预测磺脲类药物疗效的试剂盒

摘要

本发明提供了一种预测磺脲类药物疗效的试剂盒，含有下述组分：(1)红细胞裂解液；(2)白细胞裂解液；(3)蛋白沉淀液；(4)核酸储存液；(5)PCR反应混合液(含MgCl2、dNTP、PCR扩增引物和内标)；(6)DNA聚合酶；(7)阳性质控；(8)阴性对照；(9)内切酶缓冲体系；(10)限制性内切酶；(11)PCR用水；(12)10×电泳上样缓冲液：0.25％溴酚兰，40％(w/v)蔗糖水溶液。本发明通过提取生物样品中的基因组DNA，经过聚合酶链式反应－限制性酶切片段多态性(PCR－RFLP)分析方法，检测个体生物样品中磺脲类受体基因的多态性情况，预测磺脲类药物的疗效。

说明书

技术领域

本发明涉及一种预测磺脲类药物疗效的试剂盒，属于医药生物技术领域。

背景技术

磺脲类抗糖尿病药物是一种促胰岛素分泌剂，可以降低空腹和餐后血糖。对于大多数新诊断的2型糖尿病患者，磺脲类抗糖尿病药物可以使空腹血糖下降50～80mg/dl，使糖化血红蛋白(HbAlc)下降1.0％～2.5％。因为2型糖尿病患者的β细胞功能随时间而衰减，磺脲类抗糖尿病药物对临床上新诊断的糖尿病患者血糖降低十分有效。磺脲类抗糖尿病药物与K_ATP通道的亚单位——高亲和性磺脲类药物受体(SUR1)结合来促进内源性胰岛素分泌。磺脲类药物与SUR1结合后关闭K⁺通道，使细胞膜上的部分区域去极化引起电压依赖性L-型Ca²⁺通道开放，Ca²⁺进入细胞内，胞浆中Ca²⁺浓度升高，从而刺激胰岛素分泌。还可以通过胰岛外的作用，增强胰岛素作用于靶器官(肝、肌肉、脂肪细胞)。临床上广泛应用的磺脲类抗糖尿病药物包括甲苯磺丁脲(Tolbutamide)、氯磺丙脲(Chlorpropamide)、格列本脲(Glibenclamide)、格列波脲(Glibomuride)、格列环脲(Glycyclamide)、格列己脲(Glyhexamide)、格列沙脲(Glisamuride)、格列生脲(Glisentide)、格列索脲(Glisolamide)、格列辛脲(Glyoctamide)、格列齐特(Gliclazide)、格列吡嗪(Glipizide)、格列吡嗪缓释片(Glucotrol XL)、格列喹酮(Gliquidone)和格列美脲(Glimepiride)。

磺脲类药物对于适用人群(非超重或非肥胖2型糖尿病患者)的总有效率为50～80％，有部分适用人群存在磺脲类药物原发性失效和继发性失效。常见的副作用为低血糖、抽搐，偶见胃肠道反应、皮疹、头痛。遗传背景不仅可能影响疾病的发生，而且影响药物疗效的个体差异。随着药物遗传学研究的不断深入和发展，在未来糖尿病的药物治疗中，将可能利用遗传学筛查方法，实现因人而异的个体化临床用药目标，有效避免不合理用药、错误用药乃至滥用药物倾向，减少用于治疗药物不良反应的费用，避免无效用药造成的浪费。

药物治疗的有效性和安全性极其重要，很多人在有效性方面属于无效用药，或者疗效较差；而在用药安全性方面，会出现各种不良反应、毒副作用甚至导致死亡。除去药物本身的原因以及患者的性别、年龄、其他疾病相互作用、妊娠、饮食状况和生活环境等，遗传因素在个体化医疗、特别是个体化用药方面起着极其重要的作用。临床上用于预测药物疗效的方法仅仅凭借医生的临床经验，严格遵守治疗指南，根据患者常规的临床检查，经验性地选择一种药物治疗，治疗一段时期之后，根据病情变化和相应的检查判断疗效，如果提示疗效不佳或副作用较大时才会考虑调整药物治疗，即改变药物剂量或者联合或更换其它药物治疗。这种预测方法具有明显的滞后性及盲目性，并且不能真正预测某一药物的疗效，更不能给医生选择药物提供准确的个体化信息。因此，基于目前临床药物疗效的预测方法，医生在用药时仍不能根据患者个体差异进行药物及其剂量的选择以及药物的配伍，不能迅速有效地控制或者治疗疾病并且降低或避免毒副作用的发生，而且不同程度地增加患者的痛苦和经济负担。

药物疗效和副作用的个体差异与遗传因素有关。药物遗传多态性表现为药物代谢酶的多态性、药物受体的多态性和药物靶标的多态性等。这些多态性的存在可能导致许多药物治疗中药效和不良反应的个体差异【Science，2000；287：1977-1978】【J Clin Invest，1994；94：1872-1882】。

药物基因组学是基于基因多态性的DNA检测手段，如对一些疾病相关基因的单核苷酸多态性(SNP)检测，或对特定药物具有敏感性或抵抗性的患病人群进行SNP检测，能够预测患者将对某一特定的药物产生怎样的反应(疗效或副作用方面等)，从而解决药物治疗的安全和有效两个问题，进而优选出最佳的治疗方法，指导医生为患者拟定个体化的给药方案；另外，还有助于减少临床用药不当，提高疗效，降低毒副作用，降低医疗费用，具有极高的社会效益和卫生经济学意义。

SNP是指不同个体间在基因水平上的单核苷酸变异，平均每1000对碱基出现一个SNP，两个无关个体间大约有300万个SNP。SNP在个体化用药上可谓是举足轻重。影响药物有效性的主要因素包括药物前体因代谢而激活，药物与靶细胞的结合能力，药物与药靶的结合和活性，活性药物被代谢、降解和排出；而安全性则取决于药物在体内的代谢、降解和排出环节以及药物在体内的非特异性结合和活性。不同个体在其中每一环节SNP的不同，最终都可能会造成对同一药物反应的差异，有时由于这种个体间遗传学上的差别，同一药物在不同个体内的效果和毒副作用的差异可以达到300倍之多。

近年来关于糖尿病的候选基因主要集中于药物代谢酶基因、与药物作用受体有关的基因、与β细胞功能相关的基因、与胰岛素抵抗或胰岛素敏感性相关的基因。甲苯磺丁脲为第一代磺脲类药物，在体内羟化过程是由细胞色素P450 2C9(CYP2C9)催化进行。人群研究发现存在甲苯磺丁脲的慢代谢者，大约是500∶1。CYP2C9有两个低活性的氨基酸变异Arg144Cys(CYP2C9*2)和Ile359Leu(CYP2C9*3)。研究发现慢代谢者是携有CYP2C9*3的纯合子或杂合子。重组酵母表达系统研究发现这种变异的基因型和其他基因型对甲苯磺丁脲的羟化相比有最高的Km和最低的Vmac。*3/*3基因型携带者的口服清除率低于*1/*1的一半，*3/*3基因型携带者胰岛素分泌高于其他基因型携带者【Sullivan-Klose TH，1996；Inoue K，1997；Yamazaki H，1998；Kidd RS，1999；Kirchheiner J，2002；Niemi M，2002】。

Hansen T【Hansen，T.et al.Diabetes 1998；47，598-605】等人对整个SUR1基因进行了研究，研究包括SUR1的39个外显子以及内含子和外显子交界处，研究结果发现两个错义突变，5个无义突变以及4个内含子的突变。但是并没有发现新的与表型相关的突变标记。他们在基因型对的联合研究中发现，双杂合子exon 18C/T和16-3c/t腹腔注射甲苯磺丁脲后血清C-肽和胰岛素的反应性显著减少。这项研究提示这样的基因变异可能使得磺脲类药物治疗效果不佳。

由于存在药物反应的个体差异，医生选药时无法量体裁衣地进行药物选择和药物配伍，不能提高药物疗效并且降低毒副作用的发生，由此可能延误治疗时机，造成患者经济损失。因此迫切需要医生特别在选择降糖药时能够根据患者对特定的药物产生的反应选出最佳的治疗方法，指导医生为患者拟定个体化的给药方案。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种从分子水平辅助预测磺脲类药物疗效的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种预测磺脲类药物疗效的试剂盒，由以下组分组成：

(1)红细胞裂解液：NH₄Cl，KHCO₃，EDTA；

(2)白细胞裂解液：蛋白酶K、RNase A、NaCl、Tris、EDTA、SDS；

(3)蛋白沉淀液：7.5M乙酸胺(pH7.4)

(4)核酸储存液：1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl，pH8.0)；

(5)2×PCR反应混合液：1.0ml[100mM Tris-HCl，100mM KCl，pH8.3(20℃)]；5.0uM MgCl2；各0.4mM dATP，dCTP，dGTP，dTTP，无菌双蒸水配制，pH7.0；磺脲类受体基因的多态性位点基因型检测引物；内标；

(6)Taq DNA聚合酶(5U/ul)：保存缓冲液：20mM Tris-HCl(pH8.0)，100mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5％NP40，0.5％(v/v)Tween 20，50％甘油；

(7)阳性质控：含有磺脲类受体基因的多态性位点杂合基因型个体全血标本，或者含有磺脲类受体基因的多态性位点杂合基因型的质粒；

(8)阴性对照：经DNAase I处理的双蒸水；

(9)内切酶缓冲体系(10×)；

(10)限制性内切酶；

(11)PCR用水；

(12)10×电泳上样缓冲液：0.25％溴酚兰，40％(w/v)蔗糖水溶液。

本试剂盒还可以进一步含有检测磺脲类受体基因(SUR1)的多态性位点基因型的特异性荧光探针序列。

所述磺脲类受体基因的多态性基因型至少包含选自SUR1基因的Ser1369Ala(rs757110)、C/T(rs2074312)和C/T(rs1799854)多态性位点。

所述的磺脲类受体基因的多态性基因型还可以包含选自T/C(rs1319447)、A/G(rs2237984)和A/G(rs2237981)中的多态性位点，还可以进一步包含选自与上述多态性基因型位点存在连锁不平衡的多态性位点，以及其他预测磺脲类药物作用效果的基因多态性位点包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。

所述的磺脲类药物选自格列本脲(Glibenclamide)、格列波脲(Glibornuride)、格列环脲(Glycyclamide)、格列己脲(Glyhexamide)、格列沙脲(Glisamuride)、格列生脲(Glisentide)、格列索脲(Glisolamide)、格列辛脲(Glyoctamide)、格列齐特(Gliclazide)、格列吡嗪(Glipizide)、格列喹酮(Gliquidone)和格列美脲(Glimepiride)。

所述预测是指：

(1)所述的磺脲类受体基因的多态性位点基因型为Ala1369Ala(rs757110)纯合突变型时，预测磺脲类药物的作用效果强；所述的磺脲类受体基因的多态性位点基因型为Ser1369Ser(rs757110)纯合野生型时，预测磺脲类药物的作用效果弱；

(2)所述的磺脲类受体基因的多态性位点基因型为Ser1369Ser(rs757110)纯合野生型时，预测达到理想的降糖效果需要磺脲类药物的首次剂量较大，多次调整剂量后磺脲类药物的降糖效果较差；所述的磺脲类受体基因的多态性位点基因型为Ala1369Ala(rs757110)纯合突变型时，预测达到理想的降糖效果需要磺脲类药物的首次剂量较小，多次调整剂量后磺脲类药物的降糖效果较好；

(3)所述的磺脲类受体基因的多态性位点基因型为CC(rs2074312)纯合野生型时，预测磺脲类药物的作用效果强；所述的磺脲类受体基因的多态性位点基因型为TT(rs2074312)纯合突变型时，预测磺脲类药物的作用效果弱；或者

(4)所述的磺脲类受体基因的多态性位点基因型为TT(rs1799854)纯合突变型时，预测磺脲类药物的作用效果强；所述的磺脲类受体基因的多态性位点基因型为CC(rs1799854)纯合野生型时，预测磺脲类药物的作用效果弱。

本发明中的理想降糖效果指治疗后空腹血浆血糖值(FPG)≤7.0mmol/L或者治疗后空腹血浆血糖值(FPG)与治疗前相比下降≥20％。

本发明适用于正常人群、空腹血糖受损人群、糖耐量受损人群和糖尿病人群，也适用于存在患糖尿病高风险因素人群，特别适用于体重指数较高、超重、胰岛功能较差、胰岛素敏感性较差、病程长、合并高血压、或者合并高血脂的糖尿病人群。

本发明的生物样品选自：血液样品、体液样品、组织样品和培养细胞，优选的，所述样品为血液样品。其中血液样品包括外周血细胞、白细胞、血清等，体液样品包括尿液、唾液、组织液、脑脊液、体腔渗出液等，组织样品包括口腔粘膜试子、毛发、皮肤、活检组织、组织样分泌物、排泄物样本等。

本发明提到的试剂盒至少包括测定磺脲类受体基因的Ser1369Ala(rs757110)、C/T(rs2074312)和C/T(rs1799854)中一个或者一个以上的多态性位点，还可以进一步包括测定上述的磺脲类受体的其他多态性位点中的一个或者一个以上的多态性位点，也包括上述多态性位点的不同的排列组合，该试剂盒用于预测磺脲类药物的作用效果。其中所述的磺脲类药物选自格列本脲、格列波脲、格列环脲、格列己脲、格列美脲、格列平脲、格列沙脲、格列生脲、格列索脲、格列辛脲、格列齐特、格列吡嗪、和格列喹酮，优选为格列齐特或者格列美脲。所述试剂盒除了包含测定上述多态性位点所需要的特定引物或者探针之外，还包含运用PCR扩增而进行检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，或者包含运用芯片、微检测系统等方法进行检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟悉这些常规组件和检测方法。

基于磺脲类受体基因，尤其是SUR1基因，针对其不同的多态性位点，可以设计并且获得各种诊断剂和试剂盒以用于预测磺脲类药物的作用效果。基于本发明的预测方法和用途获得的各种诊断剂和试剂盒也属于本发明范围。

本发明中的“试剂盒”不限于试剂盒的固有形式，可以表现为微芯片、微检测系统或者依赖于各种载体的检测系统，以及包括前述检测系统的统一包装形式，如微孔板系统、纸质载体、玻璃载体、尼龙膜载体，塑料载体、硅胶载体、凝胶载体、膜质载体等。

本发明人通过进一步的分层研究发现，对于基线血糖值较高、基线胰岛素水平较高、体重指数较高、超重、胰岛功能较差、胰岛素敏感较重、病程较长、合并高血压、和/或合并高血脂的个体，一般对于磺脲类药物的作用效果较弱。在已知SUR1基因的Ser1369Ala(rs757110)、C/T(rs2074312)或C/T(rs1799854)多态性位点基因型情况下，比较上述多态性位点的纯合野生型、杂合型和纯合突变型个体，发现磺脲类药物的作用效果有差别，差别的趋势与未分层的人群结果趋势相同，而且差别与未分层的结果相比不同基因型之间的差别更加有显著性。尤其令人惊喜地发现，SUR1基因的Ser1369Ala(rs757110)多态性位点基因型为Ala1369Ala(rs757110)纯合突变型时，磺脲类药物的作用效果较Ser1369Ala(rs757110)杂合型强。

特别地，进一步进行分层，分析经过磺脲类药物治疗后达到理想降糖疗效时，不同的SUR1 Ser1369Ala(rs757110)多态性位点基因型个体需要服用磺脲类药物的剂量时，令人惊喜地发现，不同的SUR1基因型个体达到理想降糖疗效时需要服用的磺脲类药物的剂量不同，其中，无需增加剂量即可以达到理想降糖疗效的首次剂量不同，而且，根据血糖值逐渐增加服药剂量后，不同基因型个体能够达到理想降糖疗效的比例不同，差别有显著性。即当所述的SUR1基因的多态性位点基因型为Ser1369Ser(rs757110)纯合野生型时，预测达到理想的降糖效果需要磺脲类药物的首次剂量较大，多次调整剂量后磺脲类药物的降糖效果较差；所述的SUR1基因的多态性位点基因型为Ala1369Ala(rs757110)纯合突变型时，预测达到理想的降糖效果需要磺脲类药物的首次剂量较小，多次调整剂量后磺脲类药物的降糖效果较好。

本发明的优点是：本试剂盒运用聚合酶链式反应-限制性酶切片段长度多态性方法(PCR-RFLP)，检测糖尿病患者外周血液样本中磺脲类受体基因多态性。本试剂盒采用外周静脉全血细胞制备DNA，PCR模板制备方法操作简单，无需特殊设备，PCR扩增后采用RFLP方法检测PCR产物，根据电泳结果确定磺脲类受体的基因多态性。根据磺脲类受体的基因多态性结果，结合个体的其他生物学指标对于磺脲类药物的疗效和副作用进行预测。本发明克服了临床选择磺脲类药物的盲目性，在多态性基因型分析的基础上可以预测患者使用磺脲类药物的有效性和安全性，指导临床用药，使患者能够进行个体化医疗，尽早有效地控制血糖，减少毒副作用，减少医疗成本。本发明特别针对SUR1Ser1369Ala(rs757110)多态性位点基因型设计了如下PCR扩增引物，与常规的扩增引物相比较，扩增效率高、特异性好、省时，有更好的使用价值。SUR1的Ser1369Ala(rs757110)多态性位点基因型的PCR扩增引物如下：

正向引物：5’-GGA GAG GGG TGG GGA AGA-3’

反向引物：5’-GTC CTG CAG CAT TGG GTT G-3’

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所作出的本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。

具体实施方式

实施例1：测定SUR1 Ser1369Ala(TCC→GCC，rs757110)多态性位点基因型预测磺脲类药物作用效果的试剂盒

(一)试剂盒的组成成分：

(1)红细胞裂解液：NH₄Cl，KHCO₃，EDTA；

(2)白细胞裂解液：蛋白酶K、RNase A、NaCl、Tris、EDTA、SDS；

(3)蛋白沉淀液：7.5M乙酸胺(pH7.4)

(4)核酸储存液：1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl，pH8.0)；

(5)2×PCR反应混合液：1.0ml[100mM Tris-HCl，100mM KCl，pH8.3(20℃)]；5.0uM MgCl2；各0.4mM dATP，dCTP，dGTP，dTTP，无菌双蒸水配制，pH7.0；磺脲类受体基因的多态性位点基因型检测引物，选自序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；内标；其中引物序列根据SUR1 Ser1369Ala(rs757110)基因序列设计，包括PCR正向引物和PCR反向引物，由上海生工公司合成：

正向引物：5’-GGA GAG GGG TGG GGA AGA-3’

反向引物：5’-GTC CTG CAG CAT TGG GTT G-3’

(6)Taq DNA聚合酶(5U/ul)：保存缓冲液：20mM Tris-HCl(pH8.0)，100mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5％NP40，0.5％(v/v)Tween 20，50％甘油；购于上海生工公司。

(7)阳性质控：含有磺脲类受体基因的多态性位点杂合基因型个体全血标本，或者含有磺脲类受体基因的多态性位点杂合基因型的质粒；

(8)阴性对照：经DNAase I处理的双蒸水；

(9)内切酶缓冲体系(10×)：75μl NEB buffer 3，购于NEB公司；

(10)限制性内切酶：Mwo I内切酶(100U，5U/μl)，购于NEB公司；

(11)PCR用水；

(12)10×电泳上样缓冲液：0.25％溴酚兰，40％(w/v)蔗糖水溶液。

其中阳性质控包括含有SUR1 Ser1369Ala(rs757110)杂合基因型个体全血标本或者含有SUR1 Ser1369Ala(rs757110)多态性位点杂合基因型的质粒，其具体的靶序列如下：

5’-GGAGAGGGGTGGGGAAGAGTCCAAGGAGGAGTGTGTCTGGGTTGGGGGCCAC

AAGGGAGCCTGGGGATGGGGTGGCACTTTCGGATACTAGCTGTGGCCCATGCCTGGTG

GCTGAGCCCAGCCCGGCCCCCAGCACCATCGCTGATCCCAAAGAACTGGCCAGACCAA

GGGAAGATCCAGATCCAGAACCTGAGCGTGCGCTACGACAGCTCCCTGAAGCCGGTGC

TGAAGCACGTCAATGCCCTCATC(G/T)CCCCTGGACAGAAGGTCAGAGCACGGGCCCA

ACCCAATGCTGCAGGAC-3’

(二)检测的步骤：

(1)微量全血基因组DNA的抽提：

a)取400ul红细胞裂解液加入1.5ml离心管中，加入100ul左右新鲜全血或者抗凝全血。注意将移液器吸头内壁残留血样尽量清洗到离心管中。

b)37℃水浴5分钟，期间轻轻摇匀3次；15000g离心1分钟。

c)用移液器轻轻吸去上清液，残留约10ul液体，注意移液器吸头不可接触离心管底部可见的白色沉淀。

d)高速振荡10秒至离心管底部的白色沉淀消失；加入100ul白细胞裂解液，高速振荡30秒至液体均一，37℃水浴5分钟。

e)加入35ul蛋白沉淀液，高速振荡20秒后15000g离心90秒，离心管底可见褐色沉淀。

f)将上清液全部移入装有100ul异丙醇的1.5ml离心管中，来回轻柔的摇匀数次，至有白色絮状物出现；15000g离心90秒，离心管底部可见白色沉淀。注意吸取上清液时避免吸入褐色沉淀。

g)弃上清液，注意保留白色沉淀，加入100ul 75％乙醇(以无水乙醇配制)，15000g离心90秒；

h)弃上清液，注意保留白色沉淀，轻轻在吸水纸上敲干残液，于空气中干燥3分钟；

i)加入提前预热至65℃的核酸储存液100ul，中速振荡5秒后低速离心2秒以收集液体于离心管底部；65℃孵化5分钟；所得溶液即为高质量高产量的全血基因组DNA。

(产量大约为20-40ng/ul)

(2)使用聚合酶链式反应-限制性酶切片段长度多态性分析方法(PCR-RFLP)检测SUR1 Ser1369Ala(rs757110)多态性位点：

PCR反应体系：

样品DNA 3ul(25ng～150ng)，PCR反应混合液(2×)12.5ul，Taq DNA聚合酶0.125ul，ddH2O补足总体积至25ul。

PCR反应条件：

94℃预变性3分钟后；94℃变性30秒，61℃±5℃退火45秒，72℃延伸60秒，共35个循环周期；最后72℃延伸7min。得到298bp的片段。

作用效果增强。

SUR1 Ser1368Ala纯合突变型与杂合型和纯合野生型相比，尤其在BMI较高、胰岛功能较差或者胰岛素敏感性较差的个体中磺脲类药物的作用效果较好；并且随着突变等位子的数量增加，磺脲类药物的作用效果增强。

SUR1 Ser1368Ala纯合突变型与杂合型和纯合野生型相比，尤其在合并了高血压和/或者高血脂的个体中磺脲类药物的作用效果较好；并且随着突变等位子的数量增加，磺脲类药物的作用效果增强。

实施例2：测定SUR1基因的CT(rs2074312)多态性位点基因型预测磺脲类药物作用效果的试剂盒

(一)试剂盒的主要组成成分：

(1)红细胞裂解液：NH₄Cl，KHCO₃，EDTA；

(2)白细胞裂解液：蛋白酶K、RNase A、NaCl、Tris、EDTA、SDS；

(3)蛋白沉淀液：7.5M乙酸胺(pH7.4)；

(4)核酸储存液：1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl，pH8.0)；

(5)Taqman 2×Universal PCR Master Mix No AmpErase UNG反应混合液：含有dUTP的dNTPs，已优化的缓冲液，0.72uM的正向引物，0.72uM的反向引物及两段带荧光报告集团的等位基因特异性探针各0.16uM。

其中引物序列根据SUR1 CT(rs2074312)基因序列设计，包括PCR正向引物和PCR反向引物，由上海生工公司合成：

正向引物：5’-GGTGGGAGAGAGCATGCTACTG-3’

反向引物：5’-CAGGCATGGTTTCACACTCACT-3’

其中等位基因特异性探针包括检测SUR1基因的CT(rs2074312)多态性位点的野生型和突变型探针，本试剂盒中优选为Taqman探针，等位基因特异性探针的序列为：

VIC-5’TGGAGACATGTGGGAG 3’-NFQ，

对应于“A”等位基因，携带VIC荧光报告集团。

FAM-5’TGGAGACGTGTGGGA 3’-NFQ

对应于“C”等位基因，携带FAM荧光报告集团。

(6)Taq DNA聚合酶(5U/ul)：保存缓冲液：20mM Tris-HCl(pH8.0)，100mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5％NP40，0.5％(v/v)Tween 20，50％甘油；购于上海生工公司。

酶切条件及体系(15ul)：

SUR1 Ser1369Ala(rs757110)位点PCR产物目的片段长度为298bp，总的酶切体系为15ul，其中PCR产物10ul，10×NEBuffer#3 1.5ul，Mwo I内切酶3 U(0.6ul，5U/ul)，和2.9ul ddH₂O，60℃酶切60分钟(不得少于30分钟，可以60℃酶切过夜)。

(三)基因型测定的结果判定：

将DNA酶切后的产物点样在3.0％琼脂糖胶上，200V电压下电泳1小时后，在紫外灯下读取胶图并进行基因型分析。个体基因型鉴定如下：

酶切片段为206+92bp，SUR1基因型为1369TT纯合野生型；

酶切片段为206+92+51+41bp，SUR1基因型为1369TG杂合型；

酶切片段为206+51+41bp，SUR1基因型为1369GG纯合突变型。

(四)对于磺脲类药物作用效果的预测：

所述的SUR1 Ser1368Ala(rs757110)多态性位点基因型为纯合突变型的个体与杂合型和纯合野生型的个体相比，对于磺脲类药物的作用效果较好。随着突变等位子的数量增加，磺脲类药物的作用效果增强。

所述的SUR1基因的多态性基因型为Ala1369Ala(rs757110)纯合突变型时，预测磺脲类药物的作用效果强；所述的基因型为Ser1369Ser(rs757110)纯合野生型时，预测磺脲类药物的作用效果弱。

 所述的SUR1基因的多态性位点基因型为Ser1369Ser(rs757110)纯合野生型时，预测达到理想的降糖效果需要磺脲类药物的首次剂量较大，多次调整剂量后磺脲类药物的降糖效果较差；所述的SUR1基因的多态性位点基因型为Ala1369Ala(rs757110)纯合突变型时，预测达到理想的降糖效果需要磺脲类药物的首次剂量较小，多次调整剂量后磺脲类药物的降糖效果较好。

SUR1 Ser1369Ala纯合突变型与杂合型和纯合野生型相比，尤其在基线血糖水平较高、病程较长的个体中磺脲类药物的作用效果较好，差别有显著性；并且随着突变等位子的数量增加，磺脲类药物的作用效果增强。

SUR1 Ser1368Ala纯合突变型与杂合型和纯合野生型相比，尤其在基线胰岛素水平较高的个体中磺脲类药物的作用效果较好；并且随着突变等位子的数量增加，磺脲类药物的作用效果增强。

SUR1 Ser1368Ala纯合突变型与杂合型和纯合野生型相比，尤其在基础胰岛功能较差的个体中磺脲类药物的作用效果较好；并且随着突变等位子的数量增加，磺脲类药物的

(二)检测的步骤：

(1)按照常规的操作流程，采用与实施例1(二)(1)相似的方法提取微量全血中宿主细胞的基因组DNA。

(2)使用Taqman方法检测SUR1基因的CT(rs2074312)多态性位点基因型：

(a)用PCR仪扩增SUR1功能基因多态位点及其侧翼序列，在5ul PCR反应体系中含有基因组DNA 10ng，2.5ul的Taqman 2×Universal PCR Master Mix No AmpErase UNG(组成成份包括：AmpliTaq Gold DNA Polymerase，dNTPs with dUTP，Passive Reference，已优化的缓冲液)，及0.72uM的正向引物，0.72uM的反向引物及两段带荧光报告集团的等位基因特异性探针各0.16uM。

引物序列为：

正向引物：5’GGTGGGAGAGAGCATGCTACTG 3’

反向引物：5’CAGGCATGGTTTCACACTCACT 3’

等位基因特异性探针的序列为：

VIC-5’TGGAGACATGTGGGAG 3’-NFQ，

对应于“A”等位基因，携带VIC荧光报告集团。

FAM-5’TGGAGACGTGTGGGA 3’-NFQ

对应于“C”等位基因，携带FAM荧光报告集团。

PCR反应条件：

95℃10min，1个循环；92℃ 15s，60℃ 1min，50个循环。

(三)基因型测定的结果判定：

在7900型荧光定量PCR仪上检测荧光信息。

将完成PCR反应的PCR板放入7900型荧光定量PCR仪上，选用“AllelicDiscrimination”程序，进行扫描与结果的判断：

发出FAM荧光者的基因型为CC(rs2074312)纯合子；

发出VIC荧光者的基因型为TT(rs2074312)纯合子；

发出两种荧光者的基因型为CT(rs2074312)杂合子。

(四)对于磺脲类药物作用效果的预测：

SUR1 CT(rs2074312)多态性位点基因型为纯合野生型的个体与杂合型和纯合突变型的个体相比，对于磺脲类药物的作用效果较好。随着突变等位子的数量增加，磺脲类药物的作用效果增强。结果差别有显著性。

基因型为SUR1 CC(rs2074312)纯合野生型时，预测磺脲类药物的作用效果强；所述的SUR1基因的多态性位点基因型为CT(rs2074312)杂合型时，预测磺脲类药物的作用效果较强；所述的SUR1基因的多态性位点基因型为TT(rs2074312)纯合突变型时，预测磺脲类药物的作用效果弱。

实施例3：测定SUR1 CT(rs1799854，16-3c/t)多态性位点基因型预测磺脲类药物作用效果的试剂盒

(一)试剂盒的主要组成成分：

(1)红细胞裂解液：NH₄Cl，KHCO₃，EDTA；

(2)白细胞裂解液：蛋白酶K、RNase A、NaCl、Tris、EDTA、SDS；

(3)蛋白沉淀液：7.5M乙酸胺(pH7.4)；

(4)核酸储存液：1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl，pH8.0)；

(5)2×PCR反应混合液：1.0ml[100mM Tris-HCl，100mM KCl，pH8.3(20℃)]；5.0uM MgCl2；各0.4mM dATP，dCTP，dGTP，dTTP，无菌双蒸水配制，pH7.0；磺脲类受体基因的多态性位点基因型检测引物；内标；其中引物序列根据SUR1 CT(rs1799854)基因序列设计，包括PCR正向引物和PCR反向引物，由上海生工公司合成：

正向引物：5’-CGG CCC CAC TCA CAT CTG-3’

反向引物：5’-GGA GGA TGG TTAAAA GGA G-3’

(6)Taq DNA聚合酶(5U/ul)：保存缓冲液：20mM Tris-HCl(pH8.0)，100mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5％NP40，0.5％(v/v)Tween 20，50％甘油；购于上海生工公司；

(7)阳性质控：含有磺脲类受体基因的多态性位点杂合基因型个体全血标本，或者含有磺脲类受体基因的多态性位点杂合基因型的质粒；

(8)阴性对照：经DNAase I处理的双蒸水；

(9)内切酶缓冲体系(10×)：75μl NEB buffer 3，购于NEB公司；

(10)限制性内切酶：Pst I内切酶(100U，20U/μl)，购于NEB公司；

(11)PCR用水；

(12)10×电泳上样缓冲液：0.25％溴酚兰，40％(w/v)蔗糖水溶液。

(二)检测的步骤：

(1)按照常规的操作流程，采用与实施例1(二)(1)中相似的方法提取微量全血中宿主细胞的基因组DNA。

(2)使用PCR和限制性酶切片段长度多态性分析方法(PCR-RFLP)检测SUR1 CT(rs1799854)多态性位点基因型：

根据SUR1 CT(rs1799854)基因序列设计PCR特异性引物，包括PCR正向引物和PCR反向引物，按如下条件进行常规PCR扩增。

引物序列为

正向引物：5’CGG CCC CAC TCACAT CTG 3’

反向引物：5’GGA GGA TGG TTA AAA GGA G 3’

PCR反应体系：

基因组DNA45ng，上下游引物10pmol(20umol/L)，dNTPs 2.0mmol/l，，10×buffer1.0ul，Gold Taq DNA polymerase 3 U，ddH2O补足总体积至10ul。

PCR反应条件：

95℃预变性10min后；94℃变性30sec，56℃退火45sec，70℃延伸45sec，35个循环周期；最后70℃延伸7min。得到200bp的片段。

酶切条件及体系(10ul)：

SUR1 CT(rs1799854)位点PCR产物目的片段长度为298bp，总的酶切体系为10ul，其中PCR产物5ul，10×NEBuffer#3 1.5ul，Pst I内切酶4U(0.2ul)，和3.3ul ddH2O，37℃温育1小时以上。

(三)基因型测定的结果判定：

将DNA酶切后的产物点样在3.0％琼脂糖胶上，200V电压下电泳1小时后，在紫外灯下读取胶图并进行基因型分析。个体基因型鉴定如下：

酶切片段为162+38bp，SUR1基因型为CC(rs1799854)纯合野生型；

酶切片段为200+162+38bp，SUR1基因型为CT(rs1799854)杂合型；

酶切片段为200bp，SUR1基因型为TT(rs1799854)纯合突变型。

(四)对于磺脲类药物作用效果的预测：

SUR1 CT(rs1799854)多态性位点基因型为纯合突变型的个体与杂合型和纯合野生型的个体相比，对于磺脲类药物的作用效果较好。随着突变等位子的数量增加，磺脲类药物的作用效果增强。结果差别有显著性。

基因型为SUR1 TT(rs1799854)纯合突变型时，预测磺脲类药物的作用效果强；所述的SUR1基因的多态性位点基因型为CT(rs1799854)杂合型时，预测磺脲类药物的作用效果较强；所述的SUR1基因的多态性位点基因型为CC(rs1799854)纯合野生型时，预测磺脲类药物的作用效果弱。

实施例4：采用小试生产的试剂盒对于服用磺脲类药物的糖尿病患者的药物作用效果进行预测

我们应用小试生产的试剂盒，对服用磺脲类药物的糖尿病患者的Ser1369Ala(TG，rs757110)的多态性位点基因型进行检测，同时检测其他生理参数，如年龄、性别、身高、体重、吸烟史、饮酒史、职业、教育程度、基础空腹血浆血糖、基础胰岛素水平等。通过测定个体基因型参数及其他生理参数，预测磺脲类药物的作用效果：

1、获得个体的SUR1 Ser1369Ala(rs757110)多态性位点基因型参数和基本生理参数：年龄、性别、身高、体重、吸烟史、饮酒史、职业、教育程度、基础β细胞功能。

2、根据多元线性回归分析，得到用来预测磺脲类药物的作用效果的预测模型。

预测方程分别为：

根据上述SUR1 Ser1369Ala(rs757110)多态性位点基因型参数和基本生理参数预测磺脲类药物疗效的预测方程，其中包括如下2个预测方程：

(1)预测个体服用磺脲类药物后FPG的绝对值的预测方程，括号内为95％可信区间：服药后FPG＝3.81965(1.75335～5.88595)-0.46511×TG(杂和基因型)(-0.79271～-0.13752)-0.84731*GG(纯合突变)(-1.26443～-0.43018)+0.40753×基线空腹血糖(0.35121～0.46384)-0.01530×年龄(-0.03386～0.00325)-0.40884×性别(-0.83215～0.01448)+0.00472×BMI(-0.04624～0.05567)-0.005488×LOG(基线甘油三酯)(-0.29113～0.18137)-0.01250×烟(-0.41135～0.38634)-0.16479×酒(-0.52264～0.19305)+0.99207×降糖药服用史(0.66737～1.31678)

(2)预测磺脲类药物治疗后的FBG与治疗前FPG相比下降百分数的方程，括号内为95％可信区间：

(FPG0-FPG57)/FPG0＝0.32291(0.13396～0.51187)+0.02127×TG(-0.01098～0.05352)+0.07335×GG(0.03222～0.11449)+0.00091233×年龄(-0.00091596～0.00274)+0.05588×性别(0.01429～0.09747)-0.00450×BMI(-0.00949～0.00048012)+0.01238×log(TG)(-0.01091～0.03567)+0.03118×烟(-0.00788～0.07025)+0.01589×酒(-0.01940～0.05118)-0.09763×降糖药服用史(-0.12956～-0.06570)

以上(1)和(2)的预测方程中的基因型参数值的取值方式如下：按照测定的SUR1Ser1369Ala(rs757110)多态性位点的基因型取值。当个体的基因型为GG纯合突变型时，预测方程中GG基因型参数取值为1，TG基因型参数取值为0；当个体的基因型为TG杂合型时，预测方程中GG基因型参数取值为0，TG基因型参数取值为1；当个体的基因型为TT纯合野生型时，预测方程中GG基因型参数取值为0，TG基因型参数取值为0。

以上(1)和(2)的预测方程中的基本生理参数值的取值方式如下：年龄参数取实际年龄数值，单位为岁；BMI(体重指数)参数为体重(公斤)/身高(米)²(kg/m²)；基线空腹血糖参数单位为mmol/l；基线TG为单位为mmol/l的数值进行log转换后的数值；性别参数为男性取1，女性取2；饮酒史参数为从不饮酒取0，曾经饮酒或者现在饮酒取1；吸烟史参数为从不吸烟取0，曾经吸烟或者现在吸烟取1；身高参数取实际身高值，单位为厘米(cm)；体重参数取实际体重值，单位为公斤(kg)；降糖药服用史参数无降糖药服用史取1，有降糖药服用史取2。

3、根据预测方程计算得到的结果定量预测磺脲类药物的作用效果。

按照如下的判定降糖疗效的标准，将根据上述预测方程计算得到的预测降糖疗效的数据与根据血糖的实测值得到的降糖疗效数据进行比较，结果见表1、表2。

表1 SUR1基因Ser1369Ala(TG，rs757110)多态性位点基因型对降糖效果的预测结果

    实测降糖有效(FPG下降≥20％，人数)    实测降糖无效(FPG＜20％，人数)  合计(人数)    预测降糖有效(阳性人数)  286  105  391    预测降糖无效(阴性人数)  51  71  122    合计(人数)  337  176  513

敏感性＝286/337×100％＝84.9％ 特异性＝71/176×100％＝40.3％

PPV＝286/391×100％＝73.1％    NPV＝71/122×100％＝58.2％

由表1可见，测定个体Ser1369Ala(TG，rs757110)的多态性位点基因型，并且同时测定个体的某些生理参数，根据本发明提供的预测方程，预测对于磺脲类药物的降糖效果的敏感性为84.9％，特异性为40.3％，阳性预测值(PPV)为73.1％，阴性预测值(NPV)为58.2％，有很好的准确性，因此有很高的实际应用价值。在本发明中，定义治疗后空腹血浆血糖(FPG)与治疗前的FPG相比较下降≥20％为降糖治疗有效，定义治疗后空腹血浆血糖(FPG)与治疗前的FPG相比较下降＜20％为降糖治疗无效。

表2 SUR1基因Ser1369Ala(TG，rs757110)多态性位点基因型对降糖效果的预测结果

    实测降糖有效(治疗后FPG≤7.0mmol/L)    实测降糖无效(治疗后FPG＞7.0mmol/L)  合计  预测降糖有效(阳性人数)  125  50  175  预测降糖无效(阴性人数)  105  233  338  合计(人数)  230  283  513

敏感性＝125/230×100％＝54.3％ 特异性＝233/283×100％＝82.3％

PPV＝125/175×100％＝71.4％    NPV＝233/338×100％＝97.9％

表2结果可见，测定个体Ser1369Ala(TG，rs757110)的多态性位点基因型，并且同时测定个体的某些生理参数，根据本发明中前述提供的预测方程，预测对于磺脲类药物的降糖效果的敏感性为54.3％，特异性为82.3％，阳性预测值(PPV)为71.4％，阴性预测值(NPV)为97.9％，有很好的准确性，因此有很高的实际应用价值。在本发明中，定义治疗后空腹血浆血糖(FPG)值≤7.0mmol/L为降糖治疗有效，定义治疗后空腹血浆血糖(FPG)＞7.0mmol/L为降糖治疗无效。