连接，以连接产物转化入DH5α感受态细菌，在LB(kan+)培养基中筛选培养；挑取阳性克隆，培养后小量提取质粒，用BamHI和XhoI双酶切，在1％琼脂糖凝胶检测，获得正确的重组质粒pVAX1-IL-24。

其中，PCR所用的上游引物p1、下游引物p2分别具有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，即：

上游引物p1：5′-GGGATCATGAATTTTCAACAGAGGCTG-3′，酶切位点为BamHI，

下游引物p2：5′-CCTCGAGTCAGAGCTTGTAGAATTTCTGC-3′，酶切位点为XhoI。

(2)重组质粒pVAX1-IL-24的DNA的制备：

将鉴定正确的质粒pVAX1-IL-24在LB(kan+)培养基中于37℃振荡培养过夜，用生理盐水调节细菌浓度为2×108/ml；根据大量提取试剂盒操作说明提取并纯化质粒；将抽提的质粒溶解于生理盐水中，测OD260/OD280的比值为1.70～1.85，适于DNA注射所用；然后将质粒的浓度调节到1μg/μL。

本发明提供的人白细胞介素24，其在增强抗结核作用中的应用。

本发明与现有技术相比，具有以下的主要优点：

DNA疫苗因为能有效地诱导细胞免疫应答(cell-mediatd immunity，CMI)，使机体获得抗结核分支杆菌感染的保护力，因而在结核病疫苗的开发中占有重要地位，但目前DNA抗结核疫苗的保护能力普遍不高^[7]。IL-24真核表达载体质粒进入动物体内，可激发机体产生高水平IFN-γ、IL-6、TNF-a，以及少量IL-1β、IL-12和粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，应而可以协同Ag85B发挥更强的免疫保护作用。本发明提供IL-24基因插入美国FDA推荐为可用于人类的表达载体pVAX-1中^[8]，与抗结核DNA疫苗Ag85B联合免疫，可在机体上持续表达的蛋白IL-24和Ag85B并刺激机体获得抗结核所需的Th1型免疫应答。动物实验显示，免疫小鼠抵抗标准结核菌株H37Rv的攻击能力显著加强。

总之，本发明构建的pVAX1-IL-24系真核表达载体，其联合抗结核DNA疫苗Ag85B，可以在机体内表达IL-24蛋白，具有增强Th1型细胞免疫作用并增强Ag85B保护作用。在增加感染结核小鼠生存时间，改善病理水平方面有积极作用。

附图说明

图1为重组质粒pVAX1-IL-24的琼脂糖凝胶图。其中：1.DNAmarker；2.IL-24PCR产物；3.pVAX-1空载酶切(BamHI和XhoI)产物；4.pVAX1-IL-24质粒；5.pVAX1-IL-24/BamHI+XhoI，pVAX1-IL-24为酶切产物。pVAX-1的大小为3.0kb，扩增产物IL-24的大小约0.6kb。

重组质粒pVAX1-IL-24为3.6kb，经双酶切后分别为3.0kb和0.6kb，经与图中DNAmarker所示的标准分子量对比可以知道，构建的质粒片段是正确的。

图2：免疫小鼠的抗结核杆菌Ag85B抗体水平。分别观察空载质粒、单独Ag85B和联合IL-24免疫小鼠后血中抗Ag85B抗体水平。可以明显看到pVAX1-IL-24可增强Ag85B在体内抗体的表达。pVAX-Ag85B+pVAX-IL24组与其它组相比，^*p＜0.05。

图3：感染结核杆菌后小鼠体内组织活菌量数量。

A组(H37Rv+NS对照)；B组(H37Rv+pVAX-1)；C组(H37Rv+pVAX-Ag85B)；D组(H37Rv+pVAX1-IL-24)；E(H37Rv+pVAX-Ag85B+pVAX-IL-24)；F(H37Rv+链霉素)。

箭头表示抗酸染色阳性的红色结核杆菌。取菌量对数和平均误差检测，由图3可知：两组织中联合免疫的小鼠的体内菌量明显减少。

图4：HE染色片。

图4A：H37Rv+生理盐水(normal saline，NS)对照组肺组织感染抗酸染色。箭头指示的是结核杆菌，可以看到联合免疫组抗酸染色阳性的结核杆菌最少，说明抗酸能力最强。

图4B：H37Rv+pVAX-1对照组肺组织感染HE染色。联合免疫组有少量浆液渗出、淋巴细胞浸润。其组织病变最小，说明阻遏结核感染能力最强。

图4C：H37Rv+pVAX-Ag85B对照组肺组织感染HE染色。

图4D：H37Rv+pVAX1-IL-24对照组肺组织感染HE染色。

图4E：H37Rv+pVAX-Ag85B+pVAX-IL-24对照组肺组织感染HE染色。

图4F：H37Rv+链霉素对照组肺组织感染HE染色。

具体实施方式

本发明提供的人白细胞介素24具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，该序列含有人白细胞介素24蛋白分子的601个碱基(请见文章末尾的序列表)。

本发明提供了人白细胞介素24的重组质粒pVAX1-IL-24，其构建包括用PCR法将人IL-24cDNA从pcDNA3.1-IL-24扩增与纯化，得纯化的PCR产物，构建到真核表达载体pVAX-1上，具体包括以下步骤：

一.构建：

模板为TRAP-hIL-24上游引物为5′-GGGATCATGAATTTTCAACAGAGGCTG-3′酶切位点为BamHI，下游引物为5′-CCTCGAGTCAGAGCTTGTAGAATTTCTGC-3′酶切位点为XhoI。将纯化的PCR产物和载体pVAX1用BamHI和XhoI双酶切后，分别回收酶切产物，用T4DNA连接酶定向将IL-24基因片段与pVAX-1连接，以连接产物转化入DH5α感受态细菌，在LB(kan+)培养基中筛选培养。挑取阳性克隆，培养后小量提取质粒，用BamHI和XhoI双酶切，在1％琼脂糖凝胶检测。

二.质粒DNA的制备：

将鉴定正确的质粒pVAX1-IL-24在LB(kan+)培养基中于37℃振荡培养过夜，用生理盐水调节细菌浓度为2×108/ml。根据大量提取试剂盒操作提取并纯化质粒。将抽提的质粒溶解于生理盐水中，测OD260/OD280的比值，均在1.8左右，适于DNA注射所用。将质粒的浓度均调节到1μg/μL。

三.免疫小鼠的抗结核杆菌Ag85B抗体水平分析：

将pVAX-1，pVAX-Ag85B，pVAX-Ag85B+pVAX-IL24或生理盐水分别免疫小鼠(每组6只)，每只小鼠左右分别股4头肌注射50μg/50μl，总剂量100μg/每只小鼠，经免疫一次后的第14天，检测血中anti-Ag85B的抗体效价。

四.小鼠感染结核杆菌后生存分析：

在观察小鼠感染结核杆菌60天左右，治疗组小鼠仍有大量存活。观察各组50％死亡的平均时间，生理盐水组感染后平均存活时间仅为21天，pVAX-1组感染后半数平均存活时间为45天；而联合IL-24+Ag85B组和单独IL-24或Ag85B质粒组和链霉素组感染后半数平均存活时间均大于45天，与生理盐水组和pVAX-1组相比有统计学意义(^*p＜0.05)；但联合IL-24+Ag85B组和单独IL-24或Ag85B质粒组和链霉素组间没有统计学意义。

五.免疫小鼠肺、脾组织荷菌量；

结核分支杆菌H37Rv感染小鼠后肺、脾组织菌落计数(表1)显示，IL-24+Ag85B联合治疗组和单独IL-24或Ag85B质粒组或链霉素组感染后的肺、脾组织荷菌量明显低于空载体或生理盐水对照组(^*p＜0.05)。

六.抗酸染色片：将小鼠肺组织抗酸染色。

1.取组织块，经多聚甲醛固定后，按常规脱水包埋。

2.切片4～5μm，在汽油松节油脱蜡2次，每次约5～10分钟；

3.不经酒精洗，用纱布将切片周围余液抹干，入流水稍漂洗；

4.滴入015％高锰酸钾水溶液，氧化5分钟，水洗；

5.2％草酸水溶液漂白1～2分钟，水洗；

6.滴入苯酚碱性品红液于室温5～10分钟；

7.流水洗去多余染液；

8.用20％硫酸水溶液分化至无色(一般需1分钟即可)，流水充分漂洗；

9.用015％美蓝水溶液浅染20～30s；

10.用风扇把切片吹干，即用二甲苯透明，中性树胶封固。

七.HE染色：

小鼠组织HE染色：

1.取材组织块，经固定后，常规石蜡包埋，4μm切片。

2.切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯(I)5分钟加入到二甲苯(II)5分钟，再加入100％乙醇2分钟→95％的乙醇1分钟→80％乙醇1分钟→75％乙醇1分钟→蒸馏水洗2分钟。

3.苏木素染色5分钟，自来水冲洗。

4.盐酸乙醇处理30秒。

5.自来水浸泡15分钟或温水(约50℃)5分钟。

6.置伊红液2分钟。

7.常规脱水，透明，封片：95％乙醇(I)分钟→95％乙醇(II)1分钟→100％乙醇(I)1分钟→100％乙醇(II)1分钟→二甲苯石碳酸(3∶1)1分钟→二甲苯(I)1分钟→二甲苯(II)1分钟→中性树脂封固。

本发明提供的人白细胞介素24，具有增强抗结核作用：利用构建用于增强人机体免疫应答的细胞因子pVAX1-IL-24质粒，通过肌肉注射方式与抗结核DNA疫苗Ag85B共同免疫，使被免疫者能够抵抗结核杆菌的感染。IL-24可作为-种新型免疫佐剂，为在抗结核感染中制备新型有效的抗结核DNA疫苗的提供了新的途径。

附表

表1  免疫小鼠肺、脾组织荷菌量(CFU)

Groups    Log(CFU)(肺)    (x±s)    Log(CFU)(脾)    (x±s)A(生理盐水)B(pVAX-1)C(pVAX-Ag85B)D(pVAX-IL-24)E(Ag85B+IL-24)F(链霉素)    7.417±0.372    6.601±0.683    5.161±0.376^*    4.982±0.488^*    4.073±0.784^*    4.268±0.665^*    5.552±0.577    5.095±0.214    2.999±0.351^*    2.972±0.320^*    2.445±0.371^*    2.886±0.544^*

A、B组与C、D、E和F组相比，^*p＜0.05

参考文献

[1]World Health Organisation.The World Health Report.2007.This website describes the work of theStop TB Department.

[2]Colditz GA，Brewer TF，Berkey CS，et al.Efficacy of BCG vaccine in the prevention of tuberculosis.Meta-analysis of the published literature.JAMA，1994，271(9)：698-702.

[3]Zinkernagel RM.On nature and artificial vaccinations.Annv.Rev.Immunol，2003，21：515-546.

[4]Jiang H，Lin JJ，Su ZZ，et al.Subtraction by bridization identifies a novel melanoma differentiationassociated gene，mda-7 modulated during human melanoma differentiation，growth andprogression[J].Oncogene，1995，11(12)：2477-2486.

[5]章晓联，汪付兵.新型细胞因子IL-24及其前景[J].细胞及分子免疫学杂志，2003；19(5)：S20-S22.

[6]Flynn P.E.variation in protection by BCG：implications of and for heterologouis immuntity.Lancet，1995，346：1339-1345.

[7]Kamath AT，Feng CG，Macdcnald M，et al.Differential protective efficacy of DNA vaccinesexpressing secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis.Infect Immun，1999，67(4)：1702-1707.

[8]FDA，Points to consider on Plasmid DNA Vaccines Preventive Infectious Disease Indications，Published December 22，1996，Docket no.96N-0400.

序列表

<110>武汉大学

<120>白细胞介素24增强抗结核的作用

<140>

<141>

<160>1

<170>

<210>1

<211>601

<212>DNA

<213>人白细胞介素24蛋白

<220>

<221>

<222>(1)...(601)

<223>

<400>1

1   atgaattttc aacagaggct gcaaagcctg tggactttag ccagaccctt ctgccctcct

61  ttgctggcga cagcctctca aatgcagatg gttgtgctcc cttgcctggg ttttaccctg

121 cttctctgga gccaggtatc aggggcccag ggccaagaat tccactttgg gccctgccaa

181 gtgaaggggg ttgttcccca gaaactgtgg gaagccttct gggctgtgaa agacactatg

241 caagctcagg ataacatcac gagtgcccgg ctgctgcagc aggaggttct gcagaacgtc

301 tcggatgctg agagctgtta ccttgtccac accctgctgg agttctactt gaaaactgtt

361 ttcaaaaact accacaatag aacagttgaa gtcaggactc tgaagtcatt ctctactctg

421 gccaacaact ttgttctcat cgtgtcacaa ctgcaaccca gtcaagaaaa tgagatgttt

481 tccatcagag acagtgcaca caggcggttt ctgctattcc ggagagcatt caaacagttg

541 gacgtagaag cagctctgac caaagccctt ggggaagtgg acattcttct gacctggatg

601 cagaaattct acaagctctg a

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>

<222>(1)...(29)

<223>PCR上游引物(p1)

<400>2

5′-GGGATCATGAATTTTCAACAGAGGCTG-3′

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>

<222>(1)...(31)

<223>PCR下游引物(p2)

<400>3

5′-CCTCGAGTCAGAGCTTGTAGAATTTCTGC-3′