古菌Sulfolobus sofaltaricus P2嗜热嗜酸淀粉酶基因的克隆和表达

摘要

耐热淀粉酶是现在工业生产中一个很重要的酶制剂，因其热稳定好、水解淀粉效率高，而广泛地应用在食品、制药等行业。目前工业上大规模使用的耐热淀粉酶大部分来自芽孢杆菌，主要是地衣芽孢杆菌。但地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶其最适pH为6.0左右，液化完成后进行糖化时所用的糖化酶最适pH为4.5，需要进行pH值的调整。这样不但增加了生产成本，而且造成后续处理设备的增加，排出的废水由于盐浓度的增加，还会造成处理困难和处理成本的上升。因此寻找和糖化酶最适pH相一致的耐高温α-淀粉酶对改进淀粉转化工艺有重要意义。 Sulfolobus sofaltaricus P2属于极端嗜热古菌，最适生长温度为80℃，最适pH为3.0-4.5。它的基因组全序列的测定已于2001年完成，其中有一编码α-淀粉酶的基因。通过PCR扩增，获得了该菌的α-淀粉酶基因sspa。将该基因插入表达载体pET29a中，构建重组表达载体pET29a-sspa，经IPTG诱导在Ecoli BL21(DE3)得到了表达，但是活性较低。通过软件SMART分析，sspα基因的功能域为7-447位氨基酸。所以将．sspa基因进行了部分切除，使酶活有了提高。 另外选择大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的穿梭表达载体pP43NMK,构建重组表达载体pP43NMK-sspa，实现α-淀粉酶基因sspa在在枯草芽孢杆菌中的分泌表达，但表达量非常低。分析表明可能是该基因中含有大量枯草芽孢杆菌的稀有密码子所致，因此使用重叠延伸PCR的方法，对该基因中的4个稀有密码子进行定点突变，最终提高了在枯草芽孢杆菌中的表达量。

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文献综述

材料与方法

结果与讨论

一、硫矿硫化叶菌Sulfolobus sofataricus P2 α-淀粉酶基因的克隆和在大肠杆菌中的表达

1Sulfolobus sofataricus P2 α-淀粉酶基因(sspa)的克隆

2重组表达质粒的构建

3 sspa基因在Escherichia coli BL21(DE3)中的表达

4 α-淀粉酶活性的测定

小结

二、硫矿硫化叶菌SulfolobussofataricusP2α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达

1重组载体pP43NMK-sspa的构建

2枯草芽孢杆菌1A771的转化

3重组枯草芽孢杆菌表达产物酶活分析

小结

三、sspa基因的改造及在大肠杆菌中的表达

1部分sspa基因的克隆

2重组表达质粒的构建

3 sspa7a、sspa11a在Escherichia coli BL21中的表达

4 α-淀粉酶活性的测定

小结

四、定点突变提高sspa基因在枯草芽孢杆菌中的表达

1 sspa11a的克隆

2定点突变

3重组载体pP43NMK-sspa4的构建

4重组表达质粒在枯草芽孢杆菌1A771中的表达

5 B.S 1A771(pP43NMK-sspa4)表达产物的SDS-PAGE分析

6重组枯草芽孢杆菌表达产物的酶活测定

小结

全文总结

参考文献

附录

致谢