一种利用基因重组技术获得粗糙型布氏杆菌及其疫苗的生产方法

摘要

本发明涉及动物布氏杆菌或称布鲁氏菌及其活疫苗的生产方法，制备该活疫苗的生产菌株是采用构建含氯霉素抗性基因的穿梭质粒，破坏与布氏杆菌S2菌株与S型形成相关的wboA基因，同时标记重组菌的基因的技术，成功构建了含有氯霉素抗性基因标记的重组布氏杆菌rS2株，以此作为生产菌株，按布氏杆菌活疫苗(S2株)生产方法生产出布氏杆菌活疫苗。此疫苗的使用将改变布氏杆菌疫苗株免疫动物与野毒株感染动物难以区分的现状，并将为布氏杆菌病的防控提供了一种良好的疫苗。

说明书

所属技术领域  本发明涉及牛、羊和猪一种细菌性传染病的预防用活疫苗，属兽用生物制品领域。

技术背景

布氏杆菌病(布病)是由布氏杆菌或称布鲁氏菌(Brucella)引起的以流产和发热为特征的人兽共患病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。本病不但对动物的繁殖和生产性能具有严重危害，更重要的是，人感染布氏杆菌后，往往难以治愈，从而造成严重的公共卫生问题。因此在布氏杆菌流行的国家，消除布病一直是公共卫生计划中最重要的目标之一。目前全世界范围内消除该病的主要方法是扑杀与免疫相结合，对布病发生相对比较严重的中国，由于扑杀的成本高，疫苗预防成为本病主要控制手段。

布氏杆菌疫苗免疫带来的主要问题是无法区分疫苗免疫和自然感染的动物，这在很大程度上限制了布氏杆菌疫苗的使用和推广，也给布病的有效防治和清除带来了一定的难度。

布氏杆菌存在光滑型(S)和粗糙型(R)两类不同表型的菌株，在凝集类抗体水平上无交叉反应，因此用粗糙型布氏杆菌疫苗免疫的动物，其血清只与粗糙型抗原发生凝集反应，而与光滑型血清不反应，以此可以区分疫苗株和野毒株。最早使用过的粗糙型布氏杆菌疫苗是用45/20菌株制备的，但该菌株极不稳定，经常会出现从R型到S型的变异，造成毒力返强，因而该疫苗已基本不再使用。90年代美国科学家通过人工诱变的方法获得了粗糙型布氏杆菌RB51菌株，该菌株具有良好的免疫力，已在美国和拉美的多个国家广泛使用。但目前该菌株在基因水平与原始菌株之间的的区别尚为完全弄清楚。

已有的研究证实布氏杆菌细胞壁脂多糖(LPS)中的O链组成决定了其光滑型或粗糙型的表型，O链的某些成分缺失，会导致菌株由光滑型变成粗糙型。现已发现多个与布氏杆菌光滑型表型相关的基因，包括gmd、per、pgm、wbkA、lpx、wa、wz和wboA基因。

本发明的目的是通过基因同源重组技术，利用插入的报告基因破坏布氏杆菌光滑型表型相关基因，获得粗糙型布氏杆菌。本技术可以大大提高获得粗糙型布氏杆菌疫苗株的可能性。并且，通过对重组菌株标记基因的检测，可以区分重组菌株和非重组菌株，也可以利用重组菌表型的改变区分原始菌种和重组菌株。

发明内容

1破坏光滑型相关基因的质粒构建及其转化  用氯霉素抗性基因构建穿梭质粒，通过电转化技术将穿梭质粒导入受体菌，促使穿梭质粒与受体菌靶基因重组，从而替代或破坏光滑型相关基因。

2重组菌的筛选与鉴定  利用重组菌具有氯霉素抗性的特点，通过含氯霉素的培养基筛选重组菌。对获得的重组菌布氏杆菌进行形态学、血清学及基因检测。并对重组菌安全性、免疫保护性进行鉴定。

3疫苗制备  对安全性和免疫保护性良好的重组菌，按布氏杆菌S2株作为生产菌株生产布氏杆菌活疫苗的常规方法，接种于适宜培养基，收获培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成活疫苗。用于预防布氏杆菌病。

附图说明

附图1布氏杆菌wboA基因上游同源臂引物。

附图2布氏杆菌wboA基因下游同源臂引物。

附图3构建用于同源重组的穿梭质粒设计的引物

发明的具体实施方式

本发明所涉及基因为与光滑型表型相关的布氏杆菌wboA基因。本发明所涉及基因重组技术包括：用氯霉素抗性基因构建穿梭质粒，并用此质粒破坏与光滑型表型相关的布氏杆菌wboA基因。

本发明用氯霉素抗性基因破坏了光滑型布氏杆菌(猪种)S2株的wboA基因，最终筛选获得了粗糙型的rS2株重组布氏杆菌。

1重组布氏杆菌的构建与重组菌的筛选

本发明采用构建含氯霉素抗性基因的穿梭质粒，破坏与布氏杆菌S型形成相关的wboA基因，同时标记重组菌的基因的技术，成功构建了含有氯霉素抗性基因标记的重组布氏杆菌rS2株(本菌株已于2006年9月5日送交中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为：CGMCC No.1794)。该菌株采用同源重组技术，以氯霉素抗性基因破坏S2株中的wboA基因，获得的重组菌不仅能够抵抗氯霉素，而且使原始菌株由光滑型转变为了粗糙型。重组菌在培养基上传50代后，遗传性状仍很稳定。动物试验表明重组菌比原始毒株S2毒力更低，安全性更高，其免疫保护性和S2相同。

具体操作方法如下：

1.1 PCR扩增wboA基因上、下游同源臂。

引物设计：

上游同源臂引物：

F_WboA1 5’-GAAGAGCTCGTAATGGCAAAGACAGT-3’；

R_WboA1 5’-TACTGGATCCGTGTCTACTCTTAATGC-3’.

下游同源臂引物：

F_WboA2 5’-GAAGTCGACGCAAGGTCTGTGAAGGT-3’；

R_WboA2 5’-ATCAGCATGCATTCCATTATCATCTA-3’.

用Promega公司的细菌基因组提取试剂盒(Lot：187282)，参照说明书提取布氏杆菌S2基因组DNA，并以提取的基因组DNA为模板扩增wboA上、下游的基因片断。PCR反应程序为：95℃变性5min；95℃ 50s-54℃ 50s-72℃ 1min，进行30个循环，72℃延伸10min。

1.2构建用于同源重组的穿梭质粒

1.2.1设计引物F1cm^r：5’-CTGGGATCCCTGGTGTCCCTGTTGATA-3’；R1cm^r：5’-CTGGTCGACCTGCCATTCATCCGCTTA-3’，以pACYC184质粒载体为模板，按上述PCR反应程序，扩增完整的氯霉素抗性基因(Cm^r)，并通过BamH I酶和Sal I酶将Cm^r克隆进pUC18载体中，获得重组质粒pUC-Cm^r。

1.2.2将wboA上游基因片断经SacI和BamH I消化，并与同酶消化处理的pUC-Cm^r载体连接，筛选获得质粒pUC-Cm^r-wboA(L)。将WboA下游基因片断经SalI和Sph I酶切后，与同酶消化处理的pUC-Cm^r-wboA(L)质粒进行连接，筛选获得重组质粒pUC-Cm^r-wboA((LR)。

1.3制备布氏杆菌S2的电转化感受态细菌

将单个CFU的S2菌接种于100ml TSB培养基中培养至对数期的中期，放冰水中冷却。12000r/min离心10min，弃去培养基，再分别用100ml、50ml、10m、5m、2ml灭菌水各离心洗涤一次。最后将获得的菌体重悬于1ml 10％的甘油水溶液中，此即为待用的感受态细菌。

1.4转化和筛选

1.4.1转化  将1μg pUC-Cm^r-wboA((LR)质粒加入到50μl S2感受态细菌中。混匀后转移到电极杯中。电击电压：1.8KV；电击时间：3毫秒。电击完成后，加入1ml TSB培养基在37℃摇振培养4h后，将全部菌落涂布到含20μg/ml氯霉素的TSA固体培养基中。

1.4.2筛选  细菌涂布到培养基中3天后，开始出现少量细小菌落，经鉴定符合粗糙型布氏杆菌的特点。以提取的重组菌基因组DNA为模板，Fcm^r和Rcmr为引物，用PCR扩增插入片断，并进行克隆和序列测定，结果证实氯霉素抗性基因已经整合到S2菌株基因组中，获得的重组菌命名为rS2。

2布氏杆菌rS2菌株的特性检查

2.1形态和生化特性检查  革兰氏染色为阴性；柯氏染色成红色。菌体为球杆菌，单个散在，无鞭毛，不形成芽孢和荚膜，大小约0.6～2.5μm。生化试验为硫化氢试验阳性。

2.2培养特性检查  在pH 6.4～6.8的胰蛋白眎琼脂或其他适宜培养基上生长良好。在马丁肉汤等液体培养基中生长，静止培养易出现沉淀，振摇后液体浑浊、不透明。

2.3粗糙型特性检  查热凝集试验、吖啶黄凝集试验、菌落结晶紫染色试验结果符合粗糙型布氏杆菌的特点，即热凝集试验阳性，吖啶黄凝集试验阳性，能被结晶紫染色。

2.4血清学特性检查  将S2和rS2菌株培养物制成抗原注射小鼠2次，间隔1个月，第二次接种1个月后采血分离血清。S2的抗血清与M5、M28、A387、A19等光滑型布氏杆菌凝集反应为阳性；与rS2和M111株等粗糙型布氏杆菌凝集反应为阴性；而rS2抗血清与S2、M5、M28、A387、A19等光滑性布氏杆菌凝集反应为阴性，与粗糙型布氏杆菌M111株凝集反应为阳性。表明rS2菌株免疫小鼠后，其血清不含有对光滑型布氏杆菌的凝集类抗体。

以上试验说明rS2菌株免疫动物后，所产生的血清抗体通过凝集试验能够与光滑型布氏杆菌感染或免疫后所产生的血清抗体相区别，即rS2免疫动物后不会对布氏杆菌病血清学检疫产生干扰。

2.5基因特性检查

2.5.1 wboA基因检  测根据GeneBank中收录的wboA基因[收录号：AY065979]，设计用于扩增wboA基因的引物(附图1、2)，以重组菌基因组DNA为模板，扩增wboA基因，结果为阴性；原始菌S2株对照为wboA阳性；

2.5.2氯霉素抗性基因检测  根据GeneBank中收录的氯霉素抗性基因(chloramphenicolresistance gene，Cm^r)[收录号：X06403]，设计用于扩增Cm^r基因的引物(附图3、4)，以重组菌基因组DNA为模板，扩增Cm^r基因，结果为阳性；原始菌S2对照为Cm^r阴性。

2.6毒力检查  用生理盐水将固体培养基上培养48h的培养物洗下，稀释成每毫升含10亿CFU菌的悬液，皮下注射体重350～400g的豚鼠5只，每只1ml。经14～15日后剖杀，取脾脏，混合称重，制成乳剂，接种胰眎琼脂或其他适宜的培养基平板，根据其生长的菌落数计算豚鼠脾脏的含菌量，结果每个脾脏含菌不超过20万CFU。

2.7对小白鼠安全性试验  用生理盐水将固体培养基上培养48h的rS2和S2(作为对照)培养物洗下，各皮下注射体重18～20g的小白鼠4组，每组6只，对照组注射生理盐水，其余3组注射剂量分别为1000亿CFU、100亿CFU、10亿CFU rS2或S2活菌。注射后7天内观察动物存活情况，结果见下表1。

                          表1.布氏杆菌S2和rS2的安全性试验结果

  菌株    剂量(亿CFU/只)对照100010010  S2接种18h内死4只，24h全部死亡。2只小鼠在接种48h内明显精神不振，72h后恢复健康。健康存活健康存活  rS2接种24h，无死亡；48h死一只；3只小鼠在接种48h内明显精神不振；72h后恢复健康。健康存活。健康存活

以小鼠为动物模型进行的上述试验结果表明，重组菌rS2比原始株S2具有更高的安全性。免疫原性  以小白鼠和豚鼠为模型动物，检测rS2免疫后强毒布氏杆菌攻毒的保护力，并与S2相比较，确定rS2的免疫原性。

2.8.1小白鼠攻毒保护试验  用生理盐水将固体培养基上培养48h的rS2和S2(作为对照)培养物洗下，各皮下注射体重18～20g的小白鼠5组，每组6只，对照组注射生理盐水，其余4组注射剂量分别为1000亿CFU、10亿CFU、1亿CFU、100万CFU rS2或S2活菌。30天后用强毒布氏杆菌M28株菌接种小白鼠，观察M28株菌在小白鼠体内存活情况。结果见表2。

           表2 rS2、S2对小白鼠免疫力比较试验结果

                                     (每个脾含M28株菌量：CFU)

  组别    免疫量(CFU)  未免疫对  照组 1000亿 10亿  1000万  10万  S2免疫保护力 0  3.3×10 1.4×10³  1.3×10⁵  rS2免疫保护力 0 0  4.0×10 2.9×10³  1.3×10⁵

结果说明，一定量(10亿CFU活菌)的重组菌rS2和S2免疫小白鼠都能抵抗强毒布氏杆菌的攻击，并且二者的免疫保护力相当。

2.8.2豚鼠攻毒保护试验  用生理盐水将固体培养基上培养48h的rS2和S2(作为对照)培养物洗下，稀释成每毫升含10亿CFU菌的悬液，皮下注射体重350～400g的豚鼠5只，每只1ml。经30日后，用2～5个最小感染量的强毒布氏杆菌M28菌株接种攻毒，攻毒后15～20天剖杀，取脾、肝、肺、额下淋巴结、鼠蹊淋巴结、肠系膜淋巴结作布氏杆菌分离培养，结果见表3。

                                   表3.S2和rS2对豚鼠的免疫力比较试验结果

 菌株  剂量(亿CFU/只)对照  脾  肝  肺  额下淋巴结   鼠蹊淋巴结   肠系膜淋巴结 S2  -5/5  -5/5  -5/5  -5/5    -5/5   -5/5+5/5 rS2  -5/5  -5/5  -5/5  -5/5    -5/5   -5/5

注：“-”表示未分离到攻毒菌M28株菌，“+”表示分离到攻毒菌M28株菌。

结果显示，重组菌rS2对豚鼠的免疫保护力与S2菌株相当。

用小白鼠和豚鼠进行的上述试验结果表明，rS2的免疫原性与S2菌株相当，即采用本专利的基因重组技术获得的重组菌，其免疫原性不低于S2菌株。

2.9遗传稳定性  rS2在胰眎琼脂培养基上传50代，其形态和生化特性、培养特性、血清学特性、粗糙型特性、基因特性、毒力、免疫原性没有改变。

3疫苗制备与质量标准

3.1疫苗制备  用马丁肉汤或其他适宜培养基作菌液培养，灭菌后按培养基量的1％～2％接入布氏杆菌rS2株种子菌液，37℃培养48～72h，加入兽用生物制品常用的蔗糖明胶稳定剂，充分混匀、分装于疫苗瓶中后立即进行冷冻真空干燥，即成为布氏杆菌rS2疫苗。冷冻真空干燥后的疫苗应按质量标准立即进行成品检验。

3.2质量标准

3.2.1疫苗应为疏松团快，加入稀释液后3min内溶解；

3.2.2疫苗应纯粹无其他细菌；

3.2.3用含10亿CFU活菌的疫苗接种18～20g的昆明系小白鼠，7天内应全部健活；

3.2.4对疫苗进行活菌计数，每头份活菌数应不少于100亿CFU。

本发明的优点：

该重组菌株通过在布氏杆菌S2株菌基因组中稳定地整合进标记基因(氯霉素抗性基因)，并同时破坏了光滑型布氏杆菌细胞壁LPS结构中O链形成条件，使重组菌由光滑型转变为粗糙型，使菌株的毒力进一步降低，但仍保留了良好的免疫效果。该重组菌是带有双重标记的新型布氏杆菌疫苗菌株，以此菌株生产疫苗将改变布氏杆菌疫苗免疫动物与野毒株感染动物难以区分的现状，并将为布氏杆菌病的防控提供了一种良好的疫苗。