抑制Bax基因表达的siRNA和表达载体及其作为乙型病毒性肝炎治疗药物的应用

摘要

本发明公开了一种抑制人、小鼠Bax基因表达的siRNA及其针对Bax基因的shRNA表达载体，并且进一步提供了Bax基因的shRNA表达载体作为乙型病毒性肝炎保肝治疗药物的应用。本发明利用shRNA表达载体在体内进一步表达siRNA的方法实现抑制Bax基因表达、降低乙肝的肝细胞凋亡、减轻肝细胞损伤、改善预后的目的，不仅避免了化学合成法、体外转录法等技术所存在的siRNA易降解，操作技术难度高等缺陷，而且可以成功实现siRNA在体内长期、持续表达的作用效果，为治疗急性重症乙型病毒性肝炎提供了一条前景诱人的途径，为新型药物的开发提供了依据。

说明书

技术领域

本发明涉及一种siRNA及其应用，特别是涉及抑制Bax基因表达的siRNA和表达载体及其作为乙型病毒性肝炎特别是急性重症乙型病毒性肝炎治疗药物的应用。

背景技术

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种世界性疾病，特别是在中国最为常见，发病率高，且呈持续高流行态势，其不仅直接影响人群的健康，甚至还危及人的生命安全，严重影响了人们的生产、生活、工作和学习，所造成的直接和间接的经济损失难以估量。

在我国法定报告的传染病中，多年来乙型病毒性肝炎的发病数和发病率一直高居前列，2005年国家将乙型病毒性肝炎列为四大重点防治的传染病。2006年2月13日卫生部发布了“十一五”全国乙型病毒性肝炎防治规划，该规划分析了乙型病毒性肝炎在我国的流行现状：1992-1995年全国病毒性肝炎血清流行病学调查显示，我国人群乙肝病毒感染率为57.6％，乙肝病毒携带率为9.75％，据此推算全国有6.9亿人曾感染过乙肝病毒，其中1.2亿人长期携带乙肝病毒。据专家估计，目前全国慢性乙肝病患者约有2,000万人，每年有约35万人死于慢性乙肝相关疾病。

乙型病毒性肝炎给病人、家庭、社会造成沉重的经济负担，给社会经济发展带来不容忽视的影响，是许多家庭因病致贫、因病返贫的重要原因，同时也引发出一系列社会问题，是我国现阶段最为突出的公共卫生问题之一。

乙型病毒性肝炎的临床表现多样化，以重症型肝炎和慢性肝炎最为突出。重症型乙型肝炎包括急性重症性肝炎(暴发性肝炎)、亚急性重症性肝炎(亚急性肝坏死)和慢性重症性肝炎，极易发展成坏死性肝硬化，预后极差，病死率高达60-70％以上。

尽管到目前为止，HBV的确切致病机制尚存在争议，但已有研究证实，HBV感染所致肝细胞凋亡失衡不仅是乙肝患者肝细胞损伤的重要分子机制之一，而且在乙肝患者不同的预后、转归中发挥着不容忽视的、甚至是决定性的作用。研究表明，机体通过凋亡方式清除HBV感染肝细胞的速度和程度与疾病的预后和转归密切相关。若机体凋亡反应适度，感染细胞及时凋亡并且凋亡小体被有效清除，则呈一过性感染，患者痊愈；若机体凋亡反应过弱，不能启动有效的凋亡反应，则病毒感染持续存在，病变演变为无症状携带状态或者进一步发展成为慢性肝炎；若机体启动的凋亡反应发生过于迅速但不能及时地清除凋亡小体，则可激发了过强的淋巴细胞和细胞因子参与的炎症坏死反应，引发急性甚至爆发性肝炎，严重者危及生命或者进一步演化为慢性肝炎。

已有研究发现，多种凋亡分子(如：FasL/Fas，TRAIL/DR4/DR5等)参与了HBV感染所诱导的肝细胞凋亡机制，其信号通路已经比较明确：死亡受体通过其胞外区与凋亡配体结合并活化后，其胞内的死亡结构域相互聚集，并进一步通过同嗜作用募集接头蛋白TRADD/FADD。TRADD/FADD接收到死亡受体传递的凋亡信号后，将引起胞内caspase 8的前体，即procaspase 8在其末端的局部募集和串联结合，从而形成死亡诱导信号复合体(DISC)。DISC形成后，其分子中的procaspase 8通过自身水解而成为有活性的caspase8，随后经线粒体依赖性和线粒体非依赖性两条途径引发细胞凋亡。(1)线粒体非依赖性途径：Caspase 8活化后能够引发蛋白酶解级联反应，进一步链式水解激活其下游的同源酶，如caspase 6、7等，最后激活caspase 3，活化的caspase 3作用于其效应物而引发细胞凋亡；(2)线粒体依赖性途径：活化的caspase 8切割胞浆中的Bid，形成tBid而转位到线粒体，同时引起Bax和Bak的同体寡聚化，导致线粒体膜通透性改变，最终引起细胞色素c、AIF、Smac/DIABLO等促凋亡因子的释放，并形成凋亡酶体，活化caspase9，最后激活caspase 3而诱发凋亡。

Bax蛋白(Bcl-2-associated protein)为第一个被发现的Bcl-2家族促凋亡成员，具有BH1、BH2、BH3结构域。在正常组织细胞中，Bax蛋白以无活性的单体形式存在于胞浆中。受凋亡信号刺激时，tBid分子可结合胞浆中Bax蛋白，使其构象发生变化、形成寡聚体，而被活化。Bax蛋白活化后，转运至线粒体并以寡聚体的形式插入线粒体外膜，通过多种不同的机制(自身形成通道、打开线粒体通透性转位孔等)影响线粒体外膜的通透性，释放细胞色素C(Cytochrome C)，激活下游通路分子。因此，Bax蛋白在凋亡通路的线粒体依赖途径和线粒体非依赖途径之间的对话中发挥关键性的“桥梁”作用。研究证实，HBV全基因组、HBx基因片段的表达可提高肝癌细胞中Bax蛋白的表达水平；HBV转基因小鼠急性乙型肝炎模型中亦存在Bax表达水平的上调。

RNAi技术就是利用双链RNA(Double-stranded RNA)诱导序列特异的转录后基因沉默，通过将双链RNA降解成长度为21～23nt的小干扰RNA片段(siRNA)，最终介导靶基因mRNA的降解。siRNA的干预效应关键取决于其靶基因序列的选择，任一核苷酸的错误会导致RNAi效应的丧失，这种高度序列特异性的选择性基因沉寂具有重要的药理作用。RNAi技术一经建立，即被广泛应用于生命科学和医学研究当中，如：基因功能研究、基因的表达机制及基因间的相互关系。2001年5月和2001年12月，德国科学家Elabshir、Harborth和Tuschl等人在《Nature》和《J.Cell Sci.》上相继发表了用RNAi技术分别使哺乳类细胞中16个基因表达水平降低或沉默，从而证明RNAi对哺乳类细胞也起作用，这使得这项技术应用于治疗某些由于特定基因表达过多引起的疾病，如癌基因的过度表达引起的癌症成为可能[参见：Elbashir SM，Harborth J，Lendeckel W，et al.Duplexes of 21±nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammaliancells.NATURE，2001，411(6836)：494-497.和Harborth J，Elbashir SM，Bechert K，et al.Identification of essential genes in cultured mammalian cells using smallinterfering RNAs.J Cell Sci，2001，114(24)：4557-4565.]。

目前，获得siRNA有很多种方法，主要包括化学合成法，体外转录和酶消化法以及体内转录法。

针对Bax基因的siRNA也已被应用于相关实验研究中。2003年8月，Ray等利用化学合成法制备了特异性针对人Bax基因的siRNA序列(人Bax mRNA的第209～229位)，反向证实Bax基因表达的上调在拓扑异构酶增强前列腺癌细胞系C4-2对TRAIL诱导凋亡敏感性中发挥关键性的作用[参见：Ray S and Almasan A.Apoptosis Induction inProstate Cancer Cells and Xenografts by Combined Treatment with Apo2 Ligand/TumorNecrosis Factor-related Apoptosis-inducing Ligand and CPT-11.CANCER RESEARCH，2003；63：4713-4723]。2005年1月，Kim等同样利用化学合成法制备了特异性针对小鼠Bax基因的siRNA序列(小鼠Bax mRNA的第217～237位)，抑制小鼠树突状细胞中Bax基因的表达，可延长其存活时间，进而增强小鼠细胞免疫功能，激活其抗肿瘤效应[参见：Kim TW，Lee JH，He L，et al.Modification of Professional Antigen-Presenting Cellswith Small Interfering RNA In vivo to Enhance Cancer Vaccine Potency.Cancer Res2005；65(1)：309-16.]。

在上述报道的诸项对人、小鼠Bax基因siRNA的研究中，均使用了化学合成的方法直接合成了Bax基因的siRNA序列，进行了凋亡分析相关的实验研究，虽然取得了很好的抑制Bax基因表达的效果，但是化学合成的siRNA序列在较短时间内即可被降解，不适应于长期研究(尤其是体内实验)，因此在应用上受到了一定的限制，而shRNA表达载体通过在细胞内持续转录产生siRNA，延长了siRNA的作用时间，目前已被广泛应用。

急性重症性乙型肝炎(暴发性肝炎)的发生与肝细胞的过度凋亡密切相关，利用针对Bax基因的shRNA表达载体，抑制Bax基因的表达，阻断凋亡信号的传导，可减轻肝细胞损伤程度，从而改善病人的预后。

经权威机构检索查新，利用Bax基因的shRNA表达载体作为乙型病毒性肝炎治疗药物，通过阻断或封闭Bax的表达来降低肝细胞凋亡，减轻肝细胞损伤的研究，目前国内外尚未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种抑制人、小鼠Bax基因表达的siRNA及其针对Bax基因的shRNA表达载体，并且进一步提供了Bax基因的shRNA表达载体作为乙型病毒性肝炎保肝治疗药物的应用。

本发明所述的特异性抑制人Bax基因表达的siRNA，其特征是：正义链核苷酸序列如SEQ ID №：1所示，反义链核苷酸序列如SEQ ID №：2所示；作用部位是作用于人BaxmRNA的第382～400位。

本发明所述的特异性针对人Bax基因的shRNA表达载体，其特征是：所述shRNA表达载体命名为pBax382-Si，其出发载体为pSilencer3.1-H1 neo；所述shRNA表达载体的shRNA序列包含权利要求1所述的编码序列及发夹结构、中间一段loop环、3’端6个dT修饰、5’端和3’端的酶切位点；其中：正义链核苷酸序列如SEQ ID №：3所示，反义链核苷酸序列如SEQ ID №：4所示。

构建上述人Bax基因shRNA表达载体的详细描述：

根据人Bax mRNA序列(GenBank号：GI：388165)，从ATG后开始寻找AA+N19序列(其中N19为任意19个mRNA核苷酸序列)，根据siRNA设计原则，选择第382～400位的基因序列作为靶序列，将该序列通过BLAST证实EST基因库靶向作用的基因是唯一的。设计包含上述靶序列及发夹结构、中间一段loop环、3’端有6个dT修饰、5’端和3’端的酶切位点的shRNA序列，序列结构为：+Sense+Loop+Antisense+终止信号+通过机器合成两条互补的上述shRNA序列(正义链为序列表中的SEQ ID №：3，反义链为序列表中的SEQ ID №：4)。合成的两条互补siRNA序列通过退火形成双链结构，再将其与经相同酶切(BamHI+HindIII)的shRNA表达载体pSilencer3.1-H1 neo(购自Ambion公司)连接。重组子经DNA测序(见附图1)鉴定阳性重组质粒，命名为pBax382-Si(见附图2)。

其中，上述的载体pSilencer3.1-H1 neo(购自Ambion公司)用于在人类组织细胞中表达siRNA序列，长约4.3kb，包含典型的人H1型RNA聚合酶III(pol III)启动子，该启动子可在距其一定距离的位置起始转录，遇到4～5个连续的T后终止转录。供shRNA片段插入的多克隆位点(BamH I和HindIII)位于pol III启动子下游。该载体尚具有由SV40启动子调控表达的新霉素筛选标记(neo)，可供筛选稳定表达小干扰RNA的宿主细胞。此外，在pol III启动子上游，包含测序引物M13F(-40)，便于对目的siRNA片段的测序。首先化学合成一段编码siRNA正义链(sense)和反义链(antisense)的模板，正义与反义序列之间由一段环序列隔开，插入载体Pol III启动子下游，然后转入细胞，环序列可使转录出的RNA链折叠，形成具有发夹结构的小RNA分子，这些小RNA可被细胞内的Dicer切割成长为21bp的siRNA，引起特定基因沉默。

本发明所述shRNA表达载体作为特异性、高效地抑制人类组织细胞中Bax基因表达的药物的应用。

本发明所述shRNA表达载体作为特异性、高效地抑制HBV基因片段转染肝癌细胞中Bax基因表达的药物的应用。

本发明所述shRNA表达载体作为有效抑制凋亡刺激信号所诱导的HBV基因片段转染肝癌细胞凋亡的药物的应用。

为了更好地理解本发明的实质和验证本发明所述Bax基因shRNA表达载体的作用效果，下面以药理实验及结果来进一步阐明。

人Bax基因shRNA表达载体抑制HBV基因片段转染肝癌细胞中Bax基因的表达实验：

将上述构建的Bax基因shRNA表达载体pBax382-Si以脂质体介导的方式瞬时转染高表达Bax基因的BEL7402-HBx细胞，同时以pSilencer3.1-H1 neo空载体转染组作为对照，72h后RT-PCR、荧光定量PCR、Western Blot检测Bax表达的mRNA水平、蛋白质水平。

RT-PCR电泳结果见附图3，光密度软件分析各片段光密度值，并计算Bax mRNA水平的相对表达强度(见附图4)，结果显示，pBax382-Si转染组细胞Bax mRNA的表达水平显著低于对照组细胞(P＜0.01)。荧光定量PCR结果显示(见表1)，pBax382-Si转染组细胞Bax mRNA的表达水平较BEL7402-HBx细胞下降67％。Western Blot结果见附图5，光密度软件分析各片段光密度值，并计算Bax蛋白水平的相对表达强度(见附图6)，结果显示，pBax382-Si转染组细胞Bax蛋白的表达水平显著低于对照组细胞(P＜0.01)。

                 表1RT-PCR检测各组细胞Bax mRNA的表达水平

  细胞 BEL7402-HBx细胞  pSilencer3.1-H1 neo转染组  pBax382-Si转染组  抑制率 0  -20％  67％

其中，上述的肝癌细胞株BEL7402-HBx为将HBV基因片段----HBx的表达质粒稳定转染BEL7402细胞[参见：Liang XH，Sun WS，Gao LF，et al.Hepatitis B virus X proteinmodulates the apoptosis of hepatoma cell line induced by TRAIL.Science inChina(English version)，48(3)：277-286.]。该细胞株较母本细胞BEL7402表达更高水平的Bax基因(与HBV全基因组转染的作用相类似)，对TRAIL介导的凋亡刺激信号有更高的敏感性。

人Bax基因shRNA表达载体有效抑制凋亡刺激信号所诱导的HBV基因片段转染肝癌细胞凋亡的实验：

将上述构建的Bax基因shRNA表达载体pBax382-Si以脂质体介导的方式瞬时转染高表达Bax基因的BEL7402-HBx细胞，72h后加入10ng/ml重组TRAIL蛋白(购自PeproTech公司)，TUNEL流式细胞术检测细胞凋亡率变化情况。

TUNEL流式细胞术检测结果显示(见附图7)，Bax基因shRNA表达载体pBax382-Si通过抑制Bax基因的表达，可显著下调TRAIL诱导的BEL7402-HBx细胞的凋亡率。pBax382-Si转染组细胞凋亡率为17.8％±4.5％，显著低于BEL7402-HBx细胞(43％±5.4％)(P＜0.05)，接近BEL7402细胞的凋亡率(12.6％±2.7％)(P＞0.05)，而pSilencer3.1-H1neo转染组细胞(43％±2.4％)与BEL7402-HBx细胞无显著差异(P＞0.05)。

上述结果表明，利用人Bax基因shRNA表达载体抑制Bax基因的表达，可有效抑制凋亡刺激信号所诱导的HBV基因片段转染肝癌细胞的凋亡。

为进一步验证本发明所述人Bax基因shRNA表达载体的作用效果，本发明同时提供了一种特异性抑制小鼠Bax基因表达的siRNA及其针对Bax基因的shRNA表达载体，并且利用药理实验及结果来进一步阐述了其降低HBV转基因小鼠乙型病毒性肝炎模型中肝细胞凋亡，减轻肝细胞损伤，抗炎保肝的作用。

本发明所述的特异性抑制小鼠Bax基因表达的siRNA，其特征是：正义链核苷酸序列如SEQ ID №：5所示，反义链核苷酸序列如SEQ ID №：6所示；作用部位是作用于小鼠Bax mRNA的第451～469位。

本发明所述的特异性针对小鼠Bax基因的shRNA表达载体，其特征是：所述shRNA表达载体命名为pmU6-Bax451，其出发载体为pmU6pro；所述shRNA表达载体的shRNA序列包含权利要求6所述的编码序列及发夹结构、中间一段loop环、3’端5个dT修饰、5’端和3’端的酶切位点；其中：正义链核苷酸序列如SEQ ID №：7所示，反义链核苷酸序列如SEQ ID №：8所示。

构建上述小鼠Bax基因shRNA表达载体的详细描述：

根据小鼠Bax mRNA序列(GenBank号：GI：388191)，从ATG后开始寻找AA+N19序列(其中N19为任意19个mRNA核苷酸序列)，根据siRNA设计原则，选择第451～469位的基因序列作为靶序列，将该序列通过BLAST证实EST基因库靶向作用的基因是唯一的。设计包含上述靶序列及发夹结构、中间一段loop环、3’端有6个dT修饰及5’端和3’端的酶切位点的shRNA序列，序列结构为：+Sense+Loop+Antisense+终止信号+通过机器合成两条互补的上述shRNA序列(正义链为序列表中的SEQ ID№：7，反义链为序列表中的SEQ ID №：8)。合成的两条互补siRNA序列通过退火形成双链结构，再将其与经相同酶切(BbsI+XbaI)的shRNA表达载体pmU6pro连接。重组子经DNA测序(见附图8)鉴定阳性重组质粒，命名为pmU6-Bax451(见附图9)。

其中，上述的载体pmU6pro[参见：Yu JY，DeRuiter SL，Turner DL.RNA interferenceby expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells.ProcNatl Acad Sci USA.2002 Apr 30；99(9)：6047-52.]，用于在小鼠组织细胞中表达siRNA序列，长约4.1kb，包含典型的小鼠U6型RNA聚合酶III(pol III)启动子，该启动子可在距其一定距离的位置起始转录，遇到4～5个连续的T后终止转录。供siRNA片段插入的多克隆位点(BbsI和XbaI)位于pol III启动子下游。在shRNA片段下游，存在SV40pA加尾信号，氨苄青霉素抗性基因amp和原核细胞启动子f1 origin。此外，在pol III启动子上游，包含测序引物f1F，便于对目的shRNA片段的测序。首先化学合成一段编码siRNA正义链(sense)和反义链(antisense)的模板，正义与反义序列之间由一段环序列隔开，插入载体Pol III启动子下游，然后转入细胞，环序列可使转录出的RNA链折叠，形成具有发夹结构的小RNA分子，这些小RNA可被细胞内的Dicer切割成长为21bp的siRNA，引起特定基因沉默。

上述shRNA表达载体作为特异性、高效地抑制小鼠各组织细胞中Bax基因表达的药物的应用。

上述shRNA表达载体作为特异性、高效地抑制HBV转基因小鼠急性肝炎模型中肝细胞Bax基因表达的药物的应用。

上述shRNA表达载体作为有效降低HBV转基因小鼠急性肝炎模型中肝细胞的凋亡，减轻肝细胞损伤的药物的应用。

药理实验及结果证明：

急性乙型病毒性肝炎小鼠动物模型的制备：

经QIAGEN质粒大量提取试剂盒纯化重组质粒pcDNA3-HBV1.1[参见：张秋，孙汶生，高立芬等.TRAIL诱导HBV转染肝癌细胞BEL-7402凋亡的作用及机制研究.中华微生物学和免疫学杂志，2005；25(5)：357-362。]，以生理盐水调整浓度为20～50μg/ml。

实验用小鼠为SPF级BALB/c小鼠，4～6周龄，雄性，体重18～22g，由山东大学实验动物中心提供，饲养条件按照SPF级动物标准执行。

尾静脉高压注射：先将所述小鼠置于高温环境，使尾静脉扩张；注射前用乙醚麻醉，观察小鼠反射情况；5秒内将1.4～2.0ml重组质粒pcDNA3-HBV1.1液体经尾静脉匀速注射入小鼠体内，小鼠置于25～28℃环境中观察。

成功经尾静脉高压注射重组质粒pcDNA3-HBV1.1后；经血清谷丙转氨酶(ALT)(见附图10)、乙肝表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)测定(见附图11)，实时定量PCR检测HBV DNA(见附图12)以及肝脏病理(见附图13)等实验，结果显示：尾静脉高压注射pcDNA3-HBV1.1后的小鼠血清ALT在8小时达到800u，24小时为350u；HBsAg、HBeAg第1天最高，主要表达HBsAg，可达1.5，以后逐渐下降，7天后消失；血清中检测到HBV DNA；肝脏组织切片显示病毒性肝炎病理改变。以上结果证实：小鼠急性乙型病毒肝炎动物模型建立成功。

小鼠Bax基因shRNA表达载体有效抑制HBV转基因小鼠急性肝炎模型中肝细胞Bax基因的表达实验：

经QIAGEN质粒大量提取试剂盒纯化重组质粒pmU6-Bax451或空载体pmU6，以生理盐水调整浓度为20～50μg/ml。

尾静脉高压注射：先将所述SPF级BALB/c小鼠置于高温环境，使尾静脉扩张；注射前用乙醚麻醉，观察小鼠反射情况；5秒内将1.4～2.0ml重组质粒pcDNA3-HBV1.1与重组质粒pmU6-Bax451或空载体pmU6液体的混合液经尾静脉匀速注射入小鼠体内。48h后，处死小鼠，Western Blot检测肝组织Bax基因的表达情况，血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平，肝组织TUNEL染色检测肝细胞凋亡情况。

Western Blot结果见附图14，光密度软件分析各片段光密度值，并计算Bax mRNA水平的相对表达强度(见附图15)，结果显示，pmU6-Bax451载体治疗组小鼠，肝组织Bax蛋白的表达水平显著低于对照组小鼠(P＜0.01)。血清ALT水平达92±8U/L(见附图16)，AST水平达127±14U/L(见附图17)，显著低于模型组小鼠(P＜0.01)。TUNEL染色结果显示，pmU6-Bax451载体治疗组小鼠肝细胞凋亡率为17.1±3.6％，显著低于模型组小鼠29±6.7％(见附图18)。

利用本发明所述的抑制人、小鼠Bax基因表达的siRNA及其针对Bax基因的shRNA表达载体进行实验的结果表明：

本发明所述的人Bax基因的shRNA表达载体可有效抑制人类组织细胞中Bax基因的表达，特别是HBV基因片段转染肝癌细胞中Bax基因mRNA水平和蛋白水平的表达，并且可以明显降低凋亡刺激信号所诱导的HBV基因片段转染肝癌细胞的凋亡水平。本发明所述的小鼠Bax基因shRNA表达载体可有效抑制小鼠组织细胞中Bax基因mRNA水平和蛋白水平的表达，明显减轻了急性乙型病毒性肝炎小鼠的肝脏炎症，具体表现在血清ALT、AST水平降低。通过机制研究发现，小鼠Bax基因shRNA表达载体治疗组肝细胞凋亡率明显低于模型组。这一结果表明，Bax基因在HBV感染后引起的肝细胞凋亡中起重要作用，Bax基因shRNA表达载体通过抑制肝细胞中Bax基因的表达对肝细胞起保护作用。

同时，本发明利用shRNA表达载体在体内进一步表达siRNA的方法，不仅避免了化学合成法、体外转录法等技术所存在的siRNA易降解，操作技术难度高等缺陷，而且可以成功实现siRNA在体内长期、持续表达的作用效果。此外，本发明通过尾静脉高压注射的方法，使Bax基因shRNA表达载体相对特异地在肝脏中表达，在最大程度上降低了对其它组织器官的影响。因此，Bax基因shRNA表达载体将在制备治疗乙型病毒性肝炎特别是急性重症乙型病毒性肝炎的药物中有很大的应用价值，具有极其诱人的开发应用前景。

附图说明

图1人Bax基因shRNA表达载体pBax382-Si的测序图谱。

图2人Bax基因shRNA表达载体pBax382-Si的物理图谱。

图3RT-PCR检测人Bax基因shRNA表达载体抑制肝癌细胞Bax mRNA的表达情况。

其中：1为未转染BEL7402-HBx细胞；2为pSilencer3.0转染组细胞；3为pBax382-Si转染组细胞。

图4经光密度软件分析得出的各组细胞Bax mRNA的相对表达强度。

图5Western Blot检测人Bax基因shRNA表达载体抑制肝癌细胞Bax蛋白的表达情况。

其中：1为未转染BEL7402-HBx细胞；2为pSilencer3.0转染组细胞；3为pBax382-Si转染组细胞。

图6经光密度软件分析得出的各组细胞Bax蛋白的相对表达强度。

图7TUNEL流式细胞术检测抑制Bax基因的表达对凋亡刺激信号诱导肝癌细胞凋亡的影响。

图8小鼠Bax基因shRNA表达载体pmU6-Bax451的测序图谱。

图9小鼠Bax基因shRNA表达载体pmU6-Bax451的物理图谱。

图10血清谷丙转氨酶(ALT)测定结果

图11ELISA检测HBV抗原(HBsAg、HBeAg)

图12实时定量PCR检测HBV DNA含量

图13肝脏组织切片HE染色观察病理变化

可见肝组织弥漫性淋巴细胞浸润，部分有中性粒细胞浸润；肝细胞呈气球样变，部分细胞有坏死表现

图14Western Blot检测小鼠Bax基因shRNA表达载体抑制小鼠肝组织Bax蛋白的表达情况。

其中：1为急性乙型肝炎模型组；2为pmU6-Bax451联合注射组；3为pmU6pro联合注射组。

图15经光密度软件分析得出的各组细胞Bax蛋白的相对表达强度。

其中：1为急性乙型肝炎模型组；2为pmU6-Bax451联合注射组；3为pmU6pro联合注射组。

图16小鼠Bax基因shRNA表达载体对血清ALT水平的影响

其中：1为对照组小鼠；2为急性乙型肝炎模型组；3为pmU6-Bax451联合注射组；4为pmU6pro联合注射组。

图17小鼠Bax基因shRNA表达载体对血清AST水平的影响

其中：1为对照组小鼠；2为急性乙型肝炎模型组；3为pmU6-Bax451联合注射组；4为pmU6pro联合注射组。

图18TUENL流式细胞术检测肝细胞凋亡结果

其中：1为对照组小鼠；2为急性乙型肝炎模型组；3为pmU6-Bax451联合注射组；4为pmU6pro联合注射组。

具体实施方式

实施例1：人Bax基因shRNA表达载体的构建

1)针对Bax基因小干扰RNA序列的设计：

根据小干扰RNA设计原则，设计了针对Bax基因的小干扰RNA序列。序列结构为：BamHI+Sense+Loop+Antisense+终止信号+HindIII，具体序列参见序列表(正义链为序列表中的SEQ ID №：3，反义链为序列表中的SEQ ID №：4)。

2)小干扰RNA载体的构建：

a.退火：取以上配制好的小干扰序列各1μL，将相应的正义链和反义链混合在同一Ep管中，加入退火缓冲液，使终体积达50μL。退火条件如下：

95℃ 4min→70℃ 10min→缓慢冷却至4℃

b.目的片段的磷酸化：取以上退火产物进行磷酸化修饰，反应体系如下：

退火产物          2μL

T4磷酸激酶        1μL

10×Buffer        1μL

10mM ATP          1μL

灭菌双蒸水        5μL

总体积         10μL

以上体系在37℃水浴中，反应30min。70℃，10min灭活磷酸激酶。

c.载体的线性化、去磷酸化和回收：pSilencer3.1-H1 neo经HindIII、BamHI双酶切(37℃，3h)后，进行去磷酸化修饰(37℃，1h)。反应体系如下：

双酶切体系：

pSilencer3.1-H1 neo      60μL

10×K Buffer             10μL

HindIII                  5μL

BamHI                    5μL

去离子双蒸水             20μL

总体积                   100μL

去磷酸化修饰：

酶切产物                 100μL

小牛肠碱性磷酸酶         2μL

10×Buffer               12μL

去离子双蒸水             6μL

总体积                   120μL

以上去磷酸化产物进行琼脂糖凝胶电泳(75V，1h)，并以试剂盒回收线性化载体片段，回收产物终体积为10μL。

d.目的片段与载体的连接：利用上述经磷酸化的目的基因片段和去磷酸化的载体片段，建立如下连接反应体系：

载体片段                 6μL

目的基因片段             10μL

10×Ligation Buffer      2μL

T4 DNA连接酶             2μL

总体积                   20μL

连接反应在12℃下进行，16～20h后，70℃水浴10min灭活连接酶，终止连接反应。

e.连接产物的转化：以大肠杆菌DH5α为宿主菌，利用CaCl₂法并将上述灭活连接酶的连接产物转化入处于感受态的宿主菌内，涂菌平皿于37℃孵箱内培养12～16h。

3)阳性重组载体的鉴定

DNA测序鉴定：重组子相应菌种送至上海博亚公司进行DNA自动测序，测序结果(见附图1)通过Blast软件与设计序列相比对。阳性重组子测序结果与所设计序列完全同源，命名为pBax382-Si(见附图2)。

实施例2：人Bax基因shRNA表达载体可有效抑制HBV基因片段转染肝癌细胞中Bax基因的表达。

利用QIAGEN质粒小提试剂盒分别提取高纯度的重组载体pBax382-Si和空载体pSilencer3.1-H1 neo。

脂质体转染：转染前一天，BEL7402-HBx单细胞悬液以1.5×10⁵个/孔的浓度接种于24孔培养板上，每孔0.5mL培养液，37℃、5％CO2培养过夜，使细胞生长至对数增殖期，达85％～90％汇片。质粒的转染严格按照LipofectmineTM 2000说明书进行(具体步骤见第一节)。每种质粒设2个复孔，同时设未转化对照组。37℃、5％CO2培养6～8h，更换为含10％胎牛血清的RPMI 1640完全培养基中继续培养72h(期间每隔24h更换一次培养液)。半定量RT-PCR(引物序列、退火温度见表2)、荧光定量PCR、Western Blot检测Bax基因的表达变化。

表2 Bax基因PCR引物序列及退火温度

    引物序列  产物  长度退火温度  Bax  F：5’-TGGAGCTGCAGAGGATGATTG-3’    R：5’-CCCAGTTGAAGTTGCCGTC-3’  101bp    60℃

荧光定量PCR反应的反应体系和反应条件如下：

a.50μL PCR反应体系：

cDNA               5μL

10×Buffer         25μL

上游引物(10μM)    2μL

下游引物(10μM)    2μL

灭菌双蒸水         16μL

总体积             50μL

b.PCR反应条件：

结果显示，该shRNA表达载体可有效抑制Bax基因mRNA水平(见附图3和附图4，表1)和蛋白水平的表达(见附图5和附图6)。

实施例3：人Bax基因shRNA表达载体有效抑制凋亡刺激信号所诱导的HBV基因片段转染肝癌细胞凋亡。

脂质体介导的方式将高纯度的质粒pBax382-Si，pSilencer3.1-H1 neo转染BEL7402-HBx细胞，72h后，弃去原培养液，加入10ng/mL TRAIL蛋白，37℃、5％CO₂培养24h。此外，以10ng/mL TRAIL蛋白作用BEL7402细胞，用于标定Bax小干扰RNA逆转凋亡效应的程度。收集各组细胞(包括悬浮细胞)，采用TUNEL末端标记法结合流式细胞术检测细胞凋亡率。

结果显示(见附图7)，pBax382-Si转染组细胞凋亡率为17.8％±4.5％，显著低于BEL7402-HBx细胞(43％±5.4％)(P＜0.05)，接近BEL7402细胞的凋亡率(12.6％4±2.7％)(P＞0.05)，而pSilencer3.1-H1 neo转染组细胞(43％±2.4％)与BEL7402-HBx细胞无显著差异(P＞0.05)。

实施例4：小鼠Bax基因shRNA表达载体的构建。

针对Bax基因小干扰RNA序列的设计：

根据小干扰RNA设计原则，设计了针对Bax基因的小干扰RNA序列。序列结构为：BbsI+Sense+Loop+Antisense+终止信号+XbaI，具体序列参见序列表(正义链为序列表中的SEQ ID №：7，反义链为序列表中的SEQ ID №：8)

2)小干扰RNA载体的构建：

合成上述设计的小干扰RNA序列，构建小鼠Bax基因shRNA表达载体，具体步骤同前(人Bax基因shRNA表达载体的构建)，重组子相应菌种送至上海博亚公司进行DNA自动测序(见附图8)，测序结果通过Blast软件与设计序列相比对，命名为pmU6-Bax451(见附图9)。

实施例5：利用尾静脉高压注射法建立急性小鼠肝炎模型及其鉴定：

分别设立生理盐水对照组、空载体pcDNA3注射组、重组质粒pcDNA3-HBV1.1(即模型组)。每组小鼠为15只，实验均重复3次。

(1)尾静脉高压注射：先将所述小鼠置于高温环境，使尾静脉扩张；注射前用乙醚麻醉，观察小鼠反射情况；5秒内将1.4～2.0ml生理盐水、空载体pcDNA3或重组质粒pcDNA3-HBV1.1液体经尾静脉匀速注射入小鼠体内，小鼠置于25～28℃环境中观察。

(2)经内眦静脉窦取血：分别于模型建立的第1、4、7、10天将小鼠用乙醚麻醉，使用1ml注射器由内眦静脉窦取血0.2～0.5ml，常规离心，分离血清，-20℃保存，用于各项指标的检测。

(3)处死小鼠：分别于模型建立的第1、4、7、10天将小鼠摘眼球取血、颈椎脱臼处死。分别取上述各组小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、心脏、肺脏及胸腺，-80℃保存，备用。

(4)血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)测定：

利用丙氨酸氨基转移酶/谷草转氨酶试剂盒(ALT/AST，赖氏法，潍坊3V生物工程有限公司)建立标准曲线并进行样品测定。样品OD值超过标准曲线范围则将样品稀释后再进行测定。

ALT检测结果显示(见附图10)：模型组的ALT于8小时达到最高(820±138u)，以后逐渐降低，10天后降至正常范围。生理盐水对照组和空载体对照组ALT无显著升高。

(5)ELISA检测HBV抗原、抗体表达水平：

利用HBsAg、HBeAg及相应抗体的ELISA试剂盒进行检测，严格按照说明书操作，以酶标仪于450nm处测OD值。

ELISA结果显示(见附图11)：模型组小鼠血清HBsAg、HBeAg第1天最高，HBsAg可达1.5；以后逐渐下降，7天后消失。

(6)实时定量PCR检测HBV DNA含量：

对照组组及模型组小鼠血清标本，利用乙型肝炎病毒(HBV)荧光定量PCR试剂盒(上海申友生物技术有限责任公司)检测HBV DNA。

首先标本裂解(直接裂解法)：取20μl裂解缓冲液加入0.5ml离心管后，再分别加入20μl血清标本、阴性对照、临界对照、阳性对照，混匀。沸水浴10分钟，14000rpm离心10分钟，取上清2μl做PCR反应。

设定如下程序：

  保温40次循环  保温  37℃ 2分钟  94℃ 3分钟①94℃ 10秒②55℃ 30秒③72℃ 40秒  25℃恒温

55℃时收集荧光信号，以BIO-RAD iCycler检测荧光(美国伯乐公司)。每次试验均做标准曲线，将曲线相关系数控制在0.99以上。

实时定量PCR检测结果显示(见附图12)：模型组小鼠于第1天HBV DNA的拷贝数高达2.67×10⁵，第4天明显下降至3.85×10³，显著高于HBV转基因小鼠复制水平(P＜0.05)。

(7)肝脏HE染色观察病理变化：

各组小鼠肝脏组织进行冰冻切片，常规HE染色，显微镜下观察：模型组可见肝组织弥漫性淋巴细胞浸润，部分有中性粒细胞浸润，肝细胞呈气球样变，部分细胞有坏死表现；对照组小鼠未见明显病理变化(见附图13)。

实施例6：小鼠Bax基因shRNA表达载体可有效抑制急性肝炎模型肝组织中Bax基因的表达。

分别设立BalB/C小鼠对照组、急性乙型肝炎模型组、小鼠Bax基因shRNA表达载体治疗组、空白shRNA表达载体对照组。每组小鼠数为15只，实验均重复三次，具体实验方法及结果详述如下：

将SPF级BALB/c小鼠置于高温环境，使尾静脉扩张；注射前用乙醚麻醉，观察小鼠反射情况；5秒内将1.4～2.0ml重组质粒pcDNA3-HBV1.1与重组质粒pmU6-Bax451或空载体pmU6液体的混合液经尾静脉匀速注射入小鼠体内。

48h后，处死小鼠，Western Blot检测肝组织Bax基因的表达情况。

Western Blot结果见附图14，光密度软件分析各片段光密度值，并计算Bax mRNA水平的相对表达强度(见附图15)，结果显示，pmU6-Bax451治疗组小鼠，肝组织Bax蛋白的表达水平显著低于对照组小鼠(P＜0.01)。

实施例7：小鼠Bax基因shRNA表达载体可有效降低小鼠急性肝炎模型中肝细胞的凋亡，减轻肝细胞损伤，达到抗炎保肝作用：

将实施例6中各组小鼠处死后，检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平，肝组织TUNEL原位染色检测肝细胞凋亡情况。

ALT、AST检测结果显示(见附图16和附图17)：小鼠Bax基因shRNA表达载体注射组乙型肝炎模型小鼠，血清ALT水平达92±8U/L，AST水平达127±14U/L，显著低于模型组小鼠(P＜0.01)。

TUNEL荧光染色原位检测肝组织细胞凋亡情况，流式细胞术检测肝细胞凋亡率：

利用TUNEL标记试剂盒，分别将各组小鼠肝组织石蜡包埋切片和新鲜肝细胞进行TUNEL染色，荧光显微镜观察肝组织细胞凋亡情况，流式细胞仪测定肝细胞凋亡率。

凋亡检测结果显示(见附图18)：pmU6-Bax451联合HBV特异性脾细胞注射组小鼠肝细胞凋亡率为17.1±3.6％，显著低于模型组小鼠29±6.7％。

实验数据统计学处理：

上述实验数据以平均值±标准误差表示，经t检验：P＜0.05表示有明显差异。

通过上述实验及其结果，可以得出如下结论：

针对Bax基因的特异性shRNA表达载体可有效抑制Bax基因的表达，为通过降低乙肝的肝细胞凋亡、减轻肝细胞损伤，改善预后，提供了一条应用前景诱人的治疗急性重症乙型病毒性肝炎的途径，为新型药物的开发提供了依据。

                                 序列表

<110>山东大学

<120>抑制Bax基因表达的siRNA和表达载体及其作为乙型病毒性肝炎治疗药物的应用

<141>2006-12-5

<160>8

<210>1

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<222>(1)…(19)

<223>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA

<400>1

ggugccggaa cugaucaga                                               19

<210>2

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<222>(1)…(19)

<223>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA

<400>2

ucugaucagu uccggcacc                                               19

<210>3

<211>63

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<222>(1)…(63)

<223>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA

<400>3

gatccggtgc cggaactgat cagattcaag agatctgatc agttccggca ccttttttgg  60

aaa                                                                63

<210>4

<211>63

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<222>(1)…(63)

<223>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA

<400>4

agcttttcca aaaaaggtgc cggaactgat cagatctctt gaatctgatc agttccggca  60

ccg                                                                63

<210>5

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<222>(1)…(19)

<223>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA

<400>5

gugcccgagc ugaucagaa                                               19

<210>6

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

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<223>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA

<400>6

uucugaucag cucgggcac                                               19

<210>7

<211>49

<212>RNA

<213>人工序列

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<223>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA

<400>7

tttgtgcccg agctgatcag aaacattctg atcagctcgg gcacttttt              49

<210>8

<211>49

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<222>(1)…(49)

<223>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA

<400>8

ctagaaaaag tgcccgagct gatcagaatg tttctgatca gctcgggca              49