具有R－异构体立体选择性的酯水解酶及其基因和重组酶

摘要

本发明公开了一种来自于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的编码具有R－异构体立体选择性的酯水解酶的基因BSEST，提供了含有BSEST序列及其相应的氨基酸序列；提供了含有BSEST的表达载体pBSEST－PET和含有这种载体的基因工程菌株：大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)/pBSEST－PET CGMCCNo.1648；本发明还提供了重组该酯水解酶的方法。本发明重组的酯水解酶是可用于立体选择性催化手性化合物(R型)的合成。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种具有R-异构体立体选择性的酯水解酶及其基因和重组酶，包括该酯水解酶基因的表达载体及制备其重组酶的方法及其基因工程菌株，以及该酯水解酶在立体选择性催化手性化合物(R型)合成中的应用。

背景技术

酯水解酶包括有脂肪酶和酯酶，它是一类在手性合成中有着重要用途的生物催化剂。这些酶能识别很宽的底物，目前＞40％的生物不对物合成反应可由酯水解酶催化完成，这些反应具有条件温和、反应的区域选择性和立体选择高等特点。在酶动力学拆分外消旋酯、胺和转化前手性醇等方面得到广泛的应用。另外，它们还可用于选择性酯化、转酯化和聚合反应中。

由于对手性药物和中间体需求的增长，利用生物法或酶法合成手性化合物日益得到人们的重视和工业化应用。生物法合成手性化合物的关键问题在于寻找具有高度立体选择性催化功能的生物催化剂。由于酯水解酶具有广泛的用途，筛选新的酯水解酶正成为酶工程的研究热点。虽然酯水酶在微生物界分布很广，但它们的立体选择性催化能力不一样。在同一生物体内往往存在多种酯水解酶，由于它们之间立体选择性存在差异性，利用微生物细胞或它们的粗酶制品进行酶法合成手性化合物时往往会降低产物的光学纯度(Geun-Joong Kim，Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic 17，2002：29-38)。解决这一问题可以通过工程的调控手段来减少副反应的发生(PerBerglund，Biomolecular Engineering，18，2001：13-22)，也可以通过分离纯化得到单一的酶制剂来进行催化反应，但这些过程往往较复杂并具有高的成本，在生产中不易被采用。如果通过基因工程的手段，直接克隆和表达所需要的酶的基因，就能够很方便达到以上的目的。

发明内容

本发明人即为了解决上述课题，通过筛选大量的微生物，发现芽孢杆菌属微生物能产生一种有高度R-异构体立体选择性的酯水解酶，可用于催化手性化合物的合成；为了提高这种酯水解酶的产量和消除野生型菌株中同工酶对酶催化反应的负面影响，本发明克隆了该基因并对此基因在大肠杆菌内进行表达。因此，本发明的目的之一是提供一种具有R-异构体立体选择性的酯水解酶及其基因和由此推断的氨基酸序列；目的之二是提供包括该酯水解酶基因的表达载体和利用该载体转化的重组微生物，如基因工程菌株；目的之三是提供从所述微生物制备重组酶的方法及由此制得的重组酶；目的之四是提供该重组酯水解酶在立体选择性催化手性化合物(R型)合成中的应用。

本发明具有R-异构体立体选择性的酯水解酶基因可得自芽孢杆菌属微生物，如Bacillus sp.ATCC 31195。本发明采用的技术方案是通过PCR扩增得到芽孢杆菌的一种具有R-异构体立体选择性的酯水解酶基因BSEST，测定了其核苷酸序列，如序列表中SEQ ID No.1所示，其中，其编码序列(CDS)从DNA第1个碱基起至第753终止，ATG为转录起始密码子，TAA为转录终止密码；并得到相应的氨基酸序列，如序列表中SEQ ID No.2所示。当然，如本领域技术人员所知，本发明酯水解酶基因还可以是编码由序列表中SEQID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的其它核苷酸序列；而本发明的酯水解酶不仅限是具有序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，还可以是将序列2中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有相同酶活性的由序列2衍生的蛋白质，比如在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，如与载体编码的氨基酸融合、不影响序列的修饰形式上的差异等情况。

本发明的另一目的是提供包括上述酯水解酶基因核苷酸序列的表达载体。其是用常规方法将本发明的酯水解酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成，该载体可以是市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，如pUC，pBluescript(Stratagene)，pET(Novagen，Inc.，Madison，Wis.)，PQE(Qiagen)，pREP，pSE420和pLEX(Invitrogen)，但不是仅限于这些载体。

较佳的是将用PCR扩增到的BSEST基因产物和克隆载体pMD18-T连接，形成克隆载体pBSEST-T。pBSEST-T和表达载体pET22b(+)分别用限制性内切酶消化，形成互补的粘性末端，经T4DNA连接酶连接，形成BSEST基因的表达载体(质粒)pBSEST-PET。

本发明的再一目的是提供一种转化体，其是将包含本发明酯水解酶基因核苷酸序列的表达载体转化到宿主微生物，例如感受态大肠杆菌——大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中得到的基因工程菌株，如将上述质粒pBSEST-PET转化其中得到含有pBSEST-PET的大肠埃希氏菌E.coliBL21(DE3)/pBSEST-PET，该菌株已于2006年3月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.1648。

本发明的又一目的是提供一种制备重组酯水解酶的方法，其包括用上述本发明表达载体转化宿主细胞，培养转化体，获得重组的酯水解酶。

其中，该宿主细胞可以为原核、真核微生物或昆虫等。较佳的是大肠杆菌，得到相应的转化体为上述的基因工程菌株：大肠埃希氏菌E.coliBL21(DE3)/pBSEST-PET CGMCC No.1648。

此菌株可在常规的IPTG诱导下(在OD₆₀₀＝0.5-0.6左右时加入，至其浓度为0.1-1mmol/L均可)高效表达酯水解酶蛋白，即为本发明的重组酯水解酶。

本发明的重组酯水解酶可以包含SEQ ID No.2所述的氨基酸序列；或具有与SEQ ID No.2所述的氨基酸序列至少有80％同源性的氨基酸序列。本发明的重组酯水解酶可以用于制备光学纯的手性化合物(R型)，特别是R-氟比洛芬和R-酮基布洛芬等R型2-芳基丙酸类药物的合成。

本发明的基因工程菌株：大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pBSEST-PET已于2006年3月10日在地址为中国北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.1648。

附图说明

图1为本发明BSEST的PCR扩增电泳图谱，其中，1、DNA Marker(λ-HindIII digest，TakaRa公司)；2、BSEST的PCR扩增产物。

图2为本发明质粒pBSEST-T的HindIII和NdeI双酶切分析图谱，其中，1、DNA Marker(λ-HindIII digest，Takala公司)；2、pBSEST-T/HindIII+NdeI。

图3为本发明表达质粒pBSEST-PET的HindIII和NdeI双酶切分析图谱，其中，1、pBSEST-PET/HindIII+NdeI；2、DNA Marker(λ-HindIII digest，Takala公司)；

图4为本发明重组酯水解酶水解氟比洛芬酯的反应产物的C₁₈HPLC分析图谱，其中，1、氟比洛芬；2、氟比洛芬酯。

图5为本发明重组酯水解酶水解氟比洛芬酯的反应产物的手性HPLC分析图谱，其中，1、(R)-氟比洛芬。

图6为表达质粒pBSEST-PET的构建示意图。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明。

下列实施例中的材料与方法为：

所采用的分子克隆技术参见J.萨母布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

所使用的工具酶均购自Takala公司，具体的反应条件和使用的方法均参考商品说明书。

所使用的胶回收试剂盒购自上海生工公司，使用方法参考商品说明书。

下面的商品化质粒和大肠杆菌株用于DNA文库构建和基因克隆。

pMD18-T(Takala，大连宝生物公司)

pET22b(+)(Novagen，美国)

大肠杆菌DH5a(Takala，大连宝生物公司)

大肠埃希氏菌BL21(DE3)(Takala，大连宝生物公司)

λ-DNA HindIII Marker(Takala，大连宝生物公司)

HisTrap^TMFF亲和层柱(Amersham Biosciences)

实施例1：从芽孢杆菌克隆BSEST基因

根据Bacillus sp H-257脂肪酶的DNA序列(J Biochem，2001，129：397)和Bacillus cereus C71脂肪酶的DNA序列(Genbank：AY896293)，设计简并引物1和引物2。在引物1加上NdeI位点，引物2加上HindIII位点。

引物1序列：GGAATTCCATATGAGCGAMCABTACHGGTGCTCGKGC

                  NdeI

引物2序列：CCCAAGCTTTCCNGCNTGCTTBKCGNAAAATKCGAGA

              HindIII

以芽孢杆菌(Bacillus sp.)ATCC 31195基因组DNA为模板进行PCR扩增(利用Takara试剂盒)，PCR反应混合物由2.5mmol/L dNTP，20pmol引物1和引物2，5单位Taq聚合酶(Takara)和提供的缓冲液组成。反应条件如下所示。步骤1之后向反应混合物加入Taq聚合酶。步骤2到4重复29次。

  步骤  温度  时间  1  97℃  5min  2  95℃  30sec

  3  58℃  30sec  4  72℃  1min  5  72℃  10min

用0.7％琼脂糖凝胶分离PCR产物，从凝胶中回收750bp的DNA片段(如图1所示)，简称为BSEST基因，与pMD18-T载体连接，所得质粒称pBSEST-T，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a。质粒pBSEST-T经过HindIII和NdeI双酶切分析，证明含有正确的插入片段(如图2所示)。对BSESTDNA进行DNA测序，序列如SEQ ID No.1所示，编码成熟肽的DNA的大小为753bp，其对应的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

实施例2：表达载体和转化体的构建

pBSEST-T质粒和pET22b(+)分别经NdeI和HindIII双酶切后，用0.7％琼脂糖凝胶分离酶切产物，从凝胶中分别回收750kbp和4.8kbp的DNA片段，用T4DNA连接酶连接，所得质粒称pBSEST-PET质粒，连接产物转化感受态大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)，经抗性培养基筛选得阳性克隆并进行HindIII和NdeI双酶切分析鉴定，证明含有正确的插入片段(如图3所示)，从而得到转化体-表达本发明酯水解酶的基因工程菌株E.coliBL21(DE3)/pBSEST-PET CGMCC No.1648。

实施例1～2过程如图6所示。

实施例3：酯水解酶的表达

将基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pBSEST-PET CGMCC No.1648，接于5ml、含50ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃震荡培养过夜。取50ul培养液接至5ml、含50ug/ml氨苄青霉素的新鲜LB培养基，培养至OD₆₀₀＝0.6左右，加入IPTG至其浓度为1mmol/L诱导，继续培养4h。离心收集菌体，以1mmol/L氟比洛芬乙酯为底物检测酶活力，酶活力为20U/g干菌体。

实施例4：重组酯水解酶的应用

取实施例3中的重组大肠杆菌，经超声破壁，离心去除菌体，上清液经HisTrap^TMFF亲和层柱后得到部分纯化的重组酯水解酶。取得到的该重组酯水解酶，水解10-500mmol/L(pH5-12.0，5-500mmol/L磷酸钾缓冲液)的外消旋氟比洛芬酯和酮基布洛芬酯，反应温度10-60℃。反应产物经C₁₈HPLC(流动相为甲醇∶水＝85∶15(V/V)，检测波长254nm，流速0.8ml/min，检测温度30℃)和手性CHI-TBB HPLC柱(流动相为正己烷∶叔丁基甲醚∶冰醋酸＝70∶30∶0.1(V/V)，检测波长254nm，流速1.0ml/min，检测温度30℃)分析转化率(图4)和产物的光学纯度(图5，其中(R)-氟比洛芬的保留时间应为11.357min)，结果如下表所示。从结果可知，不同的底物经过重组酯水解酶催化水解后，分别得到光学纯度＞99％的氟比洛芬和酮基布洛芬。以野生型的Bacillus sp ATCC 31195分离到的粗酯水解酶催化同样的反应，得到光学纯89％的氟比洛芬和酮基布洛芬。说明利用重组酯水解酶进行反应可以消除野生菌产生的其它同工酶的副反应，提高手性化合物的光学纯度。

  底物  产物  转化率(％)  光学纯度ee(％)  氟比洛芬甲酯  (R)-氟比洛芬  50  ＞99  氟比洛芬乙酯  50  ＞99  酮基布洛芬甲酯  (R)-酮基布洛芬  50  ＞99  酮基布洛芬乙酯  50  ＞99

                               序列表

<110>上海医药工业研究院；浙江海正药业股份有限公司

<120>具有R-异构体立体选择性的酯水解酶及其基因和重组酶

<130>061267C

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>753

<212>DNA

<213>芽孢杆菌(Bacillus sp.)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(753)

<223>

<400>1

atg agc gaa caa tat ccg gtg ctc tcg ggc gcc gag ccg ttt tac gcc    48

Met Ser Glu Gln Tyr Pro Val Leu Ser Gly Ala Glu Pro Phe Tyr Ala

1               5                   10                  15

gaa aac ggg ccg gtc ggg gtg ctg ctc gtg cac gga ttc acc ggc acg     96

Glu Asn Gly Pro Val Gly Val Leu Leu Val His Gly Phe Thr Gly Thr

            20                  25                  30

ccc cac agc atg cgc ccg ctc gct gaa gcg tat gcg aaa gcc ggc tat    144

Pro His Ser Met Arg Pro Leu Ala Glu Ala Tyr Ala Lys Ala Gly Tyr

        35                  40                  45

acc gtt tgc ctg ccg cgc tta aaa ggg cac gga acg cat tac gaa gac    192

Thr Val Cys Leu Pro Arg Leu Lys Gly His Gly Thr His Tyr Glu Asp

    50                  55                  60

atg gaa cgg acg acg ttc cac gat tgg gtc gcc tcg gtc gaa gaa gga    240

Met Glu Arg Thr Thr Phe His Asp Trp Val Ala Ser Val Glu Glu Gly

65                  70                  75                  80

tat gga tgg ctg aaa caa cga tgc caa acc att ttt gtc acc ggg ctg    288

Tyr Gly Trp Leu Lys Gln Arg Cys Gln Thr Ile Phe Val Thr Gly Leu

                85                  90                  95

tcg atg ggc ggg acg ctc acg ctt tat ttg gcg gaa cat cac cca gac    336

Ser Met Gly Gly Thr Leu Thr Leu Tyr Leu Ala Glu His His Pro Asp

            100                 105                 110

atc tgc ggc atc gtg ccg att aac gcc gct gtc gac atc ccg gcc atc    384

Ile Cys Gly Ile Val Pro Ile Asn Ala Ala Val Asp Ile Pro Ala Ile

       115                  120                 125

gcc gcc ggg atg acg ggc ggg ggc gag ctg ccg agg tat ctg gat tcg    432

Ala Ala Gly Met Thr Gly Gly Gly Glu Leu Pro Arg Tyr Leu Asp Ser

    130                 135                 140

atc ggt tcg gac ttg aaa aat ccg gat gtg aaa gag ctg gca tac gag    480

Ile Gly Ser Asp Leu Lys Asn Pro Asp Val Lys Glu Leu Ala Tyr Glu

145                 150                 155                 160

aaa acg ccg acc gct tcg ctt ctt cag ctg gct agg ctg atg gca cag    528

Lys Thr Pro Thr Ala Ser Leu Leu Gln Leu Ala Arg Leu Met Ala Gln

                165                 170                 175

aca aaa gcg aaa ctc gat cgc atc gtc tgt ccg gcg ttg att ttt gtc    576

Thr Lys Ala Lys Leu Asp Arg Ile Val Cys Pro Ala Leu Ile Phe Val

            180                 185                 190

tcc gac gaa gat cac gtc gtg ccg ccg gga aac gcc gac atc atc ttt    624

Ser Asp Glu Asp His Val Val Pro Pro Gly Asn Ala Asp Ile Ile Phe

        195                 200                 205

caa ggc att tca tcg acg gag aaa gag atc gtc cgc ctc cga aac agc    672

Gln Gly Ile Ser Ser Thr Glu Lys Glu Ile Val Arg Leu Arg Asn Ser

    210                 215               220

tac cat gtg gcg acg ctc gat tac gac caa ccg atg att att gaa cgg    720

Tyr His Val Ala Thr Leu Asp Tyr Asp Gln Pro Met Ile Ile Glu Arg

225                 230                 235                 240

tct ctc gaa ttt ttc gcc aag cac gcc gga taa                        753

Ser Leu Glu Phe Phe Ala Lys His Ala Gly

                245                 250

<210>2

<211>250

<212>PRT

<213>芽孢杆菌(Bacillus sp.)

<400>2

Met Ser Glu Gln Tyr Pro Val Leu Ser Gly Ala Glu Pro Phe Tyr Ala

1               5                   10                  15

Glu Asn Gly Pro Val Gly Val Leu Leu Val His Gly Phe Thr Gly Thr

            20                  25                  30

Pro His Ser Met Arg Pro Leu Ala Glu Ala Tyr Ala Lys Ala Gly Tyr

        35                  40                  45

Thr Val Cys Leu Pro Arg Leu Lys Gly His Gly Thr His Tyr Glu Asp

    50                  55                  60

Met Glu Arg Thr Thr Phe His Asp Trp Val Ala Ser Val Glu Glu Gly

65                  70                  75                  80

Tyr Gly Trp Leu Lys Gln Arg Cys Gln Thr Ile Phe Val Thr Gly Leu

                85                  90                  95

Ser Met Gly Gly Thr Leu Thr Leu Tyr Leu Ala Glu His His Pro Asp

            100                 105                 110

Ile Cys Gly Ile Val Pro Ile Asn Ala Ala Val Asp Ile Pro Ala Ile

        115                 120                 125

Ala Ala Gly Met Thr Gly Gly Gly Glu Leu Pro Arg Tyr Leu Asp Ser

    130                 135                 140

Ile Gly Ser Asp Leu Lys Asn Pro Asp Val Lys Glu Leu Ala Tyr Glu

145                 150                 155                 160

Lys Thr Pro Thr Ala Ser Leu Leu Gln Leu Ala Arg Leu Met Ala Gln

               165                 170                 175

Thr Lys Ala Lys Leu Asp Arg Ile Val Cys Pro Ala Leu Ile Phe Val

            180                 185                 190

Ser Asp Glu Asp His Val Val Pro Pro Gly Asn Ala Asp Ile Ile Phe

        195                 200                 205

Gln Gly Ile Ser Ser Thr Glu Lys Glu Ile Val Arg Leu Arg Asn Ser

    210                 215                 220

Tyr His Val Ala Thr Leu Asp Tyr Asp Gln Pro Met Ile Ile Glu Arg

225                 230                 235                 240

Ser Leu Glu Phe Phe Ala Lys His Ala Gly

                245                 250