一种热球菌属嗜热古菌产耐高温α－淀粉酶的方法及产品

摘要

本发明是一种热球菌属嗜热古菌HJ21(Thermococcus siculi HJ21)CCTCC N0：M 207010。菌株为严格厌氧的球菌，直径为0.5－1μm；菌株生长温度范围为55－94℃，其最适生长温度为88℃；最适生长pH范围为6.5－7.0，低于4.5或高于9.0菌株不生长；生长NaCl浓度范围为1－5％，2％为最适宜NaCl浓度，没有NaCl和高于5％不生长；菌株在蛋白质丰富的基质中生长良好；淀粉、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、纤维二糖、乳糖、糖原、明胶促进菌株生长。本发明还公开了一种利用热球菌属嗜热古菌HJ21CCTCC N0：M207010产耐高温酸性α－淀粉酶的方法及所产耐高温酸性α－淀粉酶。

说明书

技术领域

本发明涉及一种分离自深海热液口的热球菌属嗜热古菌HJ21(已于2007年1月29日保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 207010)；本发明还涉及该菌株产耐高温α-淀粉酶的方法及产品。

背景技术

α-淀粉酶，系统名称为α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(α-1，4-glucan-4-glucanohydrolase EC.3.2.1.1)，是最重要的工业酶制剂之一，约占整个酶制剂市场的25％，已被广泛应用在食品、发酵、纺织、造纸和制药等诸多行业；但现在应用的α-淀粉酶大部分都存在热稳定性较差等方面的缺陷，导致工业生产成本的增加。要使工业生产过程中α-淀粉酶的主要特性与生产过程相适应，就需要开发耐高温的α-淀粉酶，为此众多国内外研究者把目光从陆地投向海洋，尤其是深海。

α-淀粉酶的来源非常丰富，在动植物及微生物中均发现有该酶的存在，尤其是Bacillus属的微生物现已被深入地研究和应用，但其最适活力温度在60℃左右，远达不到淀粉分解过程中要求的100℃～110℃。超嗜热微生物(Hyperthermophiles)最适生长温度为80-110℃，主要分布在80℃-115℃的超热的自然环境中，包括海平面4000米以下的海底热液口、深海热海底沉积物和流质喷气孔等环境中。迄今为止，国外已经发现约有10个目、29个属、70个种的嗜热的细菌和古细菌，其中除Thermotogales和Aquificales两个属外，大多为古细菌。从嗜热微生物中分离出来的超嗜热酶具有极高的热稳定性，通常能抵抗化学变性剂如表面活性剂、有机溶剂和高酸高碱环境，其催化功能优于目前在各种工业生产中应用的酶，因此研究开发耐高温的嗜热酶在工业生产中的应用具有重要的意义。

国外已报道产高温α-淀粉酶的超嗜热微生物主要为Thermococcus和Pyrococcus两个属，两个属是属于同一个目即Thermococcales。其中Pyrococcusfuriosus、Pyrococcus.woesei、Thermococcus Iitoralis和Thermococcusprofundu热稳定性α-淀粉酶已经被鉴定，这些酶的最适活力温度分别为100、100、80℃。国内在海洋超嗜热微生物的生理及其高温淀粉酶酶学方面的研究则很少，国内外对Thermococcus siculi产α-淀粉酶未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的能产耐高温α-淀粉酶的热球菌属嗜热古菌HJ21；本发明所要解决的另外的技术问题是设计该菌株的生长特性，及其产淀粉酶方法和酶的产品。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。

本发明的特征包括热球菌属嗜热古菌HJ21  CCTCC NO：M 207010菌株本身，以及利用该菌株产耐高温α-淀粉酶的方法，以及利用该菌株所产的耐高温α-淀粉酶产品。

本发明所涉及的菌株是一株分离白海底热液口的深海古菌(Thermococcussiculi HJ21)，于2007年1月29日在中国典型培养物保藏中心CCTCC保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M 207010。

一、本发明菌株的特征和生长特性的研究

1、菌株的特征研究

分别对菌株进行光学显微镜和透视电镜(南京农业大学)观察。

2、菌株的生长特性的研究

2.1温度对生长的影响：将菌株接入到YPS培养基中，分别在不同温度下培养，测定细胞浓度。

2.2 pH对生长的影响：在YPS培养基中加入下列不同的缓冲液(10mM)，在分别调节YPS培养基的pH：pH 3.5-4.5(不加缓冲液)，pH 5.0-6.0(MES)，pH 6.5-7.0(PIPES)，pH 7.5-8.5(HEPES)，pH 9.0-10.0(不加缓冲液)，在88℃培养24小时，测定细胞浓度。

2.3 NaCl对生长的影响：在YPS培养基中加入NaCl，使之为1％到10％的NaCl，在88℃培养24小时，测定细胞浓度。

2.4对碳氮源的利用：YPS培养基中的酵母粉和蛋白胨由0.43g/L(NH₄)₂SO₄取代，再加入不同浓度的碳氮源进行生长试验。糖源(淀粉、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、纤维二糖、乳糖、糖原、木糖、明胶和纤维素)添加量为0.5％(w/v)；氮源(酵母粉、蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白)为添加量为0.2％(w/v)；分别进行生长试验，测定细胞浓度。

2.5细胞浓度的测定：采用petroff-Hausser细菌计数板在Olympus相差显微镜测定。

3、关于本发明中的YPS培养基。

3.1 YPS培养基(每升)：1×base salt solution，1000ml；100×trace mineralssolution，10ml；1％CaCl₂·H₂O，5ml；100×N-P mixture，10ml；500×Fe EDTAsolution，2ml；PIPE，3.35g；Yeast extract powder，3g；Peptone，3g；Sulfur，10g，Maltose，5g.调节pH为6.5。培养基高压灭菌后，抽真空充N₂，反复几次；接种前加入Na₂S·9H₂O还原剂；88℃培养9-24小时。

3.1.1 1×base salt solution(每升)：NaCl，19.6g；Na₂SO₄，3.3g；KCl，0.5g；KBr，0.05g；H₃BO₃，0.02g；MgCl₂，8.8g；

3.1.2 100×trace minerals solution(每升)：CuSO₄·5H₂O，0.01g；ZnSO₄·7H₂O，0.1g；CoCl₂·6H₂O，0.005g；MnCl₂·4H₂O，0.2g；Na₂MoO₄·2H₂O，0.1g；KBr，0.05g；KI，0.05g；H₃B0₃，0.1g；NaF，0.05g；LiCl，0.05g；Al₂(SO4)₃，0.05g；NiCl₂·6H₂O，0.01g；VoSO₄·2H₂O，0.005g；H₂WO₄·2H₂O，0.002g；Na₂SeO₄，0.005g；SrCl·6H₂O，0.005g；BaCl₂，0.005g.

3.1.3 100×N-P mixture(每升)：(NH4)₂SO₄，43.0g；NaNO₃，60.5g；KH₂PO₄，3.6g.

3.1.4 500×Fe EDTA solution(每升)：FeSO₄·7H₂O，1.54g；Na-EDTA，2.06g.

4、菌株的形态特征和生长特性

4.1菌株的形态特征：该菌株为厌氧球菌，多成对存在，直径为0.5-1um(图1)，在含淀粉的液体YPS培养基中，发现在生长对数期时大量菌体粘附在淀粉颗粒上，而在平衡期时菌体则游离在液体中，仅很少有菌体粘附在淀粉颗粒上。图2是菌株的透视电镜图。

4.2温度、时间、NaCl和pH对生长的影响：生长温度范围为55-94℃，其最适生长温度88℃(见图3)；生长NaCl浓度范围为1-5％，2％为最适宜NaCl浓度，没有NaCl和高于5％不生长(见图4)。最适生长pH范围为6.5-7.0，低于4.5或高于9.0菌株不生长。

4.3菌株对碳氮源的利用。

分别将菌株接种在含不同碳氮源的培养基中进行生长试验，结果见表1：该菌株在蛋白质丰富的基质中生长良好。在淀粉、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、纤维二糖、乳糖、糖原、明胶促进菌株生长。

表1菌株对碳氮源的利用^a

    碳氮源^a    最大细胞浓度(10⁷个/ml)    对照    酵母粉    蛋白胨    胰蛋白胨    酪蛋白    淀粉    麦芽糖    葡萄糖    蔗糖    纤维二糖    乳糖    糖原    木糖    明胶    纤维素    2.75    12    12    12.6    7.63    3.75    5.9    6.25    3.73    3.75    3.18    3.19    2.21    4.16    2.5

^aYPS培养基中的酵母粉和蛋白胨由0.43g/L(NH₄)₂SO₄取代

二、菌株的分子鉴定

2.1 16S rRNAPCR扩增

按Takara试剂盒附带说明书步骤，提出高纯度基因组DNA。从已报道的16S rRNA序列中设计引物对正向引物：5’tccggttgatcctgccgg3’及反向引物：5’cggctaccttgttacgac3’。扩增在iCycle PCR仪(美国Bio-RAD公司)进行，50ul体系中，选取质量好的DNA模板约100ng作为PCR模板，引物(25uM)各1ul，dNTP mixture(10mMeach)1ul，TagDNA聚合酶2U。反应条件为95℃预变性5分钟，94℃变性1分钟，50℃退火40秒，72℃延伸1分钟，35个循环后，72℃延伸7分钟。PCR产物经1.0％(m/v)琼脂糖凝胶检测Goldview荧光染料染色，紫外检测仪(UV-III型，北京市新技术应用研究所)检测后，送上海生工纯化并进行双向测序。所测序列经组装后在GenBank注册，注册号为EF198107。

2.2数据处理及分析。利用DNAStar软件包结合测序峰图对16SrRNA基因片段核苷酸进行进行碱基排序、校正和组成分析、同源性分析。用MEGA免费软件，进行统计分析和聚类分析，从GenBank数据库中搜索同一科16SrRNA相关序列11条。采用邻接法(neibor-joining method)获得分子进化树，并用自展法(bootstrapping)进行置信度检测，自展数据为1000次。

三、菌株产耐高温α-淀粉酶的方法

将菌株接种于YPS培养基，于88℃中培养8-9小时。取出发酵液冷却至室温，用真空循环泵抽滤以除去硫颗粒，然后11000rpm/min，20min离心取上清液得到粗酶液。粗酶液中缓慢添加硫酸铵粉末至70％饱和度，边加边搅拌，添加完毕后继续搅拌15min，然后将其置于4℃培养箱中静置12小时；再11000r/min 20min离心收集沉淀，加入少量pH为7.5的50mMTris-HCl缓冲液溶解。将盐析液置于透析袋中，置于4℃中，用pH7.5的50mM Tris-HCl缓冲液透析24h(约换缓冲液4次)，再经过DEAE-sepharoseFlat Flow、羟基磷灰石、丁基疏水及Sephacryl S-200方法得到α-淀粉酶。

四、耐高温α-淀粉酶产品的性质

4.1温度对酶活性的影响：选择50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、110℃的不同温度下用标准方法进行酶活测定(图5)，酶的最适宜温度为95℃。

4.2酶的热稳定性：取适量酶液分别在80℃、90℃、100℃和110℃中保温不同时间，以未保温的酶活力作为对照，测残余酶活力，结果见图6。温度在90℃时，2小时仍持酶活力稳定，100℃1小时仍有75％的酶活力，110℃2h仍有40％的酶活力，是耐高温的α-淀粉酶。

4.3 pH对酶活性的影响：采用不同的缓冲对配制50mM pH从3～10的缓冲液，柠檬酸—柠檬酸钠pH3～5、乙酸—乙酸钠pH5～6、磷酸缓冲液pH6～7.5、Tris-HCl pH7.5～9；所的结果如图7，酶的最适pH为5.0，是一种酸性α-淀粉酶。

4.4 pH对酶稳定性的影响：采用不同的缓冲对配制50mM pH从3～10的缓冲液，柠檬酸—柠檬酸钠pH3～5、乙酸—乙酸钠pH5～6、磷酸缓冲液pH6～7.5、Tris-HClpH7.5～9；甘氨酸—氢氧化钠缓冲液pH9～10将100ul酶液与400ul上述缓冲液混合，置于80℃水浴锅中保温4h，按标准方法测定残余酶活，以未保温的酶液为对照，所的结果如图8，酶的最稳定pH为5.5。

4.5金属离子对酶活性的影响：配制CaCl₂、CoCl₂、ZnSO₄、FeCl₃、MnCl₂、NiCl₂、CuCl₂、BaCl₂、AgNO₃、SrCl₂、HgCl₂、Pb(COOCH₃)₂、LiCl、KCl、NaCl、Al₂SO₄和MgCl₂等金属盐溶液，浓度为0.01M/L；取10ul酶液加入100ul上述不同的盐溶液加入90ul淀粉溶液中用标准方法进行酶活力测定，以未加离子的酶液做为对照，所的结果如表2：由表2结果表明K⁺、Sr²⁺、Mg²⁺、Na⁺对α-淀粉酶活力有一定的促进作用Cu²⁺、Pb²⁺、Hg²⁺、Zn²⁺对α-淀粉酶有强烈的抑制作用。

4.6抑制剂对酶活性的影响：将各种抑制剂与酶液混合，使抑制剂最终浓度达到1mmol/L(SDS为1％)，测酶活结果见表3。IAA、PMSF、SDS对该酶有强烈的抑制作用，EDTA-Na和2-羟基乙醇对酶活有抑制作用，DTT、Urea对酶活无抑制作用。

表2 金属离子对酶活的影响

    金属离子    离子浓度    相对酶活    Ca²⁺    Co²⁺    Ba²⁺    Hg²⁺    K⁺    Pb²⁺    Mn²⁺    Ni²⁺    Mg²⁺    Sr²⁺    Li⁺    Ag⁺    Al³⁺    Cu²⁺    Na⁺    Fe³⁺    Zn²⁺    5mM    5mM    5mM    5mM    5mM    5mM    5mM    5mM    5mM    5mM    5mM    5mM    5mM    5mM    5mM    5mM    5mM    91.93538    71.82403    90.1043    -2.2455    107.2122    1.158    33.1276    73.9073    108.1178    101.7073    99.0543    77.71143    11.33615    0.43925    115.5407    50.21233    8.45495

表3抑制剂对酶活的影响

抑制剂名称    相对酶活(％)未加抑制剂(全酶对照)    100IAA    27.8PMSF    44.4DTT    100SDS    0Urea    1002-羟基乙醇    77.8EDTA-Na    77.8

5、淀粉酶活测定。

5.1淀粉酶酶活测定方法：

用50mM/L，pH 5的乙酸钠溶液配制的1％的可溶性淀粉190ul加入10ul酶液，88℃反应30min，加入200ulDNS100℃煮沸5min，终止反应，显色，520nm进行比色，空白由190ul淀粉加入10ul乙酸钠溶液。

5.2酶活力单位定义：在一定条件下，每分钟催化产1ug葡萄糖的酶量为一个活力单位。

五、耐高温α-淀粉酶的应用。

来源于海洋超嗜热微生物的高温α-淀粉酶具有极好热稳定性，活性完全不依赖于金属离子，能将淀粉在温度105℃～120℃，pH4.5～5.5条件下液化，高热稳定性α-淀粉酶作用时不要添加Ca²⁺，而且在盐性环境中的操作温度是100℃。因此用高温α-淀粉酶可以改善淀粉的处理条件，如可以提高底物的浓度；降低反应液粘度，减少输送费用；降低杂菌污染的风险；加快反应速率，缩短操作时间；降低酶纯化费用。因此具有高热稳定性的高温α-淀粉酶的研究，对改进工业淀粉转化工艺具有非常重要意义。而且由于高温α-淀粉酶在生产中能降低成本、提高转化率、减少环境污染，使之将在酒精发酵、抗菌素发酵、氨基酸发酵、淀粉糖的生产、有机酸发酵等以淀粉为原料的发酵工业中发挥巨大作用，因而具有极高的工业应用价值。

附图说明

图1为菌体光学显微镜图(10×100)。

图2为菌株的透视电镜图。

图3为温度对菌株生长的影响图。

图4为NaCl对菌株生长的影响图。

图5为温度对酶活性的影响图。

图6为酶的热稳定性图。

图7为酶作用pH图。

图8为酶pH稳定性图。

具体实施方式

实施例1。一种热球菌属嗜热古菌HJ21(Thermococcus siculi HJ21)CCTCC NO：M 207010。该菌株具有以下特征，菌株为严格厌氧的球菌，直径为0.5-1um；菌株生长温度范围为55-94℃，其最适生长温度为88℃；最适生长pH范围为6.5-7.0，低于4.5或高于9.0菌株不生长；生长NaCl浓度范围为1-5％，2％为最适宜NaCl浓度，没有NaCl和高于5％不生长；菌株在蛋白质丰富的基质中生长良好；淀粉、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、纤维二糖、乳糖、糖原、明胶促进菌株生长。

实施例2。利用实施例1所述的热球菌属嗜热古菌HJ21 CCTCC NO：M207010产耐高温酸性α-淀粉酶的方法，其步骤如下，

(1)将菌株接种于pH为6.5的YPS培养基，于88℃中培养8-9小时；取出发酵液冷却至室温，用真空循环泵抽滤除去硫颗粒，然后11000rpm/min，20min离心取上清液得到粗酶液；

(2)粗酶液中添加硫酸铵粉末至70％饱和度，边加边搅拌，添加完毕后继续搅拌15min，然后将其置于4℃培养箱中静置12小时；再11000r/min，20min离心收集沉淀，加入适量pH为7.5的50mM Tris-HCl缓冲液溶解，将盐析液置于透析袋中，置于4℃中，用pH为7.5的50mM Tris-HCl缓冲液透析24小时；再经过DEAE-sepharose Flat Flow、羟基磷灰石、丁基疏水及Sephacryl S-200方法得到α-淀粉酶。

实施例3。实施例2所述的方法所产耐高温酸性α-淀粉酶，所述的耐高温酸性α-淀粉酶具有以下特征：

(1)酶的最适作用温度为95℃，酶热稳定性好，酶在90℃、2小时保持酶活力不变，100℃、1小时保持75％的酶活力，110℃、2小时保持40％的酶活力，是耐高温的α-淀粉酶；

(2)酶的最适作用pH为5.0，酶的最稳定pH为5.5，是一种酸性α-淀粉酶；

(3)K⁺、Sr²⁺、Mg²⁺、Na⁺对α-淀粉酶活力有一定的促进作用；Cu²⁺、Pb²⁺、Hg²⁺、Zn²⁺对α-淀粉酶有强烈的抑制作用；

(4)IAA、PMSF、SDS对该酶有强烈的抑制作用，EDTA-Na和2-羟基乙醇对酶活有抑制作用。