酚类二苯庚烷类化合物的制备及其抗氧化用途

摘要

本发明涉及从姜科植物的提取物中分离得到的二苯庚烷类化合物的制备方法、药物用途和含有这些化合物的药物组合物。本发明的化合物具有抗氧化生物活性，可以用于预防或治疗由氧自由基引起或与氧自由基有关的生理改变或疾病，其剂型可以以片剂、颗粒剂、胶囊、注射剂等药物组合物形式使用。

说明书

技术领域

本发明涉及植物化学和药物化学领域，具体而言，本发明涉及具有预防或治疗由氧自由基引起或与氧自由基有关的生理改变或疾病用途的从姜科植物生姜、郁金、莪术、和/或高良姜中得到的三个酚类二苯庚烷类化合物之制备方法，以及其清除自由基和抗氧化用途和与此相关的医药或保健品。

技术背景

正常情况下，人体的抗氧化防御系统能清除自由基，使其产生和清除保持平衡。自由基的产生和清除失衡时，就会引起机体损伤。自由基可以引起多种人类疾病：脑组织受自由基氧化损伤可与致阿尔兹海默症(AD)，也称老年性痴呆症；帕金森氏症(PD)，中风，衰老，老年斑等。同时自由基还与病毒感染以及肿瘤生成、以及癌症转移等都有相当密切的关系。此外，随着氧自由基及其介导的脂质过氧化反应在疾病中的作用研究的日趋深入，越来越多的证据表明，氧自由基参与心血管系统多种生理、病理过程，引发多种心血管疾病，如高血压、动脉血管硬化、心肌梗死、心肌病等。此外，自由基在炎症发生和发展过程中起了重要的作用。医学研究指出：高血糖状态下产生大量的ROS，促进了糖尿病血管并发症，从而使致残率和致死率逐年上升。因此，研究和发展抗氧化剂是近年来一个热门的方向，对于老龄化、高压力人群增多的社会形态，抗氧化药物可以深入至保肝、防治老年性痴呆、预防心血管疾病、抗炎、抗病毒等多种药物用途中去。

生姜粗提防在以往的研究过程中发现具有较好的抗氧化作用。我们选择国内常见的几种姜植物进行研究，以期发现新的抗氧化活性成分。姜科植物广布于中国各地，较为著名和常用的包括生姜(Zingiber officinale)、姜黄(Curcuma LongaL)、莪术(Curcuma phaeocaulis valeton)、郁金(Curcuma wenyujinY.H.Chenet C.Ling)、高良姜(Alpinia officinarum Hance)等，主要有温胃散寒，消食止痛，行气破血，清心解郁，消积化瘀，利胆退黄等功效。郁金包括温郁金、广西莪术、蓬莪术等，主要用于经闭痛经、胸腹涨痛、刺痛、热病神昏、癞痫发狂、黄疸尿赤等。商品有黄郁金、黑郁金、白郁金、绿郁金，一般以黄郁金为佳。对中毒性肝炎有保护作用，具抗真菌作用，姜黄醇和姜黄素还有显著降血脂作用。莪术归肝脾经，用于徵叚痞块，瘀血经闭，食积涨痛，早期宫颈癌等。药用抗肿瘤、抗菌、升白、抗血栓等作用。高良姜主要分布于我国南部，按照产地不同分为广东、广西、台湾、海南四种。归脾、胃经，用于脘痛冷痛、胃寒呕吐、嗳气吞酸等。用于治疗溃疡、心绞痛等。

生姜(Zingiber officinale)乃禾本科根茎类植物，有辛辣味，自古以来就被用作调味和保健用途，有养颜、抗衰老、活血及帮助消化作用。朱熹《论语集注》中有记载：姜能通神明、去秽恶。惟其生物活性的作用机理大多不详，而生姜内各种不同的化合物种类繁多，各有不同作用，故分离及鉴定其有效成份对于发展生姜的药用价值实属必要。

对以上姜科植物的深入活性成分研究，找出其作用机制，为本发明的目的之一。

发明内容

本发明的目的是提供了一个姜科植物生姜、郁金、莪术、和/或高良姜中得到的酚类二苯庚烷类化合物及其可药用盐或其溶剂化物；

本发明的又一目的是提供了三个姜科植物生姜、郁金、莪术、和/或高良姜中得到的酚类二苯庚烷类化合物的制备方法及其清除自由基和抗氧化用途；

本发明的另一目的是提供了将本发明化合物用于制备护肝药、抗老年性痴呆药物、治疗心血管及脑血管病变物、抗衰老药物、治疗糖尿病并发症药物及与上述疾病或生理变有关的医药或保健品用途；

本发明的另一目的是提供了含有本发明的酚类二苯庚烷类化合物的药物组合物。

本发明通过从姜科植物生姜、郁金、莪术、高良姜中提取制备得到下列的化合物1～3，具体结构如下：

化学名称：

化合物1：3，5-二乙酰基-1-(3-甲氧基-4，5-二羟基苯基)-7-(4-

羟基-3-甲氧基苯基)-庚烷；

化合物2：1-(3，4-二羟基-5-甲氧基苯基)-7-(4-羟基-3-甲氧基

苯基)-庚烷-5-羟基-3-酮；

化合物3：1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-7-(3，4-二羟基-5-甲氧基

苯基)-庚烷-5-羟基-3-酮。

本发明的酚类二苯庚烷类化合物1～3的提取制备方法包括：由姜科植物根茎、叶、花部位经醇水或酮水超声提取、大孔树脂富集、硅胶柱或葡聚糖凝胶柱精制而成。本发明的提取方法包括以下步骤：

(a)由醇水或酮水经冷浸或超声提取干燥并磨粉的姜科植物，减压挥干溶剂后得浸膏；

(b)用乙醇或甲醇进行溶解，后经大孔树脂柱层析，先用水洗去杂质，然后用醇水系统梯度洗脱得不同流份；根据薄层层析检测结果，合并相同组分流份，将含有化合物1～3的组分再分别用硅胶柱层析，以有机混合溶剂系统梯度洗脱，经过薄层层析检测，合并含有相同成分的流份，再用葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱层析精制，以氯仿-甲醇溶剂系统洗脱，经选择溶济重结晶后得到酚类二苯庚烷类化合物1～3。

本发明中的制备方法中，步骤(a)中的醇可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇、碳链小于32烷醇、碳链小于32烯醇及苯酚等或它们的混合物，优选乙醇；醇水混合溶剂可以是醇和水不同比例混合的溶剂，优选乙醇和水的混合溶剂。步骤(a)中的酮可以是丙酮、丁酮或其它小于6个碳的酮，优选丙酮；酮水混合溶剂可以是酮和水不同比例混合的溶剂，优选丙酮和水的混合溶剂。

酚类二苯庚烷类化合物1～3主要来源于姜科植物的各个部位，优选从生姜、郁金、莪术的根茎、叶、花，包括其干品和鲜品中制备而得。

本发明的特点是，从姜科植物根茎、叶、花部位中分离提纯其有效部位，经化学测定结构为二苯庚烷类化合物1～3，并发现其具有很强的清除氧自由基作用，提供了可期待用于制备与氧自由基引起或有关的生理改变或疾病的治疗药物及预防保健品，包括但不限于衰老，心血管病变，脑血管病变，肝病变，老年性疾呆症，及糖尿病并发症。

本发明中制备得到的酚类二苯庚烷类化合物1～3用制药领域中的常规方法，结合中、西药制药中常规的可药用辅料，可以制成各种药物组合物，如片剂、颗粒剂、胶囊、注射剂等。这些药物组合物可以用于预防或/和治疗老年性痴呆、心血管病变、脑血管病变、肝病变、早衰、糖尿病并发症等与氧自由基破坏细胞功能有关的生理改变或疾病。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明。必须说明下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1：生姜中含酚类二苯庚烷类化合物1～3的分离制备和纯化方法

干燥的生姜根茎(5.5公斤)磨粉后用10倍量95％乙醇浸泡，用超声提取，每次3小时。减压挥干溶剂后用大孔树脂柱层析，用乙醇-水(0∶100-100∶0)梯度洗脱，根据薄层层析检测结果，合并相同组分流份。将含有化合物1～3的组分再分别用硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯和氯仿-甲醇溶剂系统梯度洗脱。经过薄层层析检测，合并含有相同成分的流份。再用葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱层析精制，以氯仿-甲醇溶剂系统洗脱，薄层制备得到化合物1～3。

化合物1～3的¹H-NMR核磁共振数据(400MHz，氘代丙酮)见表1；其¹³C-NMR核磁共振数据(100MHz，氘代丙酮)见表2；化合物1和2以混合物形式得到，无法进一步分离。混合谱测定根据刘中立等报道数据(Jianping Ma，Xiaoling Jin，LiYang，Zhong-Li Liu，Phytochemistry，2004年，65卷，1137-1143页)，归属如下：

表1.化合物1～3的¹H-NMR核磁共振数据(400MHz，氘代丙酮)，偶合常数J用括号中数字表示(赫兹Hz为单位)，s为单峰，d为双峰，t为三重峰，dd为双双重峰，dt为双三重峰，m为多重峰。

    H    1    2    3    1    2    3    4    5    6    7    2′    5′    6′    2″    5    6″    3′-OMe    5′-OMe    3″-OMe    5″-OMe    3-OAC    5-OAc    2.68t(6.8)    2.76m    -    2.57dd(16.4，7.6)    4.02q(6.6)    1.67dt(15.2，7.2)    2.51dt(14.4，7.6)    2.60dt(13.2，7.6)    6.34s    -    6.34s    6.80s    6.71d(8.0)    6.62d(8.0)    -    3.77s    3.80s    -    -    -    2.51dt(14.4，7.6)    2.60dt(13.2，7.6)    2.76m    -    2.57dd(16.4，7.6)    4.02 q(6.6)    1.67dt(15.2，7.2)    2.74m    6.80s    6.71d(8.0)    6.62d(8.0)    6.34s    -    6.34s    3.79s    -    -    3.76s    -    -    2.52dt(15.6，  7.8)    2.54dt(15.9，7.8)    1.84q(7.2)    4.97m    1.76dt(11.7，5.7)    1.92dt(14.0，6.9)    4.97m    1.84q(7.2)    2.52dt(15.6，7.8)    2.54dt(15.9，7.8)    6.36brs    -    6.26brs    -    6.66d(1.6)    6.62dd(8.0，1.6)    3.84s    -    3.82s    -    2.00s    2.00s

表2.化合物1～3的¹³C-NMR核磁共振数据(100MHz，氘代丙酮)

    C    1    2    3    1    2    3    4    5    6    7    1′    2′    3′    4′    5′    6′    1″    2″    3″    4″    5″    6″    3′-OMe    5′-OMe    3″-OMe    5″-OMe    3-OAC    5-OAc    32.1    45.8    210.2    50.8    67.6    40.2    32.3    134.0    109.6    148.2    133.1    148.9    104.7    133.6    113.0    146.0    134.5    115.6    121.5    -    56.4    56.2    -    -    -    32.3    45.9    210.2    50.8    67.6    40.2    32.1    133.6    112.6    146.0    134.5    115.6    121.4    134.0    109.7    148.2    133.1    148.9    104.6    56.2    -    -    56.4    -    -    31.4    36.6    69.8    38.5    69.8    36.5    31.2    133.1    108.4    146.8    130.5    143.8    103.2    133.2    110.9    146.3    143.7    114.2    120.7    56.1    -    55.9    -    170.8，21.1    170.8，21.1

实施例2：酚类二苯庚烷类化合物1～3清除超氧阴离子自由基的能力检测

化合物1～3清除超氧阴离子自由基能力的检测乃使用非酶体系吩嗪硫酸甲酯-还原性辅酶I(PMS-NADH)系统产生的超氧阴离子与还原性氮兰四唑(NBT)发生氧化还原反应，根据其在560nm波长处吸光度的变化来判断化合物的自由基清除能力。反应体系中含有三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)缓冲液(16mmol/L，酸碱度pH＝8.0)，78μmol/L还原性辅酶I(NADH)，50μmol/L氮兰四唑(NBT)，浓度为50μg/mL的待测化合物和5μmol/L吩嗪硫酸甲酯(PMS)。系统中加入PMS即启动反应，室温反应5分钟后使用酶标仪(Bio-Tek Instruments，USA)在560nm波长处测定吸光度(A)。空白管不加PMS。浓度为50μg/mL的槲皮素和姜黄素作为阳性对照。所得值为三次结果的平均值±标准误。

表3.化合物1～3清除超氧化阴离子自由基活性

    化合物(浓度：50μg/ML)    百分清除率    1和2    66.3％±1.7％    3    44.6％±3.6％    姜黄素(Curcumin)    61.3％±4.7％    槲皮素(Quercetin)    91.4％±2.8％

结果说明：化合物1～3在同等浓度的情况下，对超氧化阴离子自由基有确切的清除活性。其中化合物1和2的混合物对超氧化阴离子自由基清除能力比姜黄素还要高，说明其为潜在的抗氧化活性物质，具有进一步开发价值。

实施例3：酚类二苯庚烷类化合物1～3清除1，1-二苯基-二苦基肼(DPPH)自由基的能力检测

1，-二苯基-二苦基肼(DPPH)的甲醇溶液在517nm波长处有强吸收值，其被抗氧化物还原时，吸收值下降，吸光度越低，其抗氧化作用越强。主要参考AlejandroTapia等所述方法。简而言之，250μL反应体系中含有各种不同浓度的待测化合物25μL，DPPH(0.4mg·mL^-1)的甲醇溶液40μL及甲醇溶液185μL，37℃水浴反应30分钟后，在517nm波长处测定吸光度。DPPH的甲醇液和槲皮素分别作为阴性、阳性对照。所得直为三次结果的平均植±标准误，见表3。

表3化合物1～3清除超氧化阴离子自由基活性

化合物(浓度：50μg/mL)    半数清除浓度IC₅₀(μg/mL)1和2    10.2±1.13    24.4±1.2姜黄素(Curcumin)    11.6±1.8槲皮素(Quercetin)    3.6±0.13

结果说明：酚类二苯庚烷类化合物1～3在同等浓度的情况下，对DPPH自由基有确切的清除活性，其中化合物1和2的混合物对DPPH自由基清除能力强于姜黄素而弱于槲皮素。说明该类酚类二苯庚烷类是具有清除DPPH自由基显著效果的酚类二苯庚烷类化合物。具有进一步开发成为抗氧化、抵抗自由基引起的损害药物的潜力。

实施例4：酚类二苯庚烷类化合物1～3对细胞的毒性检测

在测定这些新化合物的抗氧化作用之前，对酚类二苯庚烷类化合物1～3的细胞毒性进行了测定，化合物以100μM的浓度与原代培养的大鼠肝细胞作用48小时，没有观察到有任何细胞毒性。另外，酚类二苯庚烷类化合物1～3对培养的KB细胞也没有呈现显著细胞毒性。

实施例5：温郁金、莪术、姜黄、高良姜根茎与地上部分茎叶中化合物1～3的比较

温郁金和莪术(全草)植物各一公斤采自浙江省瑞安南部，姜黄一公斤购自杭州中药材市场，高良姜购自广西玉林，生药由昆明医学院张荣平教授鉴定。用安吉伦高效液相色谱(Agilent HPLC)对化合物1～3进行了含量检测。

供试样品处理：阴干粉碎后的样品各称取0.5克(±0.1毫克)，置25毫升容量瓶，加20毫升甲醇，25～30℃下超声60分钟，加甲醇至刻度，用0.45μm滤膜滤过。

标准溶液的制备：准确称取化合物1和2的混合物(1∶1，核磁共振谱确定比例)10.0毫克，加入8毫升甲醇超声溶解，加入甲醇配成0.5毫克/毫升的标准备液。用甲醇按照1∶1，1∶10，1∶50，1∶100配制成标准溶液，冷藏备用。同法制备出化合物3的标准溶液。

色谱条件：使用C18色谱柱(4.6mm×250mm)，5μm，柱温30℃，检测波长：282nm，流速：1.0毫升/分钟，进样量：20μl。流动相组成如下表所示：

    时间(分钟)    水(％)    乙腈(％)    0    55    45    8    50    50    15    45    55    40    10    90    45    55    45    55    55    45

含量测试：将提取溶媒、标准品溶液、供试样品分别进样，记录色谱图。以峰面积对应标准溶液浓度绘制曲线，计算线性范围，相关系数≥0.998。从标准曲线计算出化合物1～3的含量。

发现含量如下表所示：

样品来源化合物1&2含量(％) 化合物3含量(％)温郁金0.11 0.18温郁金地上部分茎叶0.07 0.12莪术0.13 0.20姜黄0.10 0.14高良姜0.09 0.13

结果表明：温郁金根茎和地上部分都含有本发明所述的化合物，并且姜黄、高良姜中都含有不同含量的化合物1～3，说明化合物1～3是姜科植物中的特征性成分，所以运用温郁金根茎和地上部分、莪术、姜黄、高良姜都可以制备本发明所要求的含有化合物1～3的抗氧化药物。