含有与L－肉碱生物合成相关基因的肠杆菌科属微生物和使用该微生物生产L－肉碱的方法

摘要

本发明提供了属于肠杆菌科的微生物，其包括：编码来源于粗糙脉孢菌的N－三甲基赖氨酸羟化酶活性的多核苷酸；编码来源于粗糙脉孢菌的3－羟基－6－N－三甲基赖氨酸醛缩酶活性的多核苷酸；编码来源于粗糙脉孢菌的γ－三甲基氨基醛脱氢酶活性的多核苷酸；和编码来源于粗糙脉孢菌的γ－丁酰甜菜碱羟化酶活性的多核苷酸。还提供了使用所述微生物生产L－肉碱的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及包括来源于粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)的L-肉碱生物合成相关基因的属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的微生物，和使用其生产L-肉碱的方法。

背景技术

L-肉碱(3-羟基-4-三甲基氨基丁酸)，在生物体中普遍存在，是负责将活化的长链脂肪酸经由线粒体膜转运到线粒体基质中的两性离子化合物。已知L-肉碱由赖氨酸或蛋白质中的赖氨酸(以下，称为“蛋白质赖氨酸”)生物合成。哺乳动物蛋白质赖氨酸通常用作L-肉碱生物合成的前体。然而，在粗糙脉孢菌中，将游离赖氨酸用作L-肉碱的前体。在L-肉碱的生物合成中，形成作为中间体的ε-N，N，N-三甲基赖氨酸，ε-N，N，N-三甲基-β-羟基赖氨酸，N，N，N-三甲基氨基丁醛，和γ-丁酰甜菜碱。通过γ-丁酰甜菜碱羟化酶将γ-丁酰甜菜碱羟基化为L-肉碱。图1图解了在粗糙脉孢菌中假定的L-肉碱生物合成途径。

L-肉碱可以通过化学合成、酶促半合成或微生物学方法生产。然而，肉碱的化学合成不可避免地导致DL-肉碱外消旋混合物，由此要求分离DL-外消旋混合物。关于L-肉碱的酶促半合成，例如，美国专利号4,221,869公开了使用肉碱脱氢酶(EC 1.1.1.108)和辅酶NAD，由二氢肉碱生产L-肉碱的方法。然而，二氢肉碱极其不稳定并由此可以自发分解为丙酮基三甲铵和二氧化碳。德国专利号DE-OS-3123975公开了由γ-丁酰甜菜碱生产L-肉碱的方法，该方法使用从粗糙脉孢菌分离的γ-丁酰甜菜碱羟化酶(EC1.14.11.1)。然而，存在一个缺点，即在羟基化期间必须将α-酮戊二酸和还原剂(即，抗坏血酸)加入反应混合物。

关于通过微生物学方法生产L-肉碱，美国专利号5,028,538公开了生产L-肉碱的方法，该方法包括将大肠杆菌044 K 74温育在含有巴豆酸甜菜碱(4-N，N，N-三乙基氨基巴豆酸)的培养基中并从培养物中回收L-肉碱。美国专利号4,708,936公开了通过将木糖氧化产碱菌(Achromobacterxylosoxydans)DSM 3225(HK 1331b)温育在含有巴豆酸甜菜碱和/或γ-丁酰甜菜碱的培养基中来生产L-肉碱的方法。然而，按照该方法，需要使用巴豆酸甜菜碱，其对于L-肉碱生物合成既不是前体也不是中间体，L-肉碱的产率不高。因此，微生物学方法需要提高L-肉碱的产率。

因此，在使用廉价前体搜寻能够高产率生产L-肉碱的生产L-肉碱的微生物同时，本发明人发现来源于粗糙脉孢菌的L-肉碱生物合成相关基因在属于肠杆菌科的微生物中良好表达，并由此完成了本发明。

附图简述

图1图解了在粗糙脉孢菌中假定的L-肉碱生物合成途径；

图2是显示构建pT7-7carB的示意图；

图3是显示构建pT7-7carC的示意图；

图4是显示构建pT7-7carD的示意图；

图5是显示构建pT7-7carE的示意图；

图6是分别插入pT7-7carB，pT7-7carC，pT7-7carD，和pT7-7carE的基因的电泳图(泳道1：标记物，泳道2：carB，泳道3：carC，泳道4：carD，和泳道5：carE)；

图7是粗提物的SDS-PAGE图，所述粗提物来自分别用pT7-7carB，pT7-7carC，pT7-7carD，和pT7-7carE转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株(M：标记物，泳道1：阴性对照，泳道2：TMLH(52KDa)，泳道3：SHMT(53KDa)，泳道4：TMABADH(55KDa)，和泳道5：BBH(49KDa))；

图8是显示构建pT7-7BE的示意图；和

图9是显示构建pACYC184CD的示意图。

发明详述

发明的技术目的

本发明提供高产率生产L-肉碱的微生物。

本发明还提供了使用该微生物生产L-肉碱的方法。

发明内容

按照本发明的一方面，提供了属于肠杆菌科的微生物，其包括：编码来源于粗糙脉孢菌的N-三甲基赖氨酸羟化酶(TMLH)活性的多核苷酸；编码来源于粗糙脉孢菌的3-羟基-6-N-三甲基赖氨酸醛缩酶(SHMT)活性的多核苷酸；编码来源于粗糙脉孢菌的γ-三甲基氨基醛脱氢酶(TMABADH)活性的多核苷酸；和编码来源于粗糙脉孢菌的γ-丁酰甜菜碱羟化酶(BBH)活性的多核苷酸。

不限制本发明的微生物，只要它包括各自编码四种蛋白质的四种多核苷酸。优选地，该微生物是大肠杆菌(E.coli)并且更优选大肠杆菌KCCM-10581。

分别编码四种蛋白质即TMLH，SHMT，TMABADH，和BBH的四种多核苷酸可以经由载体或它们自身导入微生物细胞。在将分别编码四种蛋白质的四种多核苷酸通过载体导入微生物细胞的情形中，所述四种多核苷酸可以被包含在单一载体中或两个或多个载体中。在本文中所用的术语“载体”具有本领域公知的含义并且通常是指用于将核酸导入细胞中的核酸构建体。优选地，该核酸构建体是质粒或病毒基因组衍生的核酸构建体。

在本发明中，编码来源于粗糙脉孢菌的TMLH活性的多核苷酸编码来源于粗糙脉孢菌的TMLH。已知TMLH催化粗糙脉孢菌细胞中ε-N-三甲基赖氨酸向β-羟基-ε-N-三甲基赖氨酸的转化，但是本发明不限于TMLH的这种特定作用机制。优选地，编码TMLH的多核苷酸是编码SEQ ID NO：13所列出的氨基酸序列的多核苷酸，并且更优选地，具有SEQ ID NO：17所列出的核苷酸序列的多核苷酸。

编码来源于粗糙脉孢菌的SHMT活性的多核苷酸编码来源于粗糙脉孢菌的SHMT。已知SHMT催化粗糙脉孢菌细胞中β-羟基-ε-N-三甲基赖氨酸向γ-N-三甲基氨基丁醛的转化，但是本发明不限于SHMT的这种特定作用机制。优选地，编码SHMT的多核苷酸是编码SEQ ID NO：14所列出的氨基酸序列的多核苷酸，并且更优选地，具有SEQ ID NO：18所列出的核苷酸序列的多核苷酸。

编码来源于粗糙脉孢菌的TMABADH活性的多核苷酸编码来源于粗糙脉孢菌的TMABADH。已知TMABADH催化粗糙脉孢菌细胞中γ-N-三甲基氨基丁醛向γ-丁酰甜菜碱的转化，但是本发明不限于TMABADH的这种特定作用机制。优选地，编码TMABADH活性的多核苷酸是编码SEQID NO：15所列出的氨基酸序列的多核苷酸，并且更优选地，具有SEQ IDNO：19所列出的核苷酸序列的多核苷酸。

编码来源于粗糙脉孢菌的BBH活性的多核苷酸编码来源于粗糙脉孢菌的BBH。已知BBH催化粗糙脉孢菌细胞中γ-丁酰甜菜碱向L-肉碱的转化，但是本发明不限于BBH的这种特定作用机制。优选地，编码BBH活性的多核苷酸是编码SEQ ID NO：16所列出的氨基酸序列的多核苷酸，并且更优选地，具有SEQ ID NO：20所列出的核苷酸序列的多核苷酸。

根据本发明的另一方面，提供了生产L-肉碱的方法，该方法包括在底物存在下培养本发明的微生物以在培养物中生产L-肉碱，所述底物选自由下列各项组成的组：ε-N-三甲基赖氨酸，β-羟基-N-三甲基赖氨酸，γ-N-三甲基氨基丁醛，γ-丁酰甜菜碱，及其混合物。

在本发明生产L-肉碱的方法中，本发明的微生物如上所述。

在本发明生产L-肉碱的方法中，不特别限制底物的浓度，所述底物选自由下列各项组成的组：ε-N-三甲基赖氨酸，β-羟基-N-三甲基赖氨酸，γ-N-三甲基氨基丁醛，γ-丁酰甜菜碱，及其混合物。然而，优选地，所述底物的浓度范围为基于培养基重量的0.1至10wt％。

在本发明生产L-肉碱的方法中，可以通过分离和纯化回收培养物中的L-肉碱。分离和纯化是本领域公知的。通过非限制性的实例，通过超滤、离心或倾析，接着阳离子交换层析或电渗析，并然后再结晶，从细胞培养物分离上清来完成L-肉碱的回收。

发明效果

按照本发明的属于肠杆菌科的微生物具有良好的L-肉碱生产率，并因此可以有效用于L-肉碱的发酵生产。

按照本发明生产L-肉碱的方法，使用所述微生物可以以高产率生产L-肉碱。

实施本发明的最佳方式

以下，将参考下列实施例更具体地描述本发明。下列实施例是为了举例说明目的并且不是意图限制本发明的范围。

实施例：

在下列实施例中，选择编码来源于粗糙脉孢菌的与L-肉碱生物合成相关的各自蛋白质的四种多核苷酸，并构建包括所述多核苷酸的核酸构建体。将核酸构建体转化到大肠杆菌菌株中。将转化的大肠杆菌菌株在含有L-肉碱生物合成中间体的培养基中培养，生产和回收L-肉碱。

实施例1：从粗糙脉孢菌中分离分别编码N-三甲基赖氨酸羟化酶(TMLH)、3-羟基-6-N-三甲基赖氨酸醛缩酶(SHMT)、γ-三甲基氨基醛脱氢酶(TMABADH)和γ-丁酰甜菜碱羟化酶(BBH)的四种多核苷酸

在该实施例中，从粗糙脉孢菌中分离并克隆分别编码TMLH，SHMT，TMABADH，和BBH的四种多核苷酸，进行克隆的多核苷酸的序列分析。

(1)制备粗糙脉孢菌的cDNA文库

从含有粗糙脉孢菌的真菌菌体(包括孢子体)的培养物中分离总mRNA并使用poly-T引物反向转录。获得的cDNA通过PCR扩增，用EcoRI和XhoI消化，并插入λAD5克隆载体的EcoRI-XhoI位点，以制备来源于粗糙脉孢菌的cDNA文库。

接下来，将cDNA文库转化到大肠杆菌BNN322中。将转化的大肠杆菌BNN322培养以扩增cDNA文库。为此，首先，将大肠杆菌BNN322在含有50μg/ml的卡那霉素和0.2％葡萄糖的LB培养基中培养过夜。离心获得的培养物。去除上清液并将细胞沉淀重悬浮在1ml的10mM MgSO₄中。将获得的悬浮液和5×10⁷PFU的λcDNA文库在不振荡下30℃培养30分钟。将2ml的LB培养基另外加入培养物并将获得的培养物在振荡下30℃培养1小时。将培养的细胞铺平板在含有氨苄青霉素(75μg/ml)的LB培养基平板上，并在37℃下培养8小时。使用Wizard试剂盒从平板克隆中纯化cDNA文库集合。将含有纯化的cDNA文库集合的λ噬菌体用作扩增各自编码TMLH，SHMT，TMABADH，和BBH的四条多核苷酸的模板。

(2)扩增和克隆编码TMLH-的多核苷酸(carB基因)和检测TMLH生产

(a)扩增和克隆编码TMLH的多核苷酸(carB基因)

使用(1)的含有cDNA文库集合的λ噬菌体作为模板和SEQ ID NOS：1和2列出的寡核苷酸作为引物，进行PCR。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果，鉴定了所需的约1.4kb的PCR产物。SEQ ID NOS：1和2的引物包括编码来源于粗糙脉孢菌的TMLH的起始密码子和终止密码子的推定序列。通过在可公开获得的人-和大鼠-来源的TMLH氨基酸序列和从粗糙脉孢菌基因组表达的总蛋白的氨基酸序列之间的同源性搜索，推断来源于粗糙脉孢菌的TMLH，基于推定的来源于粗糙脉孢菌的TMLH，设计SEQ ID NOS：1和2的引物。

将PCR产物用EcoRI和SalI消化，连接到已经用相同的限制酶处理的pBS KS⁺(Stratagene Inc.)中。将通过将PCR产物插入pBS KS⁺中获得的pBS KS⁺carB转化到大肠杆菌DH5α中。将转化的大肠杆菌DH5α在37℃下培养8小时。从转化的大肠杆菌DH5α中分离pBS KS⁺carB并用EcoRI和SalI处理以确定PCR产物是否适当地插入大肠杆菌DH5α中。然后，将分离的pBS KS⁺carB用NdeI和SalI处理并进行琼脂糖凝胶电泳以获得NdeI-SalI片段。将NdeI-SalI片段连接到已经用相同限制酶处理的表达载体pT7-7中，以获得pT7-7carB(见FIG.2)。将pT7-7carB转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。

(b)检测TMLH生产

将pT7-7carB-转化的大肠杆菌BL21(DE3)在37℃下在250ml-带挡板的摇瓶中培养直至OD₆₀₀为0.6，所述摇瓶装有50ml补充了氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基。加入1mM的IPTG并将获得的细胞进一步培养4小时。从细胞培养物中分离pT7-7carB并用NdeI和SalI处理，将获得的限制片段使用琼脂糖凝胶电泳分离。电泳结果在图6中显示。如图6所示，观察到对应于NdeI-SalI片段的条带(泳道2)。pT7-7carB中的carB的核苷酸序列分析揭示pT7-7carB中的carB的核苷酸序列与国家生物技术信息中心(National Center for Biotecnology Information)(NCBI)的粗糙脉孢菌基因组数据库中发现的一致(SEQ ID NO：17)。

研究了在pT7-7carB-转化的大肠杆菌BL21(DE3)中表达的TMLH的活性。首先，将转化的大肠杆菌培养物在4,000xg下离心15分钟并收集细胞沉淀。将细胞沉淀用1ml裂解缓冲液(140mM NaCl，200g/l甘油，和1mM DTT，在10mM磷酸钠缓冲液中(pH 7.4))处理并再悬浮。将细胞悬浮液放置在冰浴中并使用超声均化器超声处理(x5，每次10秒)以破裂细胞。将细胞裂解物在4℃和10,000g下离心20至30分钟。去除细胞碎片并回收上清液以获得细胞粗提物。对来自细胞粗提物的样品进行8％SDS-PAGE(见图7)。SDS-PAGE结果揭示对应于TMLH的约52KDa条带的存在。

(3)扩增和克隆编码SHMT的多核苷酸(carC基因)和检测SHMT生产

(a)扩增和克隆编码SHMT的多核苷酸(carC)

使用(1)的含有cDNA文库集合的λ噬菌体作为模板和SEQ ID NOS：3和4列出的寡核苷酸作为引物，进行PCR。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果，鉴定了所需的约1.4kb的PCR产物。SEQ ID NOS：3和4的引物包括编码来源于粗糙脉孢菌的SHMT的起始密码子和终止密码子的推定序列。通过在可公开获得的人-和大鼠-来源的SHMT氨基酸序列和从粗糙脉孢菌基因组表达的总蛋白的氨基酸序列之间的同源性搜索，推断来源于粗糙脉孢菌的SHMT，基于推定的来源于粗糙脉孢菌的SHMT，设计SEQ ID NOS：3和4的引物。

将PCR产物用EcoRI和SalI消化，连接到已经用相同的限制酶处理的pBS KS⁺(Stratagene Inc.)中。将通过将PCR产物插入pBS KS⁺中获得的pBS KS⁺carC转化到大肠杆菌DH5α中。将转化的大肠杆菌DH5α在37℃下培养8小时。从转化的大肠杆菌DH5α中分离pBS KS⁺carC并用EcoRI和SalI处理以确定PCR产物是否适当地插入大肠杆菌DH5α中。然后，将分离的pBS KS⁺carC用NdeI和SalI处理并进行琼脂糖凝胶电泳以获得NdeI-SalI片段。将NdeI-SalI片段连接到已经用相同限制酶处理的表达载体pT7-7中，以获得pT7-7carC(见图3)。将pT7-7carC转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。

(b)检测SHMT生产

将pT7-7carC-转化的大肠杆菌BL21(DE3)在37℃下在250ml-带挡板的摇瓶中培养直至OD₆₀₀为0.6，所述摇瓶装有50ml补充了氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基。加入1mM的IPTG并将获得的细胞进一步培养4小时。从细胞培养物中分离pT7-7carC并用NdeI和SalI处理，将获得的限制片段使用琼脂糖凝胶电泳分离。电泳结果在图6中显示。如图6所示，观察到对应于NdeI-SalI片段的条带(泳道3)。pT7-7carC中的carC的核苷酸序列分析揭示pT7-7carB中的carB的核苷酸序列与国家生物技术信息中心(NCBI)的粗糙脉孢菌基因组数据库中发现的一致(SEQ ID NO：18)。

研究了在pT7-7carC-转化的大肠杆菌BL21(DE3)中表达的SHMT的活性。首先，将转化的大肠杆菌培养物在4,000xg下离心15分钟并收集细胞沉淀。将细胞沉淀用1ml裂解缓冲液(140mM NaCl，200g/l甘油，和1mM DTT，在10mM磷酸钠缓冲液中(pH 7.4))处理并再悬浮。将细胞悬浮液放置在冰浴中并使用超声均化器超声处理(x5，每次10秒)以破裂细胞。将细胞裂解物在4℃和10,000g下离心20至30分钟。去除细胞碎片并回收上清液以获得细胞粗提物。对来自细胞粗提物的样品进行8％SDS-PAGE(见图7)。SDS-PAGE结果揭示对应于SHMT的约53KDa条带的存在。

(4)扩增和克隆编码TMABADH的多核苷酸(carD)和检测TMABADH生产

(a)扩增和克隆编码TMABADH的多核苷酸(carD)

使用(1)的含有cDNA文库集合的λ噬菌体作为模板和SEQ ID NOS：5和6列出的寡核苷酸作为引物，进行PCR。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果，鉴定了所需的约1.5kb的PCR产物。SEQ ID NOS：5和6的引物包括编码来源于粗糙脉孢菌的TMABADH的起始密码子和终止密码子的推定序列。通过在可公开获得的人-和大鼠-来源的TMABADH氨基酸序列和从粗糙脉孢菌基因组表达的总蛋白的氨基酸序列之间的同源性搜索，推断来源于粗糙脉孢菌的TMABADH，基于推定的来源于粗糙脉孢菌的TMABADH，设计SEQ ID NOS：5和6的引物。

将PCR产物用EcoRI和SalI消化，连接到已经用相同的限制酶处理的pBS KS⁺(Stratagene Inc.)中。将通过将PCR产物插入pBS KS⁺中获得的pBS KS⁺carD转化到大肠杆菌DH5α中。将转化的大肠杆菌DH5α在37℃下培养8小时。从转化的大肠杆菌DH5α中分离pBS KS⁺carD并用EcoRI和SalI处理以确定PCR产物是否适当地插入大肠杆菌DH5α中。然后，将分离的pBS KS⁺carD用NdeI和SalI处理并进行琼脂糖凝胶电泳以获得NdeI-SalI片段。将NdeI-SalI片段连接到已经用相同限制酶处理的表达载体pT7-7中，以获得pT7-7carD(见图4)。将pT7-7carD转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。

(b)检测TMABADH生产

将pT7-7carD-转化的大肠杆菌BL21(DE3)在37℃下在250ml-带挡板的摇瓶中培养直至OD₆₀₀为0.6，所述摇瓶装有50ml补充了氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基。加入1mM的IPTG并将获得的细胞进一步培养4小时。从细胞培养物中分离pT7-7carD并用NdeI和SalI处理，将获得的限制片段使用琼脂糖凝胶电泳分离。电泳结果在图6中显示。如图6所示，观察到对应于NdeI-SalI片段的条带(泳道4)。pT7-7carD中的carD的核苷酸序列分析揭示pT7-7carD中的carD的核苷酸序列与国家生物技术信息中心(NCBI)的粗糙脉孢菌基因组数据库中发现的一致(SEQ ID NO：19)。

研究了在pT7-7carD-转化的大肠杆菌BL21(DE3)中表达的TMABADH的活性。首先，将转化的大肠杆菌培养物在4,000xg下离心15分钟并收集细胞沉淀。将细胞沉淀用1ml裂解缓冲液(140mM NaCl，200g/l甘油，和1mM DTT，在10mM磷酸钠缓冲液中(pH 7.4))处理并再悬浮。将细胞悬浮液放置在冰浴中并使用超声均化器超声处理(x5，每次10秒)以破裂细胞。将细胞裂解物在4℃和10,000g下离心20至30分钟。去除细胞碎片并回收上清液以获得细胞粗提物。对来自细胞粗提物的样品进行8％SDS-PAGE(见图7)。SDS-PAGE结果揭示对应于TMABADH的约55KDa条带的存在。

(5)扩增和克隆编码BBH的多核苷酸(carE)和检测BBH生产

(a)扩增和克隆编码BBH的多核苷酸(carE)

使用(1)的含有cDNA文库集合的λ噬菌体作为模板和SEQ ID NOS：7和8列出的寡核苷酸作为引物，进行PCR。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果，鉴定了所需的约1.3kb的PCR产物。SEQ ID NOS：7和8的引物包括编码来源于粗糙脉孢菌的BBH的起始密码子和终止密码子的推定序列。通过在可公开获得的人-和大鼠-来源的BBH氨基酸序列和从粗糙脉孢菌基因组表达的总蛋白的氨基酸序列之间的同源性搜索，推断来源于粗糙脉孢菌的BBH，基于推定的来源于粗糙脉孢菌的BBH，设计SEQ IDNOS：7和8的引物。

将PCR产物用EcoRI和SalI消化，连接到已经用相同的限制酶处理的pUC19中。将通过将PCR产物插入pUC19中获得的pUC19carE转化到大肠杆菌DH5α中。将转化的大肠杆菌DH5α在补充有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中在37℃下培养8小时。从转化的大肠杆菌DH5α中分离pUC19carE并用EcoRI和SalI处理以确定PCR产物是否适当地插入大肠杆菌DH5α中。然后，将分离的pUC19carE用NdeI和SalI处理并进行琼脂糖凝胶电泳以获得NdeI-SalI片段。将NdeI-SalI片段连接到已经用相同限制酶处理的表达载体pT7-7中，以获得pT7-7carE(见图5)。将pT7-7carE转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。

将pT7-7carE-转化的大肠杆菌BL21(DE3)在37℃下在250ml-带挡板的摇瓶中培养直至OD₆₀₀为0.6，所述摇瓶装有50ml补充了氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基。加入1mM的IPTG并将获得的细胞进一步培养4小时。从细胞培养物中分离pT7-7carE并用NdeI和SalI处理，将获得的限制片段使用琼脂糖凝胶电泳分离。电泳结果在图6中显示。如图6所示，观察到对应于NdeI-SalI片段的条带。pT7-7carE中的carE(1,278bp)的核苷酸序列分析揭示pT7-7carE中的carE的核苷酸序列与国家生物技术信息中心(NCBI)的粗糙脉孢菌基因组数据库中发现的一致(SEQ ID NO：20)。

(b)检测BBH生产

研究了在pT7-7carE-转化的大肠杆菌BL21(DE3)中表达的BBH的活性。首先，将转化的大肠杆菌培养物在4,000xg下离心15分钟并收集细胞沉淀。将细胞沉淀用1ml裂解缓冲液(140mM NaCl，200g/l甘油，和1mM DTT，在10mM磷酸钠缓冲液中(pH 7.4))处理并再悬浮。将细胞悬浮液放置在冰浴中并使用超声均化器超声处理(x5，每次10秒)以破裂细胞。将细胞裂解物在4℃和10,000g下离心20至30分钟。去除细胞碎片并回收上清液以获得细胞粗提物。对来自细胞粗提物的样品进行8％SDS-PAGE(见图7)。SDS-PAGE结果揭示对应于BBH的约49KDa条带的存在。

实施例2：构建含有carB，carC，carD，和carE的宿主细胞

在本实施例中，从实施例1中制备的来源于粗糙脉孢菌的cDNA文库扩增carB和carE基因，构建含有这两个基因的pT7-7BE。此外，从实施例1中制备的来源于粗糙脉孢菌的cDNA文库扩增carC和carD基因，并构建含有这两个基因的pACYC184CD。将如此构建的pT7-7BE和pACYC184CD导入大肠杆菌细胞以获得含有所有carB，carC，carD和carE基因的转化细胞。将转化的细胞命名为大肠杆菌DH5α CJ2004并于2004年1月27日保藏在国际保藏单位韩国微生物保藏中心(KCCM)(保藏号：KCCM-10581)。

(1)构建含有carB和carE基因的pT7-7BE

首先，使用来源于粗糙脉孢菌的cDNA文库作为模板和SEQ ID NOS：1和2的寡核苷酸作为引物，扩增carB基因。然后，使用来源于粗糙脉孢菌的cDNA文库作为模板和SEQ ID NOS：7和8的寡核苷酸作为引物，扩增含有从T7启动子至终止子区域的carE。将carB和carE扩增产物引入pT7-7。为此，首先将carE扩增产物用BamHI和SalI处理以获得BamHI-SalI片段。将BamHI-SalI片段连接到已经用相同限制酶处理的pT7-7中，以获得pT7-7carE。然后，用NdeI和EcoRI处理carB扩增产物以获得NdeI-EcoRI片段。将NdeI-EcoRI片段连接到已经用相同限制酶处理的pT7-7carE中以获得pT7-7BE(见图8)。

(2)构建含有carC和carD基因的pACYC184CD

首先，使用来源于粗糙脉孢菌的cDNA文库作为模板和SEQ ID NOS：3和4的寡核苷酸作为引物，扩增含有从T7启动子到终止密码子区域的carC基因。然后，使用来源于粗糙脉孢菌的cDNA文库作为模板和SEQ IDNOS：5和6的寡核苷酸作为引物，扩增含有从T7启动子至终止子区域的carD基因。将carC和carD扩增产物引入pACYC184。为此，首先将carC扩增产物用BamHI和HindIII处理以获得BamHI-HindIII片段。将BamHI-HindIII片段连接到已经用相同限制酶处理的pACYC184中，以获得pACYC184carC。然后，用BamHI和SalI处理carD扩增产物以获得BamHI-SalI片段。将BamHI-SalI片段连接到已经用相同限制酶处理的pACYC184carC中以获得pACYC184CD(见图9)。

实施例3：使用含有编码TMLH，SHMT，TMABADH和BBH的多核苷酸的菌株生产L-肉碱

在本实施例中，将分别用在实施例1中构建的pT7-7carB，pT7-7carC，pT7-7carD，和pT7-7carE转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株在含有三甲基赖氨酸的培养基中混合培养，然后测量L-肉碱的生产。另外，培养用在实施例2中构建的pT7-7BE和pACYC184CD共转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株，然后测量L-肉碱的生产。

(1)分别用pT7-7carB，pT7-7carC，pT7-7carD，和pT7-7carE转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株的混合培养

首先，将分别用pT7-7carB，pT7-7carC，pT7-7carD，和pT7-7carE转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株铺平板在补充有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB固体培养基上并培养。将每种培养物的细胞克隆在含有20ml补充有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基的摇瓶中37℃培养12小时，直至OD₆₀₀为1.0。将等量(每种0.1ml)的细胞培养物加入250ml含有20ml LB培养基的带挡板的摇瓶中并37℃培养直至OD₆₀₀为0.6，所述LB培养基含有2mM三甲基赖氨酸并补充有氨苄青霉素(100μg/ml)。在使用IPTG的情形中，在OD₆₀₀达到0.6后，加入1mM的IPTG，将获得的细胞进一步培养4小时。将不含三甲基赖氨酸的LB培养基用作对照。以与以上相同的方式进行IPTG的加入和细胞培养。

在培养后，测量细胞培养物中L-肉碱的含量。收获500μl的培养上清液并与500μl的1.2M高氯酸混合。将混合溶液在室温下温育10分钟，然后离心5分钟。将600μl获得的上清液与320μl的0.7M K₃PO₄混合。将混合溶液放置在冰浴中20分钟并离心5分钟。收获750μl获得的上清液并与250μl无菌蒸馏水混合以获得稀释溶液。将100μl的DNTB/H₂O₂加入稀释溶液中，将获得的溶液温育10分钟。加入50μl的过氧化氢酶溶液，将获得的溶液在室温下温育30分钟并离心，由此收获1ml获得的上清液。将50μl的乙酰CoA加入上清液并将获得的溶液在室温下温育5分钟。加入2.26μl的肉碱乙酰转移酶并将获得的溶液在室温下温育10分钟。测量终溶液的吸光度(405nm)以计算L-肉碱的含量。结果在下表1中显示。

表1：通过混合培养生产L-肉碱

  培养条件    浓度(μg/ml)  LB培养基(IPTG诱导)    0  LB培养基，含有2mM三甲基赖氨  酸(无IPTG诱导)    0.16  LB培养基，含有2mM三甲基赖氨  酸(IPTG诱导)    0.97

如表1所示，分别含有编码TMLH的多核苷酸、编码SHMT的多核苷酸、编码TMABADH的多核苷酸和编码BBH的多核苷酸的菌株在含有三甲基赖氨酸的培养基中的混合培养，能够以高产率生产L-肉碱。

(2)由用实施例2中构建的pT7-7BE和pACYC184CD共转化的大肠杆菌BL21(DE3)培养物生产L-肉碱

首先，将分别用pT7-7BE和pACYC184CD转化的大肠杆菌BL21(DE3)培养物铺平板于补充有氨苄青霉素(100μg/ml)和氯霉素(50μg/ml)的LB固体培养基上并培养。将每种培养物的细胞克隆在含有20ml补充有氨苄青霉素(100μg/ml)和氯霉素(50μg/ml)的LB培养基的摇瓶中37℃培养12小时，直至OD₆₀₀为1.0。将等量(每种0.1ml)的细胞培养物加入250ml含有20ml LB培养基的带挡板的摇瓶中并37℃培养直至OD₆₀₀为0.6，所述LB培养基含有2mM三甲基赖氨酸。在使用IPTG的情形中，在OD₆₀₀达到0.6后，加入1mM的IPTG，将获得的细胞进一步培养4小时。将不含三甲基赖氨酸的LB培养基用作对照。以与以上相同的方式进行IPTG的加入和细胞培养。

在培养后，以与(1)相同的方式测量细胞培养物中的L-肉碱的含量。结果在下表2中提供。

         表2：通过单一培养生产L-肉碱

  培养条件    浓度(μg/ml)  LB培养基(IPTG诱导)    0  LB培养基，含有2mM三甲基赖氨  酸(无IPTG诱导)    0.65  LB培养基，含有2mM三甲基赖氨  酸(IPTG诱导)    1.12

如表2所示，同时含有编码TMLH，SHMT，TMABADH和BBH的多个多核苷酸的菌株在含有三甲基赖氨酸的培养基中的培养，能够以高产率生产L-肉碱。在表1和2中表示的结果之间比较，可以看出通过单一培养的L-肉碱产率要高于通过混合培养的L-肉碱产率。

申请人或代理机构文件参考国际申请号

              涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示

                       (PCT细则13bis)

A.以下作出的指示涉及在说明书第3页第19行(注：中文说明书第11页第19行)中提及的保藏的微生物或其它生物材料B.保藏鉴定                                更多的保藏在附页上鉴定□保藏机构名称KCCM(韩国微生物保藏中心)保藏机构地址(包括邮政编码和国家)361-221，Yurim B/D，Honje 1，Sudaemun，首尔，120-091，韩国保藏日期2004年6月17日保藏号KCCM-10581C.另外的指示(如果不适用留空)   该信息在附页上继续□D.做出指示的指定局(如果其指示不是针对所有指定局)E.指示的单独说明(如果不适用留空)以下所列指示以后将提交给国际局(规定指示例如“保藏登记号”的一般性质)仅供受理局使用□该页与国际申请一起收到仅供国际局使用□该页于被国际局接收。授权官员授权官员

PCR/RO/134表(1998年7月)

                                      序列表

<110>CJ株式会社

<120>含有与L-肉碱生物合成相关基因的肠杆菌科属微生物和使用该微生物生产L-肉碱的方法

<130>PN054899

<160>20

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>1

atgaattcca tatgagaccg caagtggtag gg                                  32

<210>2

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>2

atgaattctc attttccgct ggtttctttc cg                                  32

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>3

atgaattcca tatgtctacc tactccctct cc                                  32

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>4

attgtcgact tagagaccgg catcgtatct                                     30

<210>5

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>5

atgaattcca tatggaagtc gagcttacgg cc                                  32

<210>6

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>6

attgtcgact catgccgcca ggtttacatg gat                                 33

<210>7

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>7

atgaattcca tatgatggcc acggcagcgg ttcag                               35

<210>8

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>8

attagtcgac tcaataccct cccccaccct g                                   31

<210>9

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>9

atggatccta atacgactca ctataggga                                      29

<210>10

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>10

attaagcttt tagagaccgg catcgtatct                                     30

<210>11

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>11

atggatccta atacgactca ctataggga                                      29

<210>12

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>12

atggatccta atacgactcactataggga                                       29

<210>13

<211>471

<212>PRT

<213>粗糙脉孢菌(Neuropora crassa)

<400>13

Met Arg Pro Gln Val Val Gly Ala Ile Leu Arg Ser Arg Ala Val Val

1               5                   10                  15

Ser Arg Gln Pro Leu Ser Arg Thr His Ile Phe Ala Ala Val Thr Val

            20                  25                  30

Ala Lys Ser Ser Ser Pro Ala Gln Asn Ser Arg Arg Thr Phe Ser Ser

        35                  40                  45

Ser Phe Arg Arg Leu Tyr Glu Pro Lys Ala Glu Ile Thr Ala Glu Gly

    50                  55                  60

Leu Glu Leu Ser Pro Pro Gln Ala Val Thr Gly Gly Lys Arg Thr Val

65                  70                  75                  80

Leu Pro Asn Phe Trp Leu Arg Asp Asn Cys Arg Cys Thr Lys Cys Val

                85                  90                  95

Asn Gln Asp Thr Leu Gln Arg Asn Phe Asn Thr Phe Ala Ile Pro Ser

            100                 105                 110

Asp Ile His Pro Thr Lys Val Glu Ala Thr Lys Glu Asn Val Thr Val

        115                 120                 125

Gln Trp Ser Asp Asn His Thr Ser Thr Tyr Pro Trp Pro Phe Leu Ser

    130                 135                 140

Phe Tyr Leu Thr Ser Asn Ala Arg Gly His Glu Asn Asp Gln Ile Ser

145                 150                 155                 160

Leu Trp Gly Ser Glu Ala Gly Ser Arg Pro Pro Thr Val Pro Phe Pro

                165                 170                 175

Arg Val Met Ala Ser Asp Gln Gly Val Ala Asp Leu Thr Ala Met Ile

            180                 185                 190

Lys Glu Phe Gly Phe Cys Phe Val Lys Asp Thr Pro His Asp Asp Pro

        195                 200                 205

Asp Val Thr Arg Gln Leu Leu Glu Arg Ile Ala Phe Ile Arg Val Thr

    210                 215                 220

His Tyr Gly Gly Phe Tyr Asp Phe Thr Pro Asp Leu Ala Met Ala Asp

225                 230                 235                 240

Thr Ala Tyr Thr Asn Leu Ala Leu Pro Ala His Thr Asp Thr Thr Tyr

                245                 250                 255

Phe Thr Asp Pro Ala Gly Leu Gln Ala Phe His Leu Leu Glu His Lys

            260                 265                 270

Ala Ala Pro Ser Arg Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro

        275                 280                 285

Ser Glu Glu Lys Glu Ala Ala Gly Ser Ala Ala Gly Glu Ala Ala Ala

    290                 295                 300

Ala Ala Glu Gly Gly Lys Ser Leu Leu Val Asp Gly Phe Asn Ala Ala

305                 310                 315                 320

Arg Ile Leu Lys Glu Glu Asp Pro Arg Ala Tyr Glu Ile Leu Ser Ser

                325                 330                 335

Val Arg Leu Pro Trp His Ala Ser Gly Asn Glu Gly Ile Thr Ile Ala

            340                 345                 350

Pro Asp Lys Leu Tyr Pro Val Leu Glu Leu Asn Glu Asp Thr Gly Glu

        355                 360                 365

Leu His Arg Val Arg Trp Asn Asn Asp Asp Arg Gly Val Val Pro Phe

    370                 375                 380

Gly Glu Lys Tyr Ser Pro Ser Glu Trp Tyr Glu Ala Ala Arg Lys Trp

385                 390                 395                 400

Asp Gly Ile Leu Arg Arg Lys Ser Ser Glu Leu Trp Val Gln Leu Glu

                405                 410                 415

Pro Gly Lys Pro Leu Ile Phe Asp Asn Trp Arg Val Leu His Gly Arg

            420                 425                 430

Ser Ala Phe Ser Gly Ile Arg Arg Ile Cys Gly Gly Tyr Ile Asn Arg

        435                 440                 445

Asp Asp Phe Ile Ser Arg Trp Arg Asn Thr Asn Tyr Pro Arg Ser Glu

    450                 455                 460

Val Leu Pro Arg Val Thr Gly

465                 470

<210>14

<211>480

<212>PRT

<213>粗糙脉孢菌(Neuropora crassa)

<400>14

Met Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Glu Thr His Lys Ala Met Leu Glu His

1               5                   10                  15

Ser Leu Val Glu Ser Asp Pro Gln Val Ala Glu Ile Met Lys Lys Glu

            20                  25                  30

Val Gln Arg Gln Arg Glu Ser Ile Ile Leu Ile Ala Ser Glu Asn Val

        35                  40                  45

Thr Ser Arg Ala Val Phe Asp Ala Leu Gly Ser Pro Met Ser Asn Lys

    50                  55                  60

Tyr Ser Glu Gly Leu Pro Gly Ala Arg Tyr Tyr Gly Gly Asn Gln His

65                  70                  75                  80

Ile Asp Glu Ile Glu Val Leu Cys Gln Asn Arg Ala Leu Glu Ala Phe

                85                  90                  95

His Leu Asp Pro Lys Gln Trp Gly Val Asn Val Gln Cys Leu Ser Gly

            100                 105                 110

Ser Pro Ala Asn Leu Gln Val Tyr Gln Ala Ile Met Pro Val His Gly

        115                 120                 125

Arg Leu Met Gly Leu Asp Leu Pro His Gly Gly His Leu Ser His Gly

    130                 135                 140

Tyr Gln Thr Pro Gln Arg Lys Ile Ser Ala Val Ser Thr Tyr Phe Glu

145                 150                 155                 160

Thr Met Pro Tyr Arg Val Asn Ile Asp Thr Gly Leu Ile Asp Tyr Asp

                165                 170                 175

Thr Leu Glu Lys Asn Ala Gln Leu Phe Arg Pro Lys Val Leu Val Ala

            180                 185                 190

Gly Thr Ser Ala Tyr Cys Arg Leu Ile Asp Tyr Glu Arg Met Arg Lys

        195                 200                 205

Ile Ala Asp Ser Val Gly Ala Tyr Leu Val Val Asp Met Ala His Ile

    210                 215                 220

Ser Gly Leu Ile Ala Ser Glu Val Ile Pro Ser Pro Phe Leu Tyr Ala

225                 230                 235                 240

Asp Val Val Thr Thr Thr Thr His Lys Ser Leu Arg Gly Pro Arg Gly

                245                 250                 255

Ala Met Ile Phe Phe Arg Arg Gly Val Arg Ser Val Asp Ala Lys Thr

            260                 265                 270

Gly Lys Glu Thr Leu Tyr Asp Leu Glu Asp Lys Ile Asn Phe Ser Val

        275                 280                 285

Phe Pro Gly His Gln Gly Gly Pro His Asn His Thr Ile Thr Ala Leu

    290                 295                 300

Ala Val Ala Leu Lys Gln Ala Ala Ser Pro Glu Phe Lys Glu Tyr Gln

305                 310                 315                 320

Gln Lys Val Val Ala Asn Ala Lys Ala Leu Glu Lys Lys Leu Lys Glu

                325                 330                 335

Leu Gly Tyr Lys Leu Val Ser Asp Gly Thr Asp Ser His Met Val Leu

            340                 345                 350

Val Asp Leu Arg Pro Ile Gly Val Asp Gly Ala Arg Val Glu Phe Leu

        355                 360                 365

Leu Glu Gln Ile Asn Ile Thr Cys Asn Lys Asn Ala Val Pro Gly Asp

    370                 375                 380

Lys Ser Ala Leu Thr Pro Gly Gly Leu Arg Ile Gly Thr Pro Ala Met

385                 390                 395                 400

Thr Ser Arg Gly Phe Gly Glu Ala Asp Phe Glu Lys Val Ala Val Phe

                405                 410                 415

Val Asp Glu Ala Val Lys Leu Cys Lys Glu Ile Gln Ala Ser Leu Pro

            420                 425                 430

Lys Glu Ala Asn Lys Gln Lys Asp Phe Lys Ala Lys Ile Ala Thr Ser

        435                 440                 445

Asp Ile Pro Arg Ile Asn Glu Leu Lys Gln Glu Ile Ala Ala Trp Ser

    450                 455                 460

Asn Thr Phe Pro Leu Pro Val Glu Gly Trp Arg Tyr Asp Ala Gly Leu

465                 470                 475                 480

<210>15

<211>495

<212>PRT

<213>粗糙脉孢菌(Neuropora crassa)

<400>15

Met Glu Val Glu Leu Thr Ala Pro Asn Gly Lys Lys Trp Met Gln Pro

1               5                   10                  15

Leu Gly Leu Phe Ile Asn Asn Glu Phe Val Lys Ser Ala Asn Glu Gln

            20                  25                  30

Lys Leu Ile Ser Ile Asn Pro Thr Thr Glu Glu Glu Ile Cys Ser Val

        35                  40                  45

Tyr Ala Ala Thr Ala Glu Asp Val Asp Ala Ala Val Ser Ala Ala Arg

    50                  55                  60

Lys Ala Phe Arg His Glu Ser Trp Lys Ser Leu Ser Gly Thr Glu Arg

65                  70                  75                  80

Gly Ala Leu Met Arg Lys Leu Ala Asp Leu Val Ala Glu Asn Ala Glu

                85                  90                  95

Ile Leu Ala Thr Ile Glu Cys Leu Asp Asn Gly Lys Pro Tyr Gln Thr

            100                 105                 110

Ala Leu Asn Glu Asn Val Pro Glu Val Ile Asn Val Leu Arg Tyr Tyr

        115                 120                 125

Ala Gly Tyr Ala Asp Lys Asn Phe Gly Gln Val Ile Asp Val Gly Pro

    130                 135                 140

Ala Lys Phe Ala Tyr Thr Val Lys Glu Pro Leu Gly Val Cys Gly Gln

145                 150                 155                 160

Ile Ile Pro Trp Asn Tyr Pro Leu Asp Met Ala Ala Trp Lys Leu Gly

                165                 170                 175

Pro Ala Leu Cys Cys Gly Asn Thr Val Val Leu Lys Leu Ala Glu Gln

            180                 185                 190

Thr Pro Leu Ser Val Leu Tyr Leu Ala Lys Leu Ile Lys Glu Ala Gly

        195                 200                 205

Phe Pro Pro Gly Val Ile Asn Ile Ile Asn Gly His Gly Arg Glu Ala

    210                 215                 220

Gly Ala Ala Leu Val Gln His Pro Gln Val Asp Lys Ile Ala Phe Thr

225                 230                 235                 240

Gly Ser Thr Thr Thr Gly Lys Glu Ile Met Lys Met Ala Ser Tyr Thr

                245                 250                 255

Met Lys Asn Ile Thr Leu Glu Thr Gly Gly Lys Ser Pro Leu Ile Val

            260                 265                 270

Phe Glu Asp Ala Asp Leu Glu Leu Ala Ala Thr Trp Ser His Ile Gly

        275                 280                 285

Ile Met Ser Asn Gln Gly Gln Ile Cys Thr Ala Thr Ser Arg Ile Leu

    290                 295                 300

Val His Glu Lys Ile Tyr Asp Glu Phe Val Glu Lys Phe Lys Ala Lys

305                 310                 315                 320

Val Gln Glu Val Ser Val Leu Gly Asp Pro Phe Glu Glu Ser Thr Phe

                325                 330                 335

His Gly Pro Gln Val Thr Lys Ala Gln Tyr Glu Arg Val Leu Gly Tyr

            340                 345                 350

Ile Asn Val Gly Lys Glu Glu Gly Ala Thr Val Met Met Gly Gly Glu

        355                 360                 365

Pro Ala Pro Gln Asn Gly Lys Gly Phe Phe Val Ala Pro Thr Val Phe

    370                 375                 380

Thr Asn Val Lys Pro Thr Met Lys Ile Phe Arg Glu Glu Ile Phe Gly

385                 390                 395                 400

Pro Cys Val Ala Ile Thr Thr Phe Lys Thr Glu Glu Glu Ala Leu Thr

                405                 410                 415

Leu Ala Asn Asp Ser Met Tyr Gly Leu Gly Ala Ala Leu Phe Thr Lys

            420                 425                 430

Asp Leu Thr Arg Ala His Arg Val Ala Arg Glu Ile Glu Ala Gly Met

        435                 440                 445

Val Trp Val Asn Ser Ser Asn Asp Ser Asp Phe Arg Ile Pro Phe Gly

    450                 455                 460

Gly Val Lys Gln Ser Gly Ile Gly Arg Glu Leu Gly Glu Ala Gly Leu

465                 470                 475                 480

Ala Pro Tyr Cys Asn Val Lys Ser Ile His Val Asn Leu Ala Ala

                485                 490                 495

<210>16

<211>425

<212>PRT

<213>粗糙脉孢菌(Neuropora crassa)

<400>16

Met Ala Thr Ala Ala Val Gln Val Ser Val Pro Ala Pro Val Gly Gln

1               5                   10                  15

Pro Asp Ile Gly Tyr Ala Pro Asp His Asp Lys Tyr Leu Ala Arg Val

            20                  25                  30

Lys Arg Arg Arg Glu Asn Glu Lys Leu Glu Ser Ser Leu Pro Pro Gly

        35                  40                  45

Phe Pro Arg Arg Leu Asp Ser Asp Leu Val Trp Asp Gly Asn Thr Leu

    50                  55                  60

Ala Glu Thr Tyr Asp Trp Thr Tyr Arg Leu Thr Glu Glu Ala Ile Asp

65                  70                  75                  80

Glu Ile Glu Ala Ala Leu Arg His Phe Lys Ser Leu Asn Lys Pro Leu

                85                  90                  95

Gly Tyr Ile Asn Gln Glu Thr Phe Pro Leu Pro Arg Leu His His Thr

            100                 105                 110

Leu Arg Ser Leu Ser His Glu Leu His His Gly His Gly Phe Lys Val

        115                 120                 125

Leu Arg Gly Leu Pro Val Thr Ser His Thr Arg Glu Glu Asn Ile Ile

    130                 135                 140

Ile Tyr Ala Gly Val Ser Ser His Val Ala Pro Ile Arg Gly Arg Gln

145                 150                 155                 160

Asp Asn Gln His Asn Gly His Pro Ala Asp Val Val Leu Ala His Ile

                165                 170                 175

Lys Asp Leu Ser Thr Thr Val Ser Asp Val Ser Lys Ile Gly Ala Pro

            180                 185                 190

Ala Tyr Thr Thr Glu Lys Gln Val Phe His Thr Asp Ala Gly Asp Ile

        195                 200                 205

Val Ala Leu Phe Cys Leu Gly Glu Ala Ala Glu Gly Gly Gln Ser Tyr

    210                 215                 220

Leu Ser Ser Ser Trp Lys Val Tyr Asn Glu Leu Ala Ala Thr Arg Pro

225                 230                 235                 240

Asp Leu Val Arg Thr Leu Ala Glu Pro Trp Val Ala Asp Glu Phe Gly

                245                 250                 255

Lys Glu Gly Arg Lys Phe Ser Val Arg Pro Leu Leu His Phe Gln Ser

            260                 265                 270

Thr Ala Ala Ala Ala Ser Arg Glu Ala Lys Pro Glu Ser Glu Arg Leu

        275                 280                 285

Ile Ile Gln Tyr Ala Arg Arg Thr Phe Thr Gly Tyr Trp Gly Leu Pro

    290                 295                 300

Arg Ser Ala Asp Ile Pro Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ala Glu Ala Leu

305                 310                 315                 320

Asp Ala Leu His Phe Thr Ala Glu Lys Tyr Ala Val Ala Leu Asp Phe

                325                 330                 335

Arg Gln Gly Asp Val Gln Phe Val Asn Asn Leu Ser Val Phe His Ser

            340                 345                 350

Arg Ala Gly Phe Arg Asp Glu Gly Glu Lys Gln Arg His Leu Val Arg

        355                 360                 365

Leu Trp Leu Arg Asp Pro Glu Asn Ala Trp Glu Thr Pro Glu Ala Leu

    370                 375                 380

Lys Glu Arg Trp Glu Arg Val Tyr Gly Gly Val Ser Pro Glu Arg Glu

385                 390                 395                 400

Val Phe Pro Leu Glu Pro Gln Ile Arg Ser Ala Ser Lys Gly Glu Ser

                405                 410                 415

Val Gly Thr Gln Gly Gly Gly Gly Tyr

            420                 425

<210>17

<211>1407

<212>DNA

<213>粗糙脉孢菌(Neuropora crassa)

<400>17

atgagaccgc aagtggtagg ggcaatcctc cgctctagag ctgttgtcag cagacaacct    60

ctttcgagga cccatatctt tgctgccgtc actgttgcaa agtcctcatc acctgcccag    120

aactcgagaa gaaccttttc atcctctttc cgacggttgt atgagccaaa ggcggagata    180

acagctgagg gacttgagtt gagccctcca caggctgtta cgggtggaaa gcggactgtt    240

ttacccaact tctggctacg tgacaactgc cggtgtacga aatgcgtgaa ccaagatact    300

ctccagagaa acttcaacac ttttgccatc ccctccgaca tccacccaac aaaggttgaa    360

gccaccaagg agaacgtcac cgtccaatgg tccgacaacc acacatccac ctacccctgg    420

cccttcctct ctttctacct cacctccaac gcgcgcgggc acgaaaacga ccagatctcc    480

ctctggggct ccgaagccgg ctcccgcccg ccaaccgtct ccttccctcg cgtgatggca    540

tcagaccagg gcgtcgccga cctaaccgcc atgatcaaag agttcggctt ctgtttcgtc    600

aaagacacac cccatgacga cccggacgtg acccgccagc ttctggagag aatcgccttt    660

atccgagtga cccattacgg cggcttttac gatttcacgc ccgacctcgc gatggccgac    720

acggcgtaca cgaacctggc gctgccggcg catacggata cgacgtactt cacggacccg    780

gcggggttgc aggcttttca cttgttggag cataaggccg ctccttctcg tcctcctcct    840

cctcctcctc ctcctcctcc tccttctgaa gaaaaagaag ctgcaggctc agcagcaggg    900

gaggcggcgg cggcagcaga agggggaaag tcgttgttgg tcgatgggtt caacgccgcg    960

aggattctga aggaggagga tccccgggct tatgagatct tgagcagcgt gagactgccg    1020

tggcatgcga gtggaaacga agggatcacg attgcgcccg ataagcttta tccggtgctg    1080

gaactgaatg aggataccgg ggaactgcat agggttaggt ggaataatga tgataggggt    1140

gtggtgccgt ttggggagaa gtacagcccg tcagagtggt atgaggcggc gaggaagtgg    1200

gatgggattt tgaggaggaa gagcagcgag ttgtgggtgc agttggagcc ggggaagccg    1260

ttgaggttct tcatggacgg agcgcgttct cgggtattag gaggatttgt ggagggtata    1320

tcaaccgcga tgacttcatc tctcggtgga ggaacacgaa ttacccaagg agcgaggttc    1380

ttccgagggt tactggttaa ggactga                                        1407

<210>18

<211>1443

<212>DNA

<213>粗糙脉孢菌(Neuropora crassa)

<400>18

atgtctacct actccctctc cgagactcac aaggccatgc tcgagcatag cttggtcgag    60

tccgaccccc aggtcgccga gatcatgaag aaggaggttc agcgccagcg cgagtccatc    120

atcctcatcg cctccgagaa cgtcacctcg cgtgccgtct tcgatgccct cggctccccc    180

atgtccaaca agtactcgga gggtcttccc ggcgcccgct actatggtgg caaccagcac    240

atcgacgaga tcgaggttct ctgccagaac cgtgcccttg aggccttcca cctcgacccc    300

aagcagtggg gtgtcaatgt tcagtgcttg tccggcagcc ctgccaacct ccaggtctac    360

caggccatca tgcccgtcca cggcagactc atgggtcttg acctccccca cggtggccat    420

ctttcccacg gttaccagac cccccagcgc aagatctctg ctgtctctac ctacttcgag    480

accatgccct accgcgtcaa cattgacact ggtctcatcg actacgatac cctcgagaag    540

aacgcccagc tcttccgccc caaggtcctc gtcgccggta cctctgccta ctgccgtctg    600

attgactacg agcgcatgcg caagattgcc gactccgttg gcgcttacct tgtcgtcgat    660

atggctcaca tttccggcct cattgcctcc gaggttatcc cctcgccctt cctctacgcc    720

gatgtcgtca ccaccaccac tcacaagtct ctccgtggcc ctcgtggcgc catgatcttc    780

ttccgccgcg gtgtccgctc cgttgacgcc aagaccggca aggagaccct ctacgacctt    840

gaggacaaga tcaacttctc cgtcttccct ggtcaccagg gtggccccca caaccacacc    900

atcaccgccc ttgccgttgc cctcaagcag gctgcctccc ccgagttcaa ggagtaccag    960

cagaaggtcg ttgccaacgc caaggctctc gagaagaagc tcaaggagct cggctacaag    1020

ctcgtctctg acggcactga ctctcacatg gtcctcgttg accttcgccc catcggcgtc    1080

gatggtgccc gtgttgagtt cctccttgag cagatcaaca ttacctgcaa caagaacgcc    1140

gttcccggcg acaagagcgc cctcaccccc ggcggtctcc gtattggtac ccccgctatg    1200

acctcccgtg gcttcggcga ggccgacttc gagaaggtcg ccgtcttcgt cgatgaggct    1260

gtcaagctct gcaaggagat ccaggcttcc ctccccaagg aggctaacaa gcagaaggac    1320

ttcaaggcca agatcgccac cagcgatatt ccccgcatca acgagctcaa gcaggagatt    1380

gccgcctgga gcaacacctt ccccctcccc gttgagggct ggagatacga tgccggtctc    1440

taa                                                                  1443

<210>19

<211>1488

<212>DNA

<213>粗糙脉孢菌(Neuropora crassa)

<400>19

atggaagtcg agcttacggc ccccaacggc aagaagtgga tgcagccact gggcttgttc    60

attaataacg agtttgtcaa aagtgccaat gagcagaagt tgatttccat caacccaact    120

accgaagagg agatctgctc ggtatacgcc gcaaccgccg aggatgttga cgccgcagta    180

tcagcagccc gcaaggcctt taggcacgaa tcatggaagt cgctatccgg cactgagcgc    240

ggcgccctga tgcgcaagct ggccgaccta gtggccgaga atgccgaaat cctagccacc    300

atcgagtgcc tggacaacgg caagccgtat cagacagccc ttaacgagaa cgtgcccgaa    360

gtgatcaacg tcctcaggta ctatgccggc tatgcggaca agaactttgg ccaagtgatt    420

gacgttggcc ccgccaagtt tgcctacacg gtcaaggagc ctctcggcgt atgtggccag    480

atcatcccct ggaactaccc gctagatatg gccgcctgga agctggggcc agctctctgc    540

tgcggcaaca ccgtggtcct caagctggcc gagcagactc ccctgtccgt gttgtacttg    600

gctaagctca ttaaggaggc cggcttccct cccggtgtga tcaatatcat caacggacac    660

ggcagggaag cgggtgccgc acttgtgcaa catcctcagg tggacaagat tgcctttacc    720

ggcagcacca ctacgggcaa ggagatcatg aagatggctt cctataccat gaagaacatc    780

accctggaga ctggcggcaa gtcaccgttg atcgtgtttg aggatgccga ccttgagctg    840

gcggcgacat ggtcacacat cggcatcatg agcaaccagg gccaaatctg cacagccact    900

tcacgcattc tcgtgcacga gaagatctac gacgagtttg tcgaaaaatt caaggccaaa    960

gtccaggagg tttcggtact cggcgacccc ttcgaggaga gcacgttcca cggacctcag    1020

gtcaccaaag cgcagtatga gcgtgttctg ggctatatca atgtcggaaa ggaagagggt    1080

gccacggtga tgatgggtgg tgagccggct ccgcagaacg gtaaaggttt ctttgtggcc    1140

ccgactgtct tcacgaacgt caagccgacc atgaagatct tcagggagga gatctttggg    1200

ccctgcgtgg ccattaccac gttcaaaacg gaggaggagg cgttgacgct ggccaacgac    1260

agcatgtatg gcctgggagc ggctctgttc accaaggacc taaccagggc acacagagtg    1320

gcgcgggaga tcgaggccgg catggtctgg gtcaacagca gcaacgattc agactttagg    1380

attccatttg gaggcgtgaa gcagtctggt attgggaggg agttgggaga ggcaggtctg    1440

gcaccttatt gcaacgtcaa gagtatccat gtaaacctgg cggcatga                 1488

<210>20

<211>1278

<212>DNA

<213>粗糙脉孢菌(Neuropora crassa)

<400>20

atggccacgg cagcggttca ggtttcagtc ccagctccgg ttggacaacc agatatcggg    60

tacgctcctg accacgacaa gtacctcgca agagtcaaaa gacgacgaga aaacgagaag    120

ctggagtcgt ctcttccgcc aggtttccct cgaagactag actcggacct tgtgtgggac    180

ggcaacaccc tcgccgagac gtacgactgg acctacagac tgacagaaga ggccattgat    240

gaaatcgagg ccgcgcttcg tcattttaag agcctcaaca agcccctagg ctacatcaac    300

caagaaacct tcccccttcc ccgcctacac cacactctcc gctccctctc ccacgagctc    360

caccacggcc acggcttcaa agtcctccgc gggctccccg tcacctccca tacacgcgag    420

gaaaacatca tcatctacgc cggcgtctcc tcgcatgtcg ctcctatccg cggccgccag    480

gacaaccagc acaacggcca cccagccgac gtagtcctag cacacatcaa agacctgtcc    540

acgactgttt ctgacgtgag caaaatcggt gcacccgcct acaccaccga gaaacaagtc    600

ttccacaccg acgcaggcga catcgtcgcc ctcttttgct tgggagaggc cgccgagggc    660

ggacagagtt acctgtccag cagctggaag gtgtacaacg agctggcagc cactcggccc    720

gatctggttc gcacgctggc ggagccgtgg gtggcggacg agtttggcaa ggaagggagg    780

aagttttctg tgcgaccgct tttgcatttt cagtctactg ctgctgctge ttctagggaa    840

gcaaagcccg agtctgaacg gctcatcatc cagtacgccc gccgcacgtt tacggggtat    900

tggggattac cgaggtcggc ggatatcccg cccattacgg aggcgcaggc ggaggcgttg    960

gatgcgctgc actttacggc ggagaagtac gcggtggcgc tggatttcag gcagggggat    1020

gtccagtttg tgaataactt gagtgtgttc cattcgaggg cggggtttag agatgagggg    1080

gagaagcaga ggcatttggt taggttgtgg ttgagagatc cggagaatgc gtgggagacg    1140

cccgaggcgt tgaaggaacg gtgggaacgc gtgtatggcg gggtgagtcc ggagagggag    1200

gtgtttccgc ttgagccgca gattaggagc gcgagtaagg gggagagcgt ggggacgcag    1260

ggtgggggag ggtattga                                                  1278