用于在肿瘤细胞中有效给予和表达治疗性基因的腺病毒/α病毒杂交载体

摘要

本发明涉及杂交的腺病毒基因表达载体，其特征在于沿着5′至3′方向其至少包括下列元件，即：i.腺病毒来源的第一链，其含有第一反向末端重复序列(ITR)和用于包装腺病毒的信号序列；ii.第一非编码填充片段序列；iii.对应于组织特异性启动子的序列；iv.衍生自α病毒的cDNA链，其序列部分地互补于α病毒RNA，至少包括编码至少一种目的外源基因的序列；v.多聚腺苷酸化序列；以及vi.第二腺病毒反向末端重复序列(ITR)。本发明优选涉及包括哺乳动物白介素治疗性基因IL－12、更优选人白介素hIL－12作为目的外源基因的腺病毒杂交载体。本发明还涉及所述杂交载体在将遗传物质转入细胞的方法中的用途，特别是肿瘤细胞，优选表达α－甲胎蛋白(AFP)的细胞；本发明还涉及所述杂交载体在诱导针对外源基因的免疫应答中的用途。

说明书

发明领域

本发明涉及用于获得治疗性产物的衍生自腺病毒的基因表达载体。

发明的现有技术

面临传统癌症治疗的主要问题之一是缺少肿瘤特异性，这种情况通常会导致严重的副作用，并限制了可以应用的治疗剂量。尽管基因治疗具有用于癌症治疗的很好的潜力，但是其也面临着特定的问题：将转基因表达靶向癌症位点。许多研究暗示，当基于损伤内给予病毒载体时，尽管转基因表达基本上被限制在针的路线附近的区域，但是这类表达也会出现在其它组织中。因此，应用于癌症的基因治疗的一个重要的目标是将治疗性基因表达定向至肿瘤，其通过特异性的给予瘤组织(“组织目标”)以及/或在瘤组织内的特异性激活(“转录目标”)实现，而不影响健康细胞。可以通过制备载体来实现“组织目标”，该载体通过修饰受体-配体的相互作用而定向，这样能够感染表达特异受体的细胞。可以使用肿瘤特异性的启动子控制转基因表达来达到“转录目标”。之前的研究已经使用不同的特异性启动子。然而，这具有实质上限制，即它们不能够产生高水平的基因表达，其结果是限制了抗癌活性。

在Lundstrom K.“Latest development in viral vectors for genetherapy(用于基因治疗的病毒载体的最新进展)”；Trends inBiotechnology，2003，21：118-122中可以得到开发用于基因治疗的病毒载体方面最新的进展。

目前使用的病毒载体包括α病毒。α病毒是有包膜的病毒，其含有简单的正RNA链作为基因组。已经设计和开发了来自α病毒Sindbis病毒(SIN)、Semliki Forest病毒(SFV)以及委内瑞拉马脑脊髓炎(VEE)病毒的表达载体。这些α病毒载体基于使用衍生自α病毒基因组的自复制RNA分子，其中保留了复制必需的5’和3’序列和复制酶(Rep)基因，而删除了编码病毒结构蛋白的基因并被替换成转基因。在将这些载体转染细胞后，Rep得到翻译，并且RNA载体被拷贝在负RNA链中，其将用作扩增RNA载体的模版。Rep也能够识别负RNA链中的亚基因组启动子，接着从中又合成较小的亚基因组RNA片段，其能够被翻译以产生高水平的外源蛋白质。当在体外从原核启动子(如SP6或T7)进行转录时，α病毒载体可直接用作RNA，或者当复制子序列位于真核启动子(例如CMV)下游时，也用作DNA。通过将RNA载体与一种或者多种“协助”RNA在细胞中进行共转染，可以将RNA载体包装在病毒颗粒中，其中所述“协助”RNA编码病毒的结构蛋白质。α病毒载体具有许多使其适合基因治疗的性质：非常广泛的向性(tropism)、低免疫原性以及高水平的外源蛋白质表达水平。然而，这类表达是瞬时的，因为当发生复制时，会诱导细胞的凋亡。文献Rayner J.O.，Dryga S.A.，Kamrud K.I.“Alphavirus vectors andvaccination(α病毒载体与接种疫苗)”；Rev.Med.Virol.2002；12279-296描述了基于α病毒开发在疫苗领域应用的表达载体。

另一系列的病毒载体基于腺病毒。有大量关于腺病毒的应用的文献，其已经被开发以克服基因治疗的某些不便，并作为制备表达载体的来源。文献Volpers C，Kochanek S.“Adenoviral vectors for genetransfer and therapy(用于基因转移和治疗的腺病毒载体)”；J Gene.Med.2004；6：S164-S171报道了腺病毒载体领域的最近进展。腺病毒具有提供高转导效率的优点，以及具有保持游离形式(episomal form)的能力。然而，腺病毒蛋白质的表达诱导了较强的免疫反应，这限制了转基因表达的持续时间，并在感染了载体的细胞中引发毒性。已经开发了无肠腺病毒(gutless adenoviruse)以解决这些问题。这些无肠腺病毒已经被去除了所有相应的腺病毒基因(所保留的序列只有两个反向末端重复序列和包装信号)，因此，被转导的细胞不表达腺病毒产物，并且不诱导对载体的免疫反应。简单的说，全部腺病毒基因的去除为容纳大表达盒(expression cassette)留出了充分的空间，这是无肠腺病毒也被称作高容量腺病毒载体的原因。Morsy MA等人公开了描述腺病毒载体具体方面的文献，其涉及去除所有编码病毒蛋白质的序列，参见“An adenoviral vector deleted for all viral coding sequencesresults in enhanced safety and extended expression of a leptin transgene(去除所有病毒编码序列的腺病毒载体导致增强的安全性和增强的瘦素蛋白转基因的表达)”；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998，95：7866-7871。Schiedner G等人公开的文献“Variables affecting in vivoperformance of high-capacity adenovirus vectors(影响高容量腺病毒载体体内性能的因素)”；J.Virol.2002，76：1600-1609描述了在基于无肠腺病毒的表达载体中使用填充片段DNA(stuffer DNA)，其表明这种填充片段DNA的存在对于基因表达的大幅提高是必须的，并且通常基于高容量腺病毒(无肠腺病毒)的载体的设计能够充分地修饰基因表达的程度和持续时间。

另一方面，文献US-5,981,225描述了基于腺病毒用于基因转移的载体，其包括反向末端重复(ITR)序列、至少一个包装信号序列以及VAI腺病毒基因和/或VAII腺病毒基因；并包括与腺病毒无关的基因，该基因被可操作地连接到腺病毒的靶细胞内的功能性启动子。

文献US-5,985,846描述了一种基因转移载体，其包括腺病毒的反向末端重复(ITR)序列和含有这些序列的腺病毒的重组颗粒。

文献US-6,566,093描述了衍生自α病毒的cDNA载体，其由与α病毒的RNA的至少一部分互补的DNA(对于α病毒的复制是必须的)，以及外源cDNA(例如编码期望物质的cDNA)组成。后者可以是生物活性蛋白质或者多肽以及免疫原蛋白(多肽)或者抗原蛋白(多肽)、治疗活性蛋白或多肽、或者治疗活性RNA。

本发明的目的是在体外和体内改进转基因表达和杂交载体介导的肿瘤细胞的凋亡。另一目的是通过杂交载体改进动物模型内肿瘤治疗的效率。

另一目的是通过使用杂交载体开发基因治疗的方法，特别是用于治疗癌症。

本发明的目的是通过将下列性质结合在单一载体中完成的：

-高感染能力，其通过使用腺病毒释放系统；

-高转基因表达和凋亡的诱导，其通过使用衍生自诸如SFV的α病毒的载体；以及

-肿瘤特异性，其通过使用肿瘤特异性启动子。

发明描述

本发明首先涉及基因表达腺病毒杂交载体，特征在于沿5’至3’方向，其至少包括下列元件：

i.腺病毒来源的第一链，其包括第一反向末端重复(ITR)序列和用于包装腺病毒的信号序列；

ii.第一非编码填充片段序列；

iii.对应于组织特异性启动子的序列；

iv.衍生自α病毒的cDNA链，其序列部分地互补于α病毒RNA，至少包括编码至少一种目的外源基因的序列；

v.多聚腺苷酸化序列；以及

vi.第二腺病毒反向末端重复(ITR)序列。

更具体地，本发明涉及构建腺病毒杂交载体，该腺病毒杂交载体包括在肿瘤特异性启动子(元件iii.)转录控制下的作为元件iv的衍生自α病毒的cDNA链，其相应于SFV重组复制子的序列，其中所述启动子是α-甲胎蛋白(AFP)的启动子。在该构建体中，可以将转基因插入SFV复制子中，其由SFV亚基因组启动子引导。在以这种杂交载体感染肿瘤细胞后，SFV复制子的mRNA从肿瘤特异性启动子得到转录，从SFV复制子的所述mRNA翻译非结构蛋白质-nsPs-其构成了SFV复制酶基因。这些nsPs蛋白质-病毒复制酶-起始了SFV复制子的mRNA的复制，以产生SFV的亚基因组RNA。因此，所述转基因可从SFV的亚基因组RNA高水平表达。这种完整的病毒复制过程将导致被感染细胞细胞中凋亡的产生。在这些杂交载体感染非肿瘤细胞时，SFV复制子的mRNA不会从在这些细胞中没有活性的肿瘤特异性启动子转录。因此，在感染杂交载体的正常细胞中将不会有转基因的表达，也不会发生凋亡。

本发明还涉及获得所述腺病毒杂交载体的方法，其包括通过基因工程技术将上述的腺病毒杂交载体的元件i.至vi.进行组装。

本发明还涉及上述杂交载体在将遗传物质转入细胞中的用途，更具体地，其用于将外源基因导入真核细胞并进行表达，其中所述真核细胞可以是腺病毒的靶细胞。

遗传物质的转入优选导致在所述细胞中诱导针对外源抗原的免疫应答。

本发明还涉及含有所述腺病毒-α病毒杂交载体的药物组合物，及其在治疗癌症中的用途，其包括以所述药物组合物对个体给药。

本发明还涉及通过使用前述杂交载体治疗癌症的方法，其包括以所述杂交载体对个体给药。

本发明涉及基因表达腺病毒杂交载体，特征在于沿5’至3’方向其至少包括下列元件：

i.腺病毒来源的第一链，其包括第一反向末端重复(ITR)序列和用于包装腺病毒的信号序列；

ii.第一非编码填充片段序列；

iii.对应于组织特异性启动子的序列；

iv.衍生自α病毒的cDNA链，其序列部分地互补于α病毒RNA序列，至少包括编码至少一种目的外源基因的序列；

v.多聚腺苷酸化序列；以及

vi.第二腺病毒反向末端重复(ITR)序列。

本发明的α病毒-腺病毒杂交载体中元件i.的性质，即腺病毒来源的包括第一反向末端重复(ITR)序列和用于包装腺病毒的信号序列(ψ)的链的性质并不是本发明的关键方面，其可源自任何腺病毒血清型。所述血清型是该技术领域中熟知的，并包括例如Ad12(A亚属)、Ad3和Ad7(B亚属)、d2和Ad5(C亚属)、Ad8(D亚属)、Ad4(E亚属)、Ad40(F亚属)以及其它已知的可以来自例如猪、羊、牛和鸟类的物种的非人类腺病毒。因此，这种可以含有大约100至500bp长度的第一反向末端重复序列会根据所使用的腺病毒血清型而变化。同样，用于包装腺病毒的信号序列也会根据所采用的腺病毒血清型而变化。

根据优选的特定实施方案，所述基因表达腺病毒载体包括的元件i.具有SEQ ID No 1的序列，或者具有与SEQ ID No 1有充分的同源性以发挥相同功能的任何其它序列。

同样，在本发明腺病毒杂交载体中元件ii.的性质也不是本发明的关键方面。所述元件ii.的功能是提高构建体的总大小，其可以是任何非编码的填充片段序列。优选所述序列是人非编码填充片段序列。甚至更加优选的是，该非编码填充片段序列是人基因组次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)的内含子区域。

优选地，所述的腺病毒杂交载体还包括定位在上述元件v.和元件vi.之间的元件vii.，其是第二非编码填充片段序列。

在本发明腺病毒杂交载体中，元件iii.的性质不是其关键方面。这种组织特异性启动子iii.优选是肿瘤特异性启动子。肿瘤特异性启动子的例子包括启动子AFP、端粒酶TERT、PAP(胰腺相关蛋白)、E2F和HIF。

根据本发明优选的特定实施方案，所述肿瘤特异性启动子具有与AFP启动子/增强子(AFP p+e)对应的序列SEQ ID No 7，或者与端粒酶TERT对应的序列SEQ ID No 15，或者分别与序列SEQ ID No 7或序列SEQ ID No 15有充分的同源性以发挥相同功能的任何其它序列。

在本发明腺病毒杂交载体中，元件iv.的性质不是其关键方面。元件iv.的α病毒序列优选衍生自Semliki Forest病毒(SFV)。然而，其可能使用衍生自任何属于披膜病毒科(Togaviridae family)的物种(例如SIN、RRV和VEE)的其它α病毒序列。

所述衍生自α病毒的cDNA链的序列部分地互补于α病毒RNA，优选包括(除了编码至少一种目的外源基因的序列外)：

a)α病毒复制所需的5’序列；

b)编码α病毒RNA的复制所需的非结构蛋白的序列；

c)α病毒的至少一种亚基因组启动子；以及

d)α病毒复制所需的3’序列。

优选地，元件iv.形成了功能上受启动子iii.控制的复制子，并且接着包括在iv.c)中的α病毒亚基因组启动子在功能上控制目的外源基因的表达。

根据优选的特定实施方案，元件iv.的序列a)至c)作为整体具有这样的序列，该序列选自SEQ ID No 3(SFV 5’-rep-Psg)或者任何其它与SEQ ID No：3有充分的同源性以发挥相同功能的序列，以及SEQID No 4(SFV 5’-rep-Psg-enh)或者任何其它与SEQ ID No 4有充分的同源性以发挥相同功能的序列。

根据特别优选的特定实施方案，元件iv.d)具有序列SEQ ID No5，或者任何其它与SEQ ID No 5有充分的同源性以发挥相同功能的序列。

在本发明α病毒-腺病毒杂交载体的元件iv.中，目的外源基因优选是治疗性基因或者报告基因，或者是它们的组合。不被认为是限制性的，所述治疗性基因优选选自哺乳动物白介素IL-12、集落刺激因子GMCSF、α-干扰素以及单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)。

在元件iv.中的目的外源基因还可以是报告基因。不被认为是限制性的，所述报告基因可选自LacZ、荧光素酶、tk和GFP。

治疗性基因特别优选是哺乳动物白介素IL-12，甚至更优选的是治疗性基因是人白介素，hIL-12。

所述基因表达腺病毒杂交载体可在元件iv中系列地包括一个或者多个(亚基因组启动子+目的外源基因)亚组合(subset)。

在本发明的腺病毒杂交载体中的元件v.的性质不是其关键方面。优选元件v.是SV40的多聚腺苷酸化序列。所述SV40的多聚腺苷酸化序列特别优选为序列SEQ ID No 6，或者任何其它与序列SEQ IDNo 6有充分的同源性以发挥相同功能的序列。

在本发明的腺病毒杂交载体中的元件vi.的性质不是其关键方面。根据优选的实施方案，所述基因表达腺病毒载体包括反向末端重复(ITR)序列作为元件vi.，其具有序列SEQ ID No 2或者任何其它与SEQID No 2有充分的同源性以能够发挥相同功能的序列。

在本发明的腺病毒杂交载体中的元件vii.的性质不是其关键方面。所述第二非编码填充片段序列可以是任何这样的序列。优选是人非编码序列，特别优选的是来自人粘粒C346的序列。

在本发明的腺病毒杂交载体可具有不同的长度，并优选具有在27kb至38kb之间的长度。

根据优选的特定实施方案，所述腺病毒杂交载体包括：作为第一反向末端重复序列的ITR 5’；作为第一填充片段序列的人基因组次黄嘌呤磷酸核糖转移酶HPRT的内含子区域；肿瘤特异性启动子AFP(p+e)；含有来自小鼠的白介素-12即mIL-12的SFV复制子序列；SV40的多聚腺苷酸化序列SV40 PolyA；作为第二填充片段序列的人基因组粘粒C346即C346；以及作为第二反向末端重复序列的ITR 3’。

根据其它优选的特定实施方案，所述腺病毒杂交载体包括：作为第一反向末端重复序列的ITR 5’；作为第一填充片段序列的人基因组次黄嘌呤磷酸核糖转移酶HPRT的内含子区域；肿瘤特异性启动子AFP(p+e)；含有LacZ的SFV复制子序列；SV40的多聚腺苷酸化序列SV40 PolyA；作为第二填充片段序列的人基因组粘粒C346即C346；以及作为第二反向末端重复序列的ITR 3’。

根据特别优选的其它实施方案，所述腺病毒杂交载体包括：作为第一反向末端重复序列的ITR 5’；作为第一填充片段序列的人基因组次黄嘌呤磷酸核糖转移酶HPRT的内含子区域；肿瘤特异性启动子AFP(p+e)；含有人白介素-12hIL-12的SFV复制子序列；SV40的多聚腺苷酸化序列SV40 PolyA；作为第二填充片段序列的人基因组粘粒C346即C346；以及作为第二反向末端重复序列的ITR 3’。

根据本发明优选的特定实施方案，所述基因表达腺病毒杂交载体具有序列SEQ ID No 8，或者任何其它与SEQ ID No 8有充分的同源性以发挥相同功能的序列。

根据本发明其它优选的特定实施方案，所述基因表达腺病毒杂交载体具有序列SEQ ID No 9，或者任何其它与SEQ ID No 9有充分的同源性以发挥相同功能的序列。

根据本发明其它优选的特定实施方案，所述基因表达腺病毒杂交载体具有序列SEQ ID No 10，或者任何其它与SEQ ID No 10有充分的同源性以发挥相同功能的序列。

本发明还涉及获得所述腺病毒杂交载体的方法，其包括通过基因工程技术将上述的腺病毒杂交载体的元件i.至vi.或者元件i.至vii.进行组装。

本发明还涉及所述杂交载体在将遗传物质转入细胞中的用途，更具体的是在将外源基因导入真核细胞并进行表达中的用途，其中所述真核细胞可为腺病毒的靶细胞。所述用途包括将向个体给予所述杂交载体。

以本发明的腺病毒杂交载体感染肿瘤细胞导致SFVα病毒复制子的mRNA从肿瘤特异性启动子转录，因此Rep基因会被翻译，SFV的RNA会被扩增。Rep还会产生SFV的亚基因组RNA，治疗性基因或者报告基因将从其以高水平表达。由被感染细胞分泌的治疗性基因产物将会在感染位点激活免疫细胞。SFV的复制将会进一步诱导所感染细胞的凋亡，这导致从凋亡细胞释放肿瘤抗原，肿瘤抗原能够被抗原递呈细胞(APC)捕获，进而激活针对肿瘤的免疫应答。然而，如果这种杂交载体感染非肿瘤细胞，SFV复制子的mRNA将不会被转录，因此不会出现转基因表达或者凋亡。

优选地，使用本发明的腺病毒杂交载体感染肿瘤细胞，这样SFV复制子的mRNA从肿瘤特异性启动子AFP转录，因此Rep基因会被翻译，SFV的RNA会被扩增。Rep也将产生SFV的亚基因组RNA，mIL-12或者hIL-12将从其以高水平进行表达。由被感染细胞分泌的mIL-12或者hIL-12将会在感染位点激活免疫细胞。SFV的复制将会进一步诱导所感染细胞的凋亡，这导致从凋亡细胞释放肿瘤抗原，肿瘤抗原能够被抗原递呈细胞(APC)捕获，进而激活针对肿瘤的免疫应答。然而，如果这种杂交载体感染非肿瘤细胞，SFV复制子的mRNA将不会被转录，因此不会出现转基因表达或者凋亡。

本发明的另一目的是前述腺病毒杂交载体在将遗传物质转入细胞、优选肿瘤细胞的方法中的用途，其包括将所述杂交载体给予个体。更优选地，所述细胞是表达AFP的肿瘤细胞。

本发明另一目的是所述腺病毒杂交载体在制备治疗肿瘤的有效药物中的用途，以及在诱导针对外源抗原的免疫应答中的用途。所述用途包括将所述药物给予个体。

本发明的另一目的是药物组合物，其至少包括根据本发明所述的腺病毒杂交载体，及其在治疗肿瘤的方法中的用途，或者在诱导针对外源抗原的免疫应答中的用途。

优选所述药物组合物包括本发明的腺病毒杂交载体，其中所述目的外源基因是哺乳动物白介素，IL-12，优选人白介素hIL-12。所述用途包括将包含所述杂交载体的药物组合物给予个体。

本发明还涉及通过使用本发明的杂交载体治疗癌症的方法，所述方法包括将所述杂交载体给予个体。

因此，根据本发明优选的实施方案，AFP(p+e)被选作肿瘤特异性启动子，构建了两种腺病毒杂交载体，分别为Ad/AFP-SFV-LacZ和Ad/AFP-SFV-mIL-12，其中SFV复制子被AFP启动子所控制，插入的报告基因LacZ以及治疗性基因IL-12处于SFV亚基因组启动子的控制下；并制备了两个无肠腺病毒载体Ad/AFP-LacZ和Ad/AFP-mIL-12作为对照载体，它们携带直接被AFP启动子控制的LacZ和来自小鼠的IL-12。已显示本发明的杂交载体比目前所使用的对照载体更有效的发挥作用。

根据本发明，已显示载体Ad/AFP-SFV-mIL-12可为用于治疗表达AFP的HCC(肝癌)肿瘤的载体。

也已经显示，将在大多数恶性肿瘤中被广泛激活的其它肿瘤启动子(例如端粒酶启动子，TERT)用于控制SFV能够将杂交载体的应用(例如本发明的应用)转化为治疗所有类型癌症的通用策略。

进一步以及有利的是，本发明的杂交载体特异性地与肿瘤细胞发挥作用，并破坏肿瘤细胞，而不需要加入治疗性基因。另外，显示本发明的杂交载体在其含有治疗性基因如IL-12时，将有利地诱导有效的抗肿瘤活性。

附图说明

图1(A)：表示本发明实施方案的杂交载体Ad-SFV的图解，含有无肠腺病毒序列，其中插入的SFV复制子处于AFP启动子/增强子(AFP p+e)的控制下，并含有外源mIL-12基因，其置于SFV亚基因组启动子(Pr sg)的控制下。图1(B)表示本发明杂交载体的抗肿瘤活性：在以该杂交载体感染HCC肿瘤细胞后(右)，由于在杂交载体中存在含有mIL-12的SFV复制子，所以出现了mIL-12的高水平表达，这将在感染位点激活免疫细胞。SFV的复制还将诱导被感染细胞的凋亡。然而，如果该杂交载体感染非肿瘤细胞，SFV复制子的mRNA将不会被转录，由此将不会有转基因表达或者凋亡。在该图中：

-ITR，腺病毒反向末端重复序列；

-ψ，腺病毒包装信号；

-HPRT和C346，分别为来自人基因组次黄嘌呤磷酸核糖转移酶的内含子区域的序列或者来自人粘粒C346的序列；

-PolyA，多聚腺苷酸化信号(例如SV40的)；

-APC，抗原递呈细胞。

图2表示无肠腺病毒杂交载体和无肠腺病毒载体的结构。AFP-SFV-LacZ和AFP-SFV-mIL-12是杂交腺病毒载体，其中SFV复制子处于AFP启动子/增强子(AFP p+e)的控制下，克隆的外源基因LacZ或mIL-12分别处于SFV亚基因组启动子(Pr sg)的控制下。AFP-lacZ和AFP-mIL-12是腺病毒载体，其含有直接受AFP(p+e)控制的LacZ或者mIL-12。SFV nsp l-4，SFV的非结构蛋白。

图3表示在体外以Ad-SFV杂交载体：AFP-mIL-12(AFP-12)、AFP-SFV-mIL-12(AFP-SFV-12)或者以对照载体AdCMVmIL-12(CMV-12)感染后，mIL-12在表达AFP的肝癌细胞HCC(A)以及非衍生自HCC的细胞(B)中的特异性表达。检测了不同的感染复数“moi”(10，100和1000)。Hep3B、Huh-7、HepG2和PLC/PRF/5：HCC细胞系；Hela、A549、MHC1、SK-Hep-1和Clon 9：非衍生自HCC的细胞系。图3B只显示对应于1000moi的表达。

图4表示在体外以杂交载体AFP-SFV-lacZ或者以对照载体AFP-LacZ以不同“moi”(10，100或1000)感染后，β-gal在4种细胞系(Hep3B，Huh-7，HepG2和PLC/PRF/5)中的特异性表达。

图5表示对以AFP-LacZ和AFP-SFV-LacZ感染的HCC细胞系中β-gal表达的分析。以AFP-LacZ(A-C)或AFP-SFV-LacZ(D-F)感染并用X-Gal进行染色的细胞显微图片。A和D，Hep3B；B和E，Huh7；C和F，HepG2。

图6表示在体外以1000“moi”腺病毒载体AFP-mIL-12(AFP-12)或者AFP-SFV-mIL-12(AFP-SFV-12)感染的HCC细胞系Hep3B(A)和Huh-7(B)中IL-12的表达动力学。

图7表示在体外以载体AFP-IL-12(AFP-12)、AFP-SFV-IL-12(AFP-SFV-12)、AFP-LacZ、AFP-SFV-LacZ或对照载体Ad/CMVmIL-12(CMV-12)感染HCC细胞系Hep3B(A)和McA-RH7777后所诱导的细胞死亡。细胞存活率显示为在被感染的孔中活细胞与未感染的对照孔中活细胞相比的百分比。

图8表示在以1000“moi”的载体AFP-mIL-12(A和B)或AFP-SFV-mIL-12(C-F)感染后，SFV Rep在HCC细胞Hep3B(A-D)和Huh-7(E和F)中的表达。感染两天后，将细胞进行固定，并使用Rep的特异抗体通过免疫荧光进行分析。在带有FITC滤光片的荧光显微镜下对表达Rep的细胞进行观察(A，C，和E)，而以带有UV滤光片的荧光显微镜对所有细胞中以DAPI染色的细胞核进行观察(B，D和F)。

图9表示使用无肠杂交载体在体内在Huh-7肿瘤中进行的基因转移(A-D)，基因转移的效率以及凋亡的诱导。通过以1×10¹⁰病毒颗粒/动物向瘤体内注射载体AFP-LacZ(n＝4)或AFP-SFV-LacZ(n＝4)对在免疫缺陷裸鼠中建立的人Huh-7肿瘤进行处理。在给予所述病毒三天后，处死小鼠，并通过使用X-Gal染色对肿瘤切片进行分析以研究转基因表达(A-B)，或者通过使用TUNEL研究凋亡的诱导(C-D)。A，C：接受AFP-LacZ的肿瘤的显微照片。B，D：接受AFP-SFV-LacZ的肿瘤的显微照片。(E-G)，无肠杂交载体基因表达的特异性。将健康Balb/c小鼠静脉注射1×10¹⁰载体AFP-LacZ(E)、AFP-SFV-LacZ(F)或Ad/CMV-LacZ(G)的病毒颗粒。显示了接种后三天并用X-Gal进行染色后，所拍摄的肝组织切片的显微照片。

图10表示以杂交载体处理HCC肿瘤。通过将McH-RH7777细胞植入大鼠肝脏内，建立原位HCC肿瘤。当所述肿瘤达到直径为7至10mm的尺寸时，使用10¹¹(A-C)或者2×10¹¹(D-G)AFP-mIL-12、AFP-SFV-mIL-12病毒颗粒或者作为对照的盐水溶液对动物进行处理。在给予盐水溶液(A和E)、AFP-mIL-12(B和F)或AFP-SFV-mIL-12(C和G)15天和30天后检测到的肿瘤尺寸。G；动物存活率。

图11表示在接种表达IL-12的载体的大鼠中的毒性研究。测定大鼠血清中转氨酶(GPT，GOLT和GGTL)(A)或IL-12(B)的水平，其中所述大鼠在肝脏携带HCC肿瘤并且已在瘤体内接种了腺病毒载体AFP-SFV-IL-12、AFP-SFV-mIL-12、α病毒载体SFV-IL-12或者盐水溶液。

图12表示使用苏木精/曙红对以腺病毒杂交载体处理的大鼠的肝脏切片进行的染色。通过瘤体内注射盐水溶液(A)、腺病毒载体AFP-IL-12(B)、AFP-SFV-IL-12(C)或者SFV-IL-12病毒颗粒(D)对携带HCC肿瘤的大鼠进行处理。在处理后三天，将动物处死，并取出肝脏，使用甲醛进行固定，获取切片并以苏木精/曙红染色。黑色箭头表示具有嗜曙红肝细胞的区域。

图13A和13B分别表示质粒pGL3/AFP和pBS/mIL-12的限制性图谱。

图14A和14B分别表示质粒pTGC3001和pTGC3011的限制性图谱。

图15A和15B分别表示质粒pTGC3012和pTGC3013的限制性图谱。

图16表示质粒pTGC3014的限制性图谱。

发明实施方式

质粒

pGEM-T“简易”(pGEM-T″easy″)和pCMVb是从美国Promega获得，pBS-SK+来自美国Stratagene。pSTK120是由Kochanek博士友好赠予(University of Ulm，Germany)。在Berglund P.等人在“Enhancingimmune responses using suicidal DNA vaccines(使用自杀性DNA疫苗增强免疫反应)”Nature Biotechnology 1998，16：562-565中已经描述了pBK-SFV-1和pBK-SFV-3。在我们实验室中制备了pGL3/AFP和pBS/mIL-12(Yonglian Sun，Cheng Qian，Dacheng Peng and Jesús Prieto.2000.Gene transfer to liver cancer cells of B7-1 in addition to IL-12changes immunoeffector mechanisms and suppresses Th1 cytokineproduction induced by IL-12alone(除了IL-12外B7-1基因转入肝癌细胞改变免疫效应子机制并抑制由IL-12单独诱导的Th1细胞因子产生)Human Gene Therapy 11：127-138)。

对于构建pGL3/AFP，通过PCR扩增人基因组DNA得到了AFP启动子/增强子(p+e)区域。用于扩增AFP启动子(AFP pro)的引物是CTCTAGATTTTCTGCCCCAAAGAGCTC和CGGGATCCTGTTATTGGCAGTGGTGGAA。用于扩增AFP增强子的引物是CGGAATTCGCCTGTCATACAGCTAATAA和CTCTAGACTGTCAAATAAGTGG CCTGG。将启动子(217个碱基对)和增强子(785个碱基对)的序列克隆到pGEM-T质粒内。接着，通过测序对所扩增的片段进行确认。通过使用Xba I/BamHI进行限制性酶切将AFP启动子从pGEM-T/AFP-p质粒切出，并通过平末端连接插入以Sma I消化的pGL3-基础(pGL3-basic)质粒中。以这种方式得到了pGL3/AFP-p质粒。通过使用Xba I/Eco RI进行限制性酶切将AFP增强子从pGEM-T/AFP-e质粒切出，并通过平端连接插入以Nhe I消化的pGL3/AFP-p质粒，最终得到了pGL3/AFP质粒。

细胞系和组织培养

从ATCC获得了人HCC细胞系Hep3B、PLC/PRF/5、HepG2和SK-Hep-1、人宫颈上皮腺癌细胞系HeLa、人肺癌细胞系A549、人胚肾细胞系293、大鼠HCC细胞McA-RH7777、MHC1和正常大鼠肝细胞的Clone 9以及大鼠HCC细胞系Hepa1-6。表达Cre重组酶的293细胞(293Cre4)是从Merck Research Laboratories获得。将Hep3B、PLC/PRF/5、HeLa、SK-Hep-1、Clone 9、Huh-7和Hepa1-6细胞在DMEM培养基中进行培养，其中该DMEM培养基补充了10％的经过热失活的胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉素。将HepG2和A549细胞在RPMI 1640培养基中进行培养，其中该RPMI 1640培养基补充了10％的经过热失活的FBS和青霉素/链霉素。将McH-RH7777和MHC1细胞在补充了20％马血清和5％FBS的DMEM培养基中进行培养。将293Cre4细胞在补充了10％FBS和0.4mg/ml G418的DMEM培养基中进行培养。

动物

从Charles Rivers Laboratories(Barcelona，Spain)获得七周龄的雌性免疫缺陷裸鼠BALB/c。从CIFA(Animal Installations of theUniversity of Navarra)获得了年龄为4～6周的雄性Buffalo大鼠。在CIFA中小鼠与大鼠在通常条件下进行饲养。裸鼠接受经过辐射的食物以及经过高压灭菌的饮用水。对裸鼠的处理一直在层流室中进行。对动物的所有程序均遵守照料和使用实验动物的标准建议和规程进行。

构建载体

构建表达盒AFP-SFV

使用pBK-SFV-1质粒(含有SFV复制子的全序列)作为模板通过PCR扩增了SFV的5′末端序列(1-292nt)。引物1在其5’末端含有SpeI限制性酶切位点(下划线部分)，接着是50nt的AFP启动子序列和SFV序列的起始20nt(斜体部分)：5’ACT AGT TAA CAG GCA TTGCCT GAA AAG AGT ATA AAA GAA TTTCAG CAT GAT TTT CCATGG CGG ATG TGT GAC ATA C-3’。引物2含有XhoI限制性酶切位点(下划线部分)，接着是SFV序列的19nt(斜体部分)：5’CTC GAG GATATC CAA GAT GAG TGT GT-3’。通过PCR产生342bp的DNA片段，并将其直接克隆入pGEM-T-easy质粒以产生pGEM-Te-SFV-1。通过测序确认在该质粒中没有出现PCR错误。通过使用Spe I和Xho I进行消化，从pGEM-Te-SFV-1释放该342bp的片段，并将其克隆入被同样酶消化的pGL3/AFP以产生pGL3/AFP-SFV-1，其具有完整的AFP启动子(217bp)和增强子(785bp)，接着是SFV的5’末端(SFV-1，含有292bp)。通过使用Mlu I/Xho I进行消化，从pGL3/AFP-SFV-1获得了AFP-SFV-1(1342bp)盒，使用Klenow进行处理并克隆进被EcoR V消化的pBS-SK+，这产生了pBS/AFP-SFV-1。通过Xba I/BamHI消化从pGL3/AFP切出SV40的后部多聚腺嘌呤(Poly A)(262bp)，使用Klenow进行平端化并插入同样使用Klenow进行平端化的pBS/AFP-SFV-1的Sal I位点，这样得到了pBS/AFP-SFV-1-pA。将含有单一Apa I和Nru I位点的多接头插入pBS/AFP-SFV-1-pA的BamHI和Xma I之间。通过使用Spe I/EcoR V进行消化，从pBK-SFV-1切出含有7985bp的SFV的3’末端序列，使用Klenow进行平端化，并插入pBS/AFP-SFV-1-pA的EcoR V位点，这得到了pBS/AFP-SFV-pA。

通过使用Not I消化，从pCMVb获得了LacZ报告基因，使用Klenow进行处理，并插入经过Klenow处理的pBS/AFP-SFV-pA的BamH I位点以形成pBS/AFP-SFV-LacZ-pA。通过使用Spe I/Xho I消化从pBS/mIL-12分离mIL-12盒，其含有被内部核糖体进入位点(IRES)连接的编码p35和p40亚基的基因，使用Klenow进行处理并插入也被Klenow平端化的pBS/AFP-SFV-mIL-12-pA的BamH I位点，这样产生了质粒pBS/AFP-SFV-mIL-12-pA。

构建杂交无肠腺病毒载体

如图2所示，构建了四种无肠腺病毒载体。AFP-SFV-lacZ和AFP-SFV-mIL-12含有被AFP启动子和增强子控制的SFV复制子序列。在这些载体中，报告基因LacZ或者治疗性基因mIL-12分别克隆在SFV亚基因组启动子的控制之下。AFP-lacZ和AFP-mIL-12也是无肠腺病毒载体，它们分别含有直接受AFP启动子/增强子控制的LacZ和mIL-12基因。下面描述了构建这些载体所采用的方法。为了产生具有充分克隆空间以容纳AFP-SFV-IL-12表达盒的腺病毒载体，将含有无肠腺病毒序列的pSTK120质粒进行修饰。为此，通过使用Apa I进行消化从pSTK120去除9kb的片段。另外，将含有Asc I和Sbf I的多聚接头插入该新质粒中，这得到了pTGC3001。该质粒含有左ITR、包装信号、来自HPRT和C346的填充片段DNA以及右ITR。通过Apa I消化，从pBS/AFP-SFV-lacZ-pA分离出AFP-SFV-LacZ盒，并插入pTGC3001的Apa I位点，这产生了pTGC3011。相似地，通过使用BssH II进行消化，从pBS/AFP-SFV-mIL-12-pA释放出AFP-SFV-mIL-12盒，使用Klenow进行处理，并插入同样以Klenow处理的pTGC3001的Asc I位点，以产生pTGC3012。

构建对照载体

构建无肠腺病毒载体AFP-LacZ

通过使用Mlu I/Xho I消化，从pGL3/AFP分离出AFP增强子/启动子(AFP p+e)序列，使用Klenow进行处理，并插入之前被EcoRI/Xho I消化并使用Klenow处理过的pCMVb。以此方式，将CMV中早期启动子(immediate early promoter)从pCMVb去除，并替换为AFP(p+e)以产生pAFPb。接着通过使用Xba I/Nar I从pAFPb切出AFP-LacZ盒(5077bp)，使用Klenow进行处理，并插入同样被Klenow平端化的pSTK120的Swa I位点，这产生了pTGC3013。

构建无壳腺病毒载体AFP-mIL-12

通过使用Xho I/Spe I消化，从pBS/mIL-12切出mIL-12框，并插入pGL3/AFP中产生了pAFP-mIL-12，其中所述pGL3/AFP之前被Xho I/Xba I消化，这从该质粒中去除了荧光素酶基因。通过使用BamHI/Sca I进行消化从pAFP-mIL-12切出了AFP-mIL-12盒(3760bp)，使用Klenow进行处理并插入被Swa I消化并同样被Klenow处理的pSTK120以产生pTGC3014。

回收无壳腺病毒载体

在使用Pme I进行消化，酚/氯仿提取以及乙醇沉淀后，将2μgpTGC3011、pTGC3012、pTGC3013或者pTGC3014 DNA分别转染入293Cre4细胞。转染后，使用辅助病毒AdLC8cluc感染细胞。根据先前的描述(Philip Ng.，Robin J.Parks，and Frank L Graham.Preparationof helper-dependent adenoviral vectors(制备依赖辅助物的腺病毒载体).Methods in Molecular Medicine，Vol.69，Gene Therapy Protocols，2^nd.Ed.69，371-88，2002；H.Zhou，L.Pastore，A.L.Beaudet.Helper-dependent adenoviral vectors(依赖辅助物的腺病毒载体).Methods in Enzymology，vol，346，177-198，2002；Hillgenberg M.等人，System for efficient helper-dependent minimal adenovirus constructionsand rescue(用于构建和回收有效的依赖辅助物的最小腺病毒的系统).Hum Gene Ther.，12；643-657，2001)进行后续大规模的扩增和制备步骤。通过CsCl梯度离心两次纯化所有的载体制备物。通过使用限制性内切酶消化分析所纯化的DNA载体，并显示没有序列重排(sequence rearrangement)。使用定量PCR进行无壳腺病毒和辅助病毒污染滴度的评价。总病毒颗粒与感染单位(iu)的比例是20∶1。辅助病毒颗粒的污染为大约0.5-1％。

定量PCR

为了确定辅助病毒污染的程度，使用TaqMan程序(TaqMan Probe#2)设计了用于Ad5 E4区域定量PCR的探针和引物，并由Sigma-Genosys Ltd.(引物)和Applied Biosystems(探针)进行合成。为了确定无壳腺病毒的滴度，使用TaqMan程序(TaqMan Probe #2)设计了用于LacZ和来自小鼠的mIL-12序列的定量PCR的探针和引物，并由Sigma-Genosys Ltd.(引物)和Applied Biosystems(探针)进行合成。为了确定由野生型Ad的污染，使用TaqMan程序(TaqMan Probe #2)设计了用于Ad5 E1区域定量PCR的探针和引物，并由Sigma-GenosysLtd.(引物)和Applied Biosystems(探针)进行合成。

体外实验

以无壳腺病毒载体感染的细胞中的转基因表达

以四种无壳腺病毒载体(AFP-LacZ，AFP-SFV-LacZ，AFP-mIL-12或者AFP-SFV-mIL-12)中的每一种分别以1000，100或10“moi”(颗粒/细胞)感染衍生自HCC的细胞系(Hep3B，Huh7，HepG2和PLC/PRF/5)、不是衍生自HCC的细胞系(A549，HeLa，MHCl和Clone 9)或者衍生自HCC但不表达AFP的细胞系(SK-Hep-1)。使用三种第一代腺病毒(Ad/CMV-mIL-12、Ad/CMV-LacZ和Ad/AFP-LacZ)作为对照。从孔中双份收集感染mIL-12载体的细胞的上清液和感染LacZ载体的细胞的裂解液，以分别确定mIL-12和β-半乳糖苷酶(β-gal)的水平。还使用X-gal对感染LacZ载体的细胞进行染色。使用ELISA试剂盒(Pharmingen，San Diego，CA)对mIL-12水平(p70)进行检测。使用ELISA试剂盒(Roche，Switzerland)对β-gal水平进行检测。检测以1000“moi”感染AFP-mIL-12、AFP-SFV-mIL-12或者对照载体Ad/CMV-mIL-12后，在HCC细胞(Hep3B，Huh7)中mIL-12表达的时程(time course)。感染后，每天收集上清液，进行5天。

在体外分析使用SFV杂交载体的转基因表达的特异性

为了检测使用前述重组载体的基因表达的特异性，将四种人HCC细胞系(Hep3B，HepG2，Huh7和PLC/PRF/5)，两种不是衍生自HCC的人细胞系(HeLa和A549)或者衍生自HCC但不表达AFP的细胞系(SK-Hep-1)以不同“moi”(10，100或者1000)的AFP-mIL-12、AFP-SFV-mIL-12或者作为阳性对照的Ad-CMV-mIL-12感染。感染两天后，收集上清并确定其mIL-12含量。其结果显示在图3(A)和(B)中。当以10或100“moi”用AFP-mIL-12感染时，在人HCC细胞中没有观察到mIL-12表达，只有在1000“moi”时才在某些细胞系中观察到非常低水平的mIL-12(图3A)。相反，以10、100或1000“moi”的AFP-SFV-mIL-12感染这些细胞则得到了剂量依赖形式的mIL-12表达(图3A)。在以10“moi”AFP-SFV-mIL-12感染的细胞中mIL-12的表达水平与在以1000“moi”AFP-mIL-12感染的细胞中所得到的水平相当。另外，以不同“moi”的AFP-SFV-mIL-12感染的HCC细胞中mIL-12的水平与以对照载体Ad-CMV-mIL-12感染的细胞中所得到的水平相当。然而，即使在使用最高“moi”(1000)时，以AFP-mIL-12或者AFP-SFV-mIL-12感染不表达AFP的细胞也不产生可检测水平的mIL-12(图3B)。在这些细胞中，只有对照载体Ad-CMV-mII-12能够产生高水平的mIL-12表达。

另一方面，使用LacZ-AFP-lacZ或者AFP-SFV-lacZ杂交载体以不同的“moi”(10，100或1000)感染四种HCC细胞系(Hep3B，Huh-7，HepG2和PLC/PRF/5)，并测定β-gal的特异性表达。在这种情况中得到了类似的数据，其结果表示在图4中。

图5表示以无肠腺病毒载体AFP-LacZ和AFP-SFV-lacZ感染HCC细胞后，接着使用X-gal进行染色的显微照片。以AFP-lacZ感染HCC细胞导致被感染细胞中的低表达水平，其只被微弱地染色。相反，以X-gal染色的强度反映出，使用AFP-SFV-lacZ感染HCC细胞导致高水平的β-gal表达。这项数据表示含有受AFP启动子控制的SFV复制子的杂交载体Ad-SFV可在表达AFP的肿瘤细胞中产生高水平的强烈转基因表达。

在体外mIL-12在HCC细胞中表达的时程

为了研究在以Ad-SFV杂交载体感染后在不同时间的mIL-12生成，以AFP-mIL-12或者以AFP-SFV-mIL-12感染两种HCC细胞系(Hep3B和Huh-7)，在感染后，每天收集上清液，进行5天。图6表示在感染上述细胞后，所得到的转基因表达结果。所述结果反映出在以AFP-SFV-mIL-12感染细胞后1至4天在mIL-12表达方面有稳定的提高(图6)。然而，在感染后第5天，mIL-12水平稍微降低。在被AFP-mIL-12感染的细胞中，表达水平非常低，整个过程中只注意到mIL-12生成的稍微增加。

细胞毒性检测-通过MTT掺入法评价细胞增殖

使用AFP-LacZ、AFP-SFV-LacZ、AFP-mIL-12、AFP-SFV-mIL-12或者Ad/CMV-mIL-12以1000“moi”感染HCC细胞(Hep3B，Huh7，MCH-RH7777，Hep1-6)。感染后5天，通过MTT测定(3-(4，5-二甲基噻唑基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物)确定细胞存活率。Mosmann，T.(1983)J.Immunol.Meth.65，55-63；Tada，H.等人(1986)J.Immunol.Meth.93，157-65。简言之，使用PBS对细胞清洗一次，将200μl新制备的MTT染料溶液加入到(48孔板中的)每个孔中。再培养细胞3至4小时，然后加入500μl溶解缓冲液。每个样品取100μl，用于在分光光度计中570nm波长处测定吸光度。

在体外使用Ad-SFV杂交载体感染HCC细胞后细胞死亡的诱导

已经描述过，SFV载体的复制在大多数脊椎动物来源的细胞中会通过凋亡诱导细胞死亡。为了分析是否在被Ad-SFV杂交载体感染的HCC细胞也是这种情况，使用这些载体感染Hep3B和Huh-7细胞，并在感染5天后确定细胞存活率。从图7可以看出，在被AFP-SFV-mIL-12或AFP-SFV-lacZ感染的细胞中，在这个感染后时间点的存活率低于20％。然而，使用AFP-mIL-12或AFP-lacZ或者对照载体AdCMVmIL-12感染同样的细胞并不影响细胞存活率。这些结果预示SFV在被AFP-SFV载体感染的细胞中复制。

通过免疫荧光检测SFV Rep

将HCC细胞(Hep3B，Huh7，MCH-RH7777)接种在6孔板的盖玻片上(1×10⁵细胞/孔)，并以1000“moi”的AFP-mIL-12、AFP-SFV-mIL-12或者Ad/CMV-mIL-12感染。在感染两天后，使用PBS清洗盖玻片两次，在-20℃下使用甲醇将细胞固定6分钟。再使用PBS将板清洗3次，并在室温(RT)下与含有0.5％明胶和0.25％BSA的PBS孵育30分钟以阻断非特异性结合。接着使用在封闭缓冲液中1∶1稀释的第一抗体(抗复制酶MAb)替换封闭缓冲液，并在室温下孵育30分钟。再以PBS-0.25％BSA将细胞清洗3次，并在室温下与在封闭缓冲液中1∶250稀释的第二抗体(偶联FITC的抗小鼠兔血清，Sigma)孵育30分钟。最后，使用PBS-0.25％BSA将细胞清洗3次，使用水清洗一次，并使用带有Dapi的Vecta覆盖物(Vecta shield with Dapi)将其布置在盖玻片上，以对细胞核染色。

在体外Ad-SFV杂交载体感染的细胞中SFV Rep的表达

在Ad-SFV杂交载体感染的HCC细胞中采用该蛋白质特异性的单克隆抗体通过免疫荧光检测SFV Rep的表达。图8显示以AFP-SFV-mIL-12或AFP-SFV-lacZ感染的HCC细胞表现出Rep的强细胞质阳性。相反，以AFP-mIL-12或者AFP-lacZ感染的细胞没有表现出染色。

体内实验

HCC异种移植物的诱导和体内基因转移效率和特异性的研究

收集Huh-7细胞并用无血清培养基清洗两次。将2×10⁶个细胞悬浮在100μl盐水血清中，并皮下注射(s.c.)入BALB/c裸鼠的右侧。接种这些细胞后四个星期，当肿瘤节达到直径6-8mm时，将1×10¹⁰稀释在80μl盐水中的AFP-LacZ(n＝4)或者AFP-SFV-LacZ(n＝4)的病毒颗粒瘤体内注射。对照动物(n＝3)在肿瘤内注射80μl盐水。在接种后第3天或者第6天处死小鼠。在这些时间，从每个动物中取出肿瘤和肝，包在O.C.T.(Sakura，Holland)中，并在-80℃下冷冻。将冷冻的组织进行切片并置于载玻片上进行用X-gal染色或者通过TUNEL进行分析。为了研究体内使用这些杂交载体进行感染的特异性，将正常Balb/c小鼠静脉以10¹⁰病毒颗粒/小鼠的剂量注射AFP-LacZ(n＝4)，AFP-SFV-LacZ(n＝4)或者Ad/CMV-LacZ。在接种后第3天将所述动物处死，并收集主要的器官，通过X-gal染色进行LacZ表达的分析。

免疫缺陷裸鼠内人HCC异种移植中Ad-SF杂交载体基因转移的效率

为了研究体内无肠杂交载体的转导效率，采用了基于能够表达AFP的人HCC模型。将Huh7细胞皮下接种到免疫缺陷Balb/c小鼠，并在30后产生肿瘤结节后，向动物瘤内注射1×10¹⁰个AFP-SFV-LacZ病毒颗粒或者作为对照的AFP-LacZ病毒颗粒。在注射这些病毒后3天或者6天将小鼠处死，并取出肿瘤和肝，使用X-gal进行染色。从图9A可以看出，在接受AFP-lacZ的动物的肿瘤切片中有微弱的转基因表达。相反，在接受AFP-SFV-LacZ的动物的肿瘤切片中有强烈的LacZ表达(图9B)。在接受AFP-LacZ或者AFP-SFV-LacZ的动物肝切片中没有观察到转基因表达，这预示所述载体可能限制在接种位置(数据未示出)。为了研究Ad-SFV杂交载体是否在感染肿瘤细胞中诱导凋亡，通过TUNEL技术分析所处理的肿瘤切片。在来自接种AFP-LacZ的小鼠的样品中没有观察到凋亡(图9C)。然而，在接受AFP-SFV-LacZ的动物的肿瘤中观察到了大量的凋亡细胞(图9D)。该数据预示Ad-SFV杂交载体不仅特异地在肿瘤中诱导基因表达，而且这些相同细胞中通过凋亡诱导选择性细胞死亡。

Ad-SFV杂交载体的体内特异性

为了显示杂交载体的特异性，将10¹⁰个AFP-LacZ、AFP-SFV-LacZ或者对照载体Ad/CMV-LacZ的病毒颗粒静脉注射入Balb/c小鼠中。在给予这些载体3天后，分析β-半乳糖苷酶在肝内的表达。如图9(E-F)所示，AFP-LacZ和AFP-SFV-LacZ都不能够在肝内诱导可检测的转基因表达。然而，在接受Ad/CMV-LacZ的动物中观察到在肝组织切片中高比例的β-半乳糖苷酶阳性细胞(图9G)。这些数据确认由杂交载体介导的表达对于是肿瘤细胞特异性的。

原位HCC诱导和体内基因治疗

将5×10⁵个McA-RH7777细胞接种到Buffalo大鼠的肝左叶。在接种肿瘤细胞10天后，在每个动物中出现了直径为7-10mm的单一肿瘤结节。使用10¹¹或2×10¹¹个AFP-mIL-12、AFP-SFV-mIL-12病毒颗粒或者使用盐水溶液作为对照对肿瘤进行处理。在处理2周和4周后，将动物麻醉并进行剖腹手术以观察肿瘤的发展。还进行了动物存活率的分析。通过检测每个肿瘤结节的长度和宽度并使用公式肿瘤体积＝(长度mm)×(宽度mm)²×0.5236(Janik等人，1975)来评估肿瘤的大小。

Buffalo大鼠中原位HCC处理的有效性

为了研究携带IL-12的Ad-SFV杂交载体抗肿瘤的有效性，通过在肝中植入大鼠McH-RH7777细胞，在大鼠中建立原位HCC肿瘤。选择该模型，因为已经证明McH-RH7777细胞表达AFP。在第一个实验中，使用一次瘤体内注射1×10¹¹个AFP-mIL-12、AFP-SFV-mIL-12病毒颗粒或者使用作为对照的盐水溶液对动物进行处理(图10A-C)。与对照动物相比，接受AFP-mIL-12的动物表现出肿瘤大小减小，而对照动物在整个实验中经历了稳定的肿瘤大小的增长(图10A-B)。然而，使用AFP-SFV-mIL-12的处理导致在1/4的被处理的大鼠中肿瘤的完全消退，两只动物中疾病稳定，1只动物中没有反应(图10C)。为了确认更大剂量的杂交载体是否能够提高抗肿瘤效果，进行了第二个实验，其中对动物在瘤内以2×10¹¹个AFP-mIL-12、AFP-SFV-mIL-12的病毒颗粒或者使用作为对照的盐水溶液处理(图10D-G)。如同在之前的实验中，接受AFP/IL-12载体的动物只表现出轻微的抗肿瘤反应，其结果是在12只接受处理的动物中，只有1只完全消退，4只动物具有比对照生长更慢的肿瘤，7只动物没有反应(图10E)。然而，使用AFP-SFV-IL-12载体处理具有更强的作用，在全部12只处理的动物中，在4只动物中诱导完全的肿瘤消退(33％)，6只动物中部分消退(50％)，2只动物中延迟肿瘤生长进展(16％)，以及在另外2只动物中没有反应(16％)(图10F)。在该第二项研究中，AFP/SFV-IL-12载体使处理动物的有50％的存活率，而在使用AFP-IL-12或者盐水溶液处理的动物中存活率为0％(图10G)。

体内毒性研究：确定血清转氨酶和Il-12水平和肝组织学研究

以2×10¹¹剂量的AFP-SFV-IL-12或者AFP-IL-12腺病毒载体或者以盐水溶液在瘤内处理大鼠，在接种4和8天后，收集血样。该研究还包括以10⁸个SFV-IL-12α病毒颗粒接种的大鼠。通过2000rpm离心15分钟从血中分离血清。使Hitachi 911自动分析仪(BoehringerMannheim，Germany)分析转氨酶水平。通过ELISA确定IL-12水平。通过在处理3天后，提取被接种动物的肝进行组织学研究。将该器官固定在甲醛中，包埋在石蜡中，并使用超薄切片机切片成6μm的厚度。接着将这些切片使用苏木精/曙红进行染色。

Ad-SFV杂交载体在大鼠中毒性的研究

为了评估与给予AFP-SFV-IL-12杂交载体相关的毒性，在经过以2×10¹¹个不同载体的病毒颗粒进行瘤内处理(参见之前部分)的大鼠血清中测定转氨酶(GOT、GPT和GGTL)的水平。该研究还包括一组在瘤内接种10⁸个α病毒载体SFV-IL-12的病毒颗粒的大鼠(图11A)。接种了AFP-SFV-IL-12或AFP-IL-12腺病毒载体的大鼠表现出非常低的转氨酶水平，其与接种盐水溶液的对照动物非常相似。然而，以SFV-IL-12颗粒处理的动物中转氨酶水平显著地高于其它组(p＜0.05)。在这项研究中，还确定了在相同的时间点出现在动物血清中的IL-12水平。在接种Ad AFP-SFV-IL-12或AFP-IL-12载体或者盐水溶液的动物的血清中没有检测到IL-12(图11B)，这预示这些载体中转基因的表达限于肿瘤，并暗示Ad-SFV杂交载体的毒性非常低。然而，使用SFV-IL-12病毒颗粒处理在短时间后诱导了IL-12的高血清水平，这种情况可能引起肝毒性。最后，在被苏木精/曙红染色的肝切片中通过组织分析完成了毒性研究，其中所述肝切片来自以前面所述的相同载体和相同剂量瘤内处理的大鼠(图12)。这项研究表明在接受盐水溶液的大鼠和接受AFP-SFV-IL-12或者AFP-IL-12腺病毒载体的大鼠中没有组织学差异。然而，在以SFV-IL-12病毒颗粒处理的大鼠的肝切片中观察到了嗜曙红干细胞和这些肝细胞的融合，这预示某种程度的毒性(黑箭头，图12D)。

                                序列表

<110>西玛生物医学信息公司

<120>用于在肿瘤细胞中有效给予和表达治疗性基因的腺病毒/α病毒杂交载体

<160>15

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>438

<212>DNA

<213>腺病毒

<400>1

aaacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat gagggggtgg     60

agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg acgtagtagt gtggcggaag    120

tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt    180

ttggtgtgcg ccggtgtaca caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg    240

tagtaaattt gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt cgcgggaaaa ctgaataaga    300

ggaagtgaaa tctgaataat tttgtgttac tcatagcgcg taatatttgt ctagggccgc    360

ggggactttg accgtttacg tggagactcg cccaggtgtt tttctcaggt gttttccgcg    420

ttccgggtca aagttggc                                                  438

<210>2

<211>161

<212>DNA

<213>腺病毒

<400>2

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tcacccgccc cgttcccacg ccccgcgcca cgtcacaaac tccaccccct cattatcata    120

ttggcttcaa tccaaaataa ggtatattat tgatgatgtt t                        161

<210>3

<211>7412

<212>DNA

<213>Semliki Forest病毒(SFV)

<400>3

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gctacgcgag agattaacca cccacgatgg ccgccaaagt gcatgttgat attgaggctg    120

acagcccatt catcaagtct ttgcagaagg catttccgtc gttcgaggtg gagtcattgc    180

aggtcacacc aaatgaccat gcaaatgcca gagcattttc gcacctggct accaaattga     240

tcgagcagga gactgacaaa gacacactca tcttggatat cggcagtgcg ccttccagga     300

gaatgatgtc tacgcacaaa taccactgcg tatgccctat gcgcagcgca gaagaccccg     360

aaaggctcga tagctacgca aagaaactgg cagcggcctc cgggaaggtg ctggatagag     420

agatcgcagg aaaaatcacc gacctgcaga ccgtcatggc tacgccagac gctgaatctc     480

ctaccttttg cctgcataca gacgtcacgt gtcgtacggc agccgaagtg gccgtatacc     540

aggacgtgta tgctgtacat gcaccaacat cgctgtacca tcaggcgatg aaaggtgtca     600

gaacggcgta ttggattggg tttgacacca ccccgtttat gtttgacgcg ctagcaggcg     660

cgtatccaac ctacgccaca aactgggccg acgagcaggt gttacaggcc aggaacatag     720

gactgtgtgc agcatccttg actgagggaa gactcggcaa actgtccatt ctccgcaaga     780

agcaattgaa accttgcgac acagtcatgt tctcggtagg atctacattg tacactgaga     840

gcagaaagct actgaggagc tggcacttac cctccgtatt ccacctgaaa ggtaaacaat     900

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gattcctagt gtgcaagacc acagacactg tcaaaggaga aagagtctca ttccctgtat    1080

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caccggagga cgcacagaag ttgttagtgg gattgaatca gaggatagtt gtgaacggaa    1200

gaacacagcg aaacactaac acgatgaaga actatctgct tccgattgtg gccgtcgcat    1260

ttagcaagtg ggcgagggaa tacaaggcag accttgatga tgaaaaacct ctgggtgtcc    1320

gagagaggtc acttacttgc tgctgcttgt gggcatttaa aacgaggaag atgcacacca    1380

tgtacaagaa accagacacc cagacaatag tgaaggtgcc ttcagagttt aactcgttcg    1440

tcatcccgag cctatggtct acaggcctcg caatcccagt cagatcacgc attaagatgc    1500

ttttggccaa gaagaccaag cgagagttaa tacctgttct cgacgcgtcg tcagccaggg    1560

atgctgaaca agaggagaag gagaggttgg aggccgagct gactagagaa gccttaccac    1620

ccctcgtccc catcgcgccg gcggagacgg gagtcgtcga cgtcgacgtt gaagaactag    1680

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gctccaagtt ggcccccgtg caccctctag cagagcaggt gaaaataata acacataacg    1860

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aaagggagtt cgtcaacagg aaactatacc atattgccgt tcacggaccg tcgctgaaca    2040

ccgacgagga gaactacgag aaagtcagag ctgaaagaac tgacgccgag tacgtgttcg    2100

acgtagataa aaaatgctgc gtcaagagag aggaagcgtc gggtttggtg ttggtgggag    2160

agctaaccaa ccccccgttc catgaattcg cctacgaagg gctgaagatc aggccgtcgg    2220

caccatataa gactacagta gtaggagtct ttggggttcc gggatcaggc aagtctgcta    2280

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tcgtgttaac atgcttccga ggctgggcaa agcagctgca gttggactac cgtggacacg    2820

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agaaggtgaa tgaaaatccc ttgtatgccc ctgcgtcgga gcacgtgaat gtactgctga    2940

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acagactgtc actgagcagc gtagccatcc cgctgctgtc cacaggagtg ttcagcggcg    4440

gaagagatag gctgcagcaa tccctcaacc atctattcac agcaatggac gccacggacg    4500

ctgacgtgac catctactgc agagacaaaa gttgggagaa gaaaatccag gaagccattg    4560

acatgaggac ggctgtggag ttgctcaatg atgacgtgga gctgaccaca gacttggtga    4620

gagtgcaccc ggacagcagc ctggtgggtc gtaagggcta cagtaccact gacgggtcgc    4680

tgtactcgta ctttgaaggt acgaaattca accaggctgc tattgatatg gcagagatac    4740

tgacgttgtg gcccagactg caagaggcaa acgaacagat atgcctatac gcgctgggcg    4800

aaacaatgga caacatcaga tccaaatgtc cggtgaacga ttccgattca tcaacacctc    4860

ccaggacagt gccctgcctg tgccgctacg caatgacagc agaacggatc gcccgcctta    4920

ggtcacacca agttaaaagc atggtggttt gctcatcttt tcccctcccg aaataccatg    4980

tagatggggt gcagaaggta aagtgcgaga aggttctcct gttcgacccg acggtacctt    5040

cagtggttag tccgcggaag tatgccgcat ctacgacgga ccactcagat cggtcgttac    5100

gagggtttga cttggactgg accaccgact cgtcttccac tgccagcgat accatgtcgc    5160

tacccagttt gcagtcgtgt gacatcgact cgatctacga gccaatggct cccatagtag    5220

tgacggctga cgtacaccct gaacccgcag gcatcgcgga cctggcggca gatgtgcacc    5280

ctgaacccgc agaccatgtg gacctcgaga acccgattcc tccaccgcgc ccgaagagag    5340

ctgcatacct tgcctcccgc gcggcggagc gaccggtgcc ggcgccgaga aagccgacgc    5400

ctgccccaag gactgcgttt aggaacaagc tgcctttgac gttcggcgac tttgacgagc    5460

acgaggtcga tgcgttggcc tccgggatta ctttcggaga cttcgacgac gtcctgcgac    5520

taggccgcgc gggtgcatat attttctcct cggacactgg cagcggacat ttacaacaaa    5580

aatccgttag gcagcacaat ctccagtgcg cacaactgga tgcggtccag gaggagaaaa    5640

tgtacccgcc aaaattggat actgagaggg agaagctgtt gctgctgaaa atgcagatgc    5700

acccatcgga ggctaataag agtcgatacc agtctcgcaa agtggagaac atgaaagcca    5760

cggtggtgga caggctcaca tcgggggcca gattgtacac gggagcggac gtaggccgca    5820

taccaacata cgcggttcgg tacccccgcc ccgtgtactc ccctaccgtg atcgaaagat    5880

tctcaagccc cgatgtagca atcgcagcgt gcaacgaata cctatccaga aattacccaa    5940

cagtggcgtc gtaccagata acagatgaat acgacgcata cttggacatg gttgacgggt    6000

cggatagttg cttggacaga gcgacattct gcccggcgaa gctccggtgc tacccgaaac    6060

atcatgcgta ccaccagccg actgtacgca gtgccgtccc gtcacccttt cagaacacac    6120

tacagaacgt gctagcggcc gccaccaaga gaaactgcaa cgtcacgcaa atgcgagaac    6180

tacccaccat ggactcggca gtgttcaacg tggagtgctt caagcgctat gcctgctccg    6240

gagaatattg ggaagaatat gctaaacaac ctatccggat aaccactgag aacatcacta    6300

cctatgtgac caaattgaaa ggcccgaaag ctgctgcctt gttcgctaag acccacaact    6360

tggttccgct gcaggaggtt cccatggaca gattcacggt cgacatgaaa cgagatgtca    6420

aagtcactcc agggacgaaa cacacagagg aaagacccaa agtccaggta attcaagcag    6480

cggagccatt ggcgaccgct tacctgtgcg gcatccacag ggaattagta aggagactaa    6540

atgctgtgtt acgccctaac gtgcacacat tgtttgatat gtcggccgaa gactttgacg    6600

cgatcatcgc ctctcacttc cacccaggag acccggttct agagacggac attgcatcat    6660

tcgacaaaag ccaggacgac tccttggctc ttacaggttt aatgatcctc gaagatctag    6720

gggtggatca gtacctgctg gacttgatcg aggcagcctt tggggaaata tccagctgtc    6780

acctaccaac tggcacgcgc ttcaagttcg gagctatgat gaaatcgggc atgtttctga    6840

ctttgtttat taacactgtt ttgaacatca ccatagcaag cagggtactg gagcagagac    6900

tcactgactc cgcctgtgcg gccttcatcg gcgacgacaa catcgttcac ggagtgatct    6960

ccgacaagct gatggcggag aggtgcgcgt cgtgggtcaa catggaggtg aagatcattg    7020

acgctgtcat gggcgaaaaa cccccatatt tttgtggggg attcatagtt tttgacagcg    7080

tcacacagac cgcctgccgt gtttcagacc cacttaagcg cctgttcaag ttgggtaagc    7140

cgctaacagc tgaagacaag caggacgaag acaggcgacg agcactgagt gacgaggtta    7200

gcaagtggtt ccggacaggc ttgggggccg aactggaggt ggcactaaca tctaggtatg    7260

aggtagaggg ctgcaaaagt atcctcatag ccatggccac cttggcgagg gacattaagg    7320

cgtttaagaa attgagagga cctgttatac acctctacgg cggtcctaga ttggtgcgtt    7380

aatacacaga attctgatta tagcgcacta ttatagcacc atgaattaca tccctacgca    7440

aacgttttac ggccgccggt ggcgcccgcg cccggcggcc cgtccttggc cgttgcaggc    7500

cactccggtg gctcccgtcg t                                              7521

<210>5

<211>841

<212>DNA

<213>Semliki Forest病毒(SFV)

<400>5

attacatccc tacgcaaacg ttttacggcc gccggtggcg cccgcgcccg gcggcccgtc     60

cttggccgtt gcaggccact ccggtggctc ccgtcgtccc cgacttccag gcccagcaga    120

tgcagcaact catcagcgcc gtaaatgcgc tgacaatgag acagaacgca attgctcctg    180

ctaggcctcc caaaccaaag aagaagaaga caaccaaacc aaagccgaaa acgcagccca    240

agaagatcaa cggaaaaacg cagcagcaaa agaagaaaga caagcaagcc gacaagaaga    300

agaagaaacc cggaaaaaga gaaagaatgt gcatgaagat tgaaaatgac tgtatcttcg    360

tatgcggcta gccacagtaa cgtagtgttt ccagacatgt cgggcaccgc actatcatgg    420

gtgcagaaaa tctcgggtgg tctgggggcc ttcgcaatcg gcgctatcct ggtgctggtt    480

gtggtcactt gcattgggct ccgcagataa gttagggtag gcaatggcat tgatatagca    540

agaaaattga aaacagaaaa agttagggta agcaatggca tataaccata actgtataac    600

ttgtaacaaa gcgcaacaag acctgcgcaa ttggccccgt ggtccgcctc acggaaactc    660

ggggcaactc atattgacac attaattggc aataattgga agcttacata agcttaattc    720

gacgaataat tggattttta ttttattttg caattggttt ttaatatttc caaaaaaaaa    780

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    840

a                                                                    841

<210>6

<211>260

<212>DNA

<213>SV40病毒

<400>6

agagtcgggg cggccggccg cttcgagcag acatgataag atacattgat gagtttggac     60

aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg    120

ctttatttgt aaccattata agctgcaata aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt    180

ttatgtttca ggttcagggg gaggtgtggg aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca    240

aatgtggtaa aatcgataag                                                260

<210>7

<211>940

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>7

aattcgcctg tcatacagct aataattgac cataagacaa ttagatttaa attagttttg     60

aatctttcta ataccaaagt tcagtttact gttccatgtt gcttctgagt ggcttcacag    120

acttatgaaa aagtaaacgg aatcagaatt acatcaatgc aaaagcattg ctgtgaactc    180

tgtacttagg actaaacttt gagcaataac acacatagat tgaggattgt ttgctgttag    240

catacaaact ctggttcaaa gctcctcttt attgcttgtc ttggaaaatt tgctgttctt    300

catggtttct cttttcactg ctatctattt ttctcaacca ctcacatggc tacaataact    360

gtctgcaagc ttatgattcc caaatatcta tctctagcct caatcttgtt ccagaagata    420

aaaagtagta ttcaaatgca catcaacgtc tccacttgga gggcttaaag acgtttcaac    480

atacaaaccg gggagttttg cctggaatgt ttcctaaaat gtgtcctgta gcacataggg    540

tcctcttgtt ccttaaaatc taattacttt tagcccagtg ctcatcccac ctatggggag    600

atgagagtga aaagggagcc tgattaataa ttacactaag tcaataggca tagagccagg    660

actgtttggg taaactggtc actttatctt aaactaaata tatccaaaac tgaacatgta    720

cttagttact aagtctttga ctttatctca ttcataccac tcagctttat ccaggccact    780

tatttgacag tctagctagc ccctagattt tctgccccaa agagctctgt gtccttgaac    840

ataaaataca aataaccgct atgctgttaa ttattggcaa atgtcccatt ttcaacctaa    900

ggaaatacca taaagtaaca gatataccaa caaaaggtta                          940

<210>8

<211>28892

<212>DNA

<213>嵌合的

<220>

<221>5′ITR

<222>(1)..(438)

<223>第一反向末端重复序列和用于包装的信号序列

<220>

<221>填充片段

<222>(439)..(10990)

<223>第一非编码填充片段序列

<220>

<221>AFP(p+e)

<222>(10991)..(11930)

<223>α甲胎蛋白(AFP)启动子.包括启动子区域(p)和增强子区域(e)

<220>

<221>SFV

<222>(12257)..(19366)

<223>SFV复制子序列区域

<220>

<221>mIL-12

<222>(19389)..(21722)

<223>小鼠白介素-12(IL12)基因序列(外源基因)

<220>

<221>PolyA

<222>(22621)..(22880)

<223>衍生自SV40病毒的多聚腺苷酸化序列

<220>

<221>填充片段

<222>(22881)..(28731)

<223>第二填充片段非编码序列

<220>

<221>3′ITR

<222>(28732)..(28892)

<223>第二反向末端重复序列

<400>8

aaacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat gagggggtgg     60

agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg acgtagtagt gtggcggaag    120

tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt    180

ttggtgtgcg ccggtgtaca caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg    240

tagtaaattt gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt cgcgggaaaa ctgaataaga    300

ggaagtgaaa tctgaataat tttgtgttac tcatagcgcg taatatttgt ctagggccgc    360

ggggactttg accgtttacg tggagactcg cccaggtgtt tttctcaggt gttttccgcg     420

ttccgggtca aagttggcgt tttgatatca agcttatcga taccgtcaaa caagtcttta     480

attcaagcaa gactttaaca agttaaaagg agcttatggg taggaagtag tgttatgatg     540

tatgggcata aagggtttta atgggatagt gaaaatgtct ataataatac ttaaatggct     600

gcccaatcac ctacaggatt gatgtaaaca tggaaaaggt caaaaacttg ggtcactaaa     660

atagatgatt aatggagagg atgaggttga tagttaaatg tagataagtg gtcttattct     720

caataaaaat gtgaacataa ggcgagtttc tacaaagatg gacaggactc attcatgaaa     780

cagcaaaaac tggacatttg ttctaatctt tgaagagtat gaaaaattcc tattttaaag     840

gtaaaacagt aactcacagg aaataccaac ccaacataaa atcagaaaca atagtctaaa     900

gtaataaaaa tcaaacgttt gcacgatcaa attatgaatg aaattcacta ctaaaattca     960

cactgatttt gtttcatcca cagtgtcaat gttgtgatgc atttcaattg tgtgacacag    1020

gcagactgtg gatcaaaagt ggtttctggt gcgacttact ctcttgagta tacctgcagt    1080

cccctttctt aagtgtgtta aaaaaaaagg gggatttctt caattcgcca atactctagc    1140

tctccatgtg ctttctagga aacaagtgtt aacccacctt atttgtcaaa cctagctcca    1200

aaggactttt gactccccac aaaccgatgt agctcaagag agggtatctg tcaccagtat    1260

gtatagtgaa aaaagtatcc caagtcccaa cagcaattcc taaaaggagt ttatttaaaa    1320

aaccacacac acctgtaaaa taagtatata tcctccaagg tgactagttt taaaaaaaca    1380

gtattggctt tgatgtaaag tactagtgaa tatgttagaa aaatctcact gtaaccaagt    1440

gaaatgaaag caagtatggt ttgcagagat tcaaagaaaa tataagaaaa cctactgttg    1500

ccactaaaaa gaatcatata ttaaatatac tcacacaata gctcttcagt ctgataaaat    1560

ctacagtcat aggaatggat ctatcactat ttctattcag tgctttgatg taatccagca    1620

ggtcagcaaa gaatttatag ccccccttga gcacacagag ggctacaatg tgatggcctc    1680

ccatctcctt catcacatct cgagcaagac gttcagtcct acagaaataa aatcaggaat    1740

ttaatagaaa gtttcataca ttaaacttta taacaaacac ctcttagtca ttaaacttcc    1800

acaccaacct gggcaatata gtgagacccc atgcctgcaa aaaaaaaaaa attagccagg    1860

catggtagca tgtacctgta gtcccagcta cttgagaggt gaggtgggaa aatcacttta    1920

gtgcaggatg ttgaggctgg agtgaactgt gattgtgcca ctgcactcca gcctggacaa    1980

tagagcaaga ccttgtctca aaaaaatgca ttaaaaattt tttttaaatc ttccacgtat    2040

cacatccttt gccctcatgt ttcataaggt aaaaaatttg ataccttcaa aaaaaccaag    2100

cataccacta tcataatttt ttttaaatgc aaataaaaac aagataccat tttcacctat    2160

cagactggca ggttctgatt aaatgaaatt ttctggataa tatacaatat taagagagac    2220

tgtagaaact gggccagtgg ctcatgcctg taatcccagc actttgggag gctgggtaac    2280

atggcgaacc ctgtttctac aaaataaaaa tattagctgg gagtggtggc gcacacctat    2340

agtcccagct actcaggagg ctgaggtgga aggatcgctt gaacccagga ggttgagact    2400

gcagtgaact gtgatcattc tgctgcactg caccccagcc tgggcaacag agaccttgtc    2460

tcaaaaaaaa aaaaaaaaga gacaaattgt gaagagaaag gtactctcat ataacatcag    2520

gagtataaaa tgattcaact tcttagagga aaatttggca ataccaaaat attcaataaa    2580

ctctttcccc ttgacccaga aattccactt gaataaagct gaacaagtac caaacatgta    2640

aaagaatgtt tcttctagta cagtcggtaa gaacaaaata gtgtctatca atagtggact    2700

ggttaaatca gttatggtat ctccataaga cagaatgcta tgcaaccttt aaaatatatt    2760

agatagctct agacacacta atattaaaag tgtccaataa catttaaaac tatactcata    2820

cgttaaaata taaatgtata tatgtacttt tgcatatagt atacatgcat aggccagtgc    2880

ttgagaagaa atgtgtacag aaggctgaaa ggagagaact ttagtcttct tgtttatggc    2940

ctccatagtt agaatatttt ataacacaaa tattttgata ttataatttt aaaataaaaa    3000

cacagaatag ccagacatac aatgcaagca ttcaatacca ggtaaggttt ttcactgtaa    3060

ttgacttaac agaaaatttt caagctagat gtgcataata ataaaaatct gaccttgcct    3120

tcatgtgatt cagccccagt ccattaccct gtttaggact gagaaatgca agactctggc    3180

tagagttcct tcttccatct cccttcaatg tttactttgt tctggtccct acagagtccc    3240

actataccac aactgatact aagtaattag taaggccctc ctcttttatt tttaataaag    3300

aagattttag aaagcatcag ttatttaata agttggccta gtttatgttc aaatagcaag    3360

tactcagaac agctgctgat gtttgaaatt aacacaagaa aaagtaaaaa acctcatttt    3420

aagatcttac ttacctgtcc ataattagtc catgaggaat aaacaccctt tccaaatcct    3480

cagcataatg attaggtatg caaaataaat caaggtcata acctggttca tcatcactaa    3540

tctgaaaaag aaatatagct gtttcaatga gagcattaca ggatacaaac atttgattgg    3600

attaagatgt taaaaaataa ccttagtcta tcagagaaat ttaggtgtaa gatgatatta    3660

gtaactgtta actttgtagg tatgataatg aattatgtaa gaaaacaaca ggccgggcgg    3720

gttggttcac acgtgtaatc ccagcacttt gggaggctga ggcaggcaga ctgcctgagc    3780

tcaggagttc gagaccagcc tgggcaacac ggtgaaatcc cgtctctact aaaaatacaa    3840

aaaaattagc cgggtgtggt gacacatgcc tgtagtccca gctacttggg aggctgaggc    3900

aggagaatca cttgaacctg ggaggtgaag gttgcagtga gccaagatgg caccacttca    3960

ctccagcctg ggaaacagag caagactctg tctctgagct gagatggcac cacttcactc    4020

cagcctggga aacagagcaa gactctgtct caaaaaaaac aaaacacaca aacaaaaaaa    4080

caggctgggc gcggtggctc acgcctgtaa tcccagcact ttgggaggcc gaggcgggtg    4140

gatcacctga ggtcaggagt tccagaccag ccttgtcaac atggtgaaac ctccccccgc    4200

cgtctctact aaaaatacaa aaattagcca ggcgtggtgg caggagcctg taatcccagc    4260

tacttgggag gctgaggcag gagaatcgct tgtacccaga aggcagaggt tgcactgagc    4320

tgagatggca ccattgcact ccagcctggg ggacaagagc gagatttcgt ctttaaaaaa    4380

caaaaacaaa acaaaaaacc atgtaactat atgtcttagt catcttagtc aagaatgtag    4440

aagtaaagtg ataagatatg gaatttcctt taggtcacaa agagaaaaag aaaaatttta    4500

aagagctaag acaaacgcag caaaatcttt atatttaata atattctaaa catgggtgat    4560

gaacatacgg gtattcatta tactattctc tccacttttg agtatgtttg aaaatttagt    4620

aaaacaagtt ttaacacact gtagtctaac aagataaaat atcacactga acaggaaaaa    4680

ctggcatggt gtggtggctc acacttgtaa tcccagtgct ttgggaggct gagacaggag    4740

agttgcttga ggccaggagt tcaagaccga catggggaat gtagcaagac cccgtcccta    4800

caaaaaactt tgtaaaaatt tgccaggtat ggtggtgcat acctgtagtc ccagctactc    4860

gggaggcgga ggcagaagga atcacttgag cccaggagtt tgaggctgca gtgagctacg    4920

atcataccac agcactccag cgtggacaac agagtaagac cctatctcaa aaacaaaaca    4980

aaacaaaaca aacaaaaaaa accacaagaa aaactgctgg ctgatgcagc ggctcatgcc    5040

tgtaatccca gtattttggg aggcccaggt gggcgtatca cctgaggtca ggagttagag    5100

accagcctgg ccaacatggt gaaaccccat ctctactaaa aatacaaaat tagccaggca    5160

tgtggcacgc gcctgtagtc ccagttactg ggaggctgaa gcaggaggat cacctgagcc    5220

cgggaggtgg aggttgcagt gagccgagat cacaccactg cactccagcc tgggtgacac    5280

agcaataccc tacctcaaaa taaaaaagaa aaagaaaaga aaagttgctg tccccgctac    5340

cccaatccca aatccaaaca gcctctctca tctcacagta agggggaaaa atcacccaaa    5400

aaagctaagt gatcttttga aaacccaaac tcttagaagt ctaagattat tatagtcaac    5460

tcatgaagtg tcatcataaa agatactcta atattattta agtagaacca catattggtt    5520

gtcttggtat gtctagcccc tggcatacaa aatatttaat aacactgata tggtacctgt    5580

gatgtgaaaa tgtactatga gtacagcttt ataaatacta tatatgtacc tatatacaga    5640

aaaaaataca acaaaatcat aaaagcactt atctttgaaa gaggagttac agcaatttta    5700

tttagttctt tattgctttg ctatatattc taaatttttt tcaatgaata tatatcactt    5760

ttaaaaaaat tcaatggtct ttcttataaa ttatctttgg cagcatgcgt ttttatatat    5820

acatataaaa tgtatgggaa atttttaaag gatacattaa attaaagcaa aatatacaaa    5880

caaaaaatca gaatacaaaa agataaaaag attgggaagg gagggaggga gtaaggagga    5940

agggtgggtg ggtatagaga aatataccaa ataatggtaa gaagtggggt cttgacactt    6000

tctacacttt ttttaaataa aaaaaatttt tttctctctc tttttttttt ttagagacga    6060

agtctcgcta tgttgcccag gctggtcttg aactcctggg atcaagagat cctcctgcct    6120

cagcctccca aggtgcttgg attacaggtg tgagccacca cgcctggtca ctttctacac    6180

tttaatatat atattttttc attttcaatg tcatttttat tagttaattt ataataccca    6240

ttcaccatta tattcaaagt ctatttgaag aaataaacca gaaagaatga aatactctag    6300

ctcacatgct attcaatact aaattacctt tcaaatcaca ttcaagaagc tgatgattta    6360

agctttggcg gtttccaata aatattggtc aaaccataat taaatctcaa tatatcagtt    6420

agtacctatt gagcatctcc ttttacaacc taagcattgt attaggtgct taaatacaag    6480

cagcttgact tttaatacat ttaaaaatac atatttaaga cttaaaatct tatttatgga    6540

attcagttat attttgaggt ttccagtgct gagaaatttg aggtttgtgc tgtctttcag    6600

tccccaaagc tcagttctga gttctcagac tttggtggaa cttcatgtat tgtcaggttg    6660

gcccgtaata cctgtgggac aacttcagcc cctgtgcaca tggccaggag gctggttgca    6720

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ttttataaat tttatgaact gaaatttagt tcaagttcta ggaaaataca aaccttgcta    7080

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aaaaccccca tatttttgtg ggggattcat agtttttgac agcgtcacac agaccgcctg    19080

ccgtgtttca gacccactta agcgcctgtt caagttgggt aagccgctaa cagctgaaga    19140

caagcaggac gaagacaggc gacgagcact gagtgacgag gttagcaagt ggttccggac    19200

aggcttgggg gccgaactgg aggtggcact aacatctagg tatgaggtag agggctgcaa    19260

aagtatcctc atagccatgg ccaccttggc gagggacatt aaggcgttta agaaattgag    19320

aggacctgtt atacacctct acggcggtcc tagattggtg cgttaataca cagaattctg    19380

attggatctc gaggtcgacg gtatcgataa gcttgggctg caggtcgatc gactctagag    19440

gatcgatccc caccatgggt caatcacgct acctcctctt tttggccacc cttgccctcc    19500

taaaccacct cagtttggcc agggtcattc cagtctctgg acctgccagg tgtcttagcc    19560

agtcccgaaa cctgctgaag accacagatg acatggtgaa gacggccaga gaaaaactga    19620

aacattattc ctgcactgct gaagacatcg atcatgaaga catcacacgg gaccaaacca    19680

gcacattgaa gacctgttta ccactggaac tacacaagaa cgagagttgc ctggctacta    19740

gagagacttc ttccacaaca agagggagct gcctgccccc acagaagacg tctttgatga    19800

tgaccctgtg ccttggtagc atctatgagg acttgaagat gtaccagaca gagttccagg    19860

ccatcaacgc agcacttcag aatcacaacc atcagcagat cattctagac aagggcatgc    19920

tggtggccat cgatgagctg atgcagtctc tgaatcataa tggcgagact ctgcgccaga    19980

aacctcctgt gggagaagca gacccttaca gagtgaaaat gaagctctgc atcctgcttc    20040

acgccttcag cacccgcgtc gtgaccatca acagggtgat gggctatctg agctccgcct    20100

gagaattccg cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat    20160

aaggccggtg tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg    20220

tgagggcccg gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc    20280

tcgccaaagg aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt    20340

cttgaagaca aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg    20400

acaggtgcct ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac    20460

cccagtgcca cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg    20520

tattcaacaa ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg    20580

ggcctcggtg cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaacgtc taggcccccc    20640

gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc acaaccatgg    20700

gtcctcagaa gctaaccatc tcctggtttg ccatcgtttt gctggtgtct ccactcatgg    20760

ccatgtggga gctggagaaa gacgtttatg ttgtagaggt ggactggact cccgatgccc    20820

ctggagaaac agtgaacctc acctgtgaca cgcctgaaga agatgacatc acctggacct    20880

cagaccagag acatggagtc ataggctctg gaaagaccct gaccatcact gtcaaagagt    20940

ttctagatgc tggccagtac acctgccaca aaggaggcga gactctgagc cactcacatc    21000

tgctgctcca caagaaggaa aatggaattt ggtccactga aattttaaaa aatttcaaaa    21060

acaagacttt cctgaagtgt gaagcaccaa attactccgg acggttcacg tgctcatggc    21120

tggtgcaaag aaacatggac ttgaagttca acatcaagag cagtagcagt tcccctgact    21180

ctcgggcagt gacatgtgga atggcgtctc tgtctgcaga gaaggtcaca ctggaccaaa    21240

gggactatga gaagtattca gtgtcctgcc aggaggatgt cacctgccca actgccgagg    21300

agaccctgcc cattgaactg gcgttggaag cacggcagca gaataaatat gagaactaca    21360

gcaccagctt cttcatcagg gacatcatca aaccagaccc gcccaagaac ttgcagatga    21420

agcctttgaa gaactcacag gtggaggtca gctgggagta ccctgactcc tggagcactc    21480

cccattccta cttctccctc aagttctttg ttcgaatcca gcgcaagaaa gaaaagatga    21540

aggagacaga ggaggggtgt aaccagaaag gtgcgttcct cgtagagaag acatctaccg    21600

aagtccaatg caaaggcggg aatgtctgcg tgcaagctca ggatcgctat tacaattcct    21660

catgcagcaa gtgggcatgt gttccctgca gggtccgatc ctagaattca ttgatccact    21720

aggatcccgg gtaattaatt gaattacatc cctacgcaaa cgttttacgg ccgccggtgg    21780

cgcccgcgcc cggcggcccg tccttggccg ttgcaggcca ctccggtggc tcccgtcgtc    21840

cccgacttcc aggcccagca gatgcagcaa ctcatcagcg ccgtaaatgc gctgacaatg    21900

agacagaacg caattgctcc tgctaggcct cccaaaccaa agaagaagaa gacaaccaaa    21960

ccaaagccga aaacgcagcc caagaagatc aacggaaaaa cgcagcagca aaagaagaaa    22020

gacaagcaag ccgacaagaa gaagaagaaa cccggaaaaa gagaaagaat gtgcatgaag    22080

attgaaaatg actgtatctt cgtatgcggc tagccacagt aacgtagtgt ttccagacat    22140

gtcgggcacc gcactatcat gggtgcagaa aatctcgggt ggtctggggg ccttcgcaat    22200

cggcgctatc ctggtgctgg ttgtggtcac ttgcattggg ctccgcagat aagttagggt    22260

aggcaatggc attgatatag caagaaaatt gaaaacagaa aaagttaggg taagcaatgg    22320

catataacca taactgtata acttgtaaca aagcgcaaca agacctgcgc aattggcccc    22380

gtggtccgcc tcacggaaac tcggggcaac tcatattgac acattaattg gcaataattg    22440

gaagcttaca taagcttaat tcgacgaata attggatttt tattttattt tgcaattggt    22500

ttttaatatt tccaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    22560

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaactagatc ctcgaatcaa gcttatcgat accgtcgact    22620

agagtcgggg cggccggccg cttcgagcag acatgataag atacattgat gagtttggac    22680

aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg    22740

ctttatttgt aaccattata agctgcaata aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt    22800

ttatgtttca ggttcagggg gaggtgtggg aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca    22860

aatgtggtaa aatcgataag gatctcgacc tcgagggggg gcccggtacc caattcgccc    22920

tatagtgagt cgtattacgc gcgcccctgc agggggccct gtaccgggct ctgcctgagg    22980

ctctggctgc ccagcaggct gaagctgggg ttgttggcca ggggcacttg tgttcccatc    23040

gcagcgggca cttgtgcctc ccaatcagat ggcctctgaa ggcaggcctg gccagaaggt    23100

gagtgctgct gaacgctatt atccacttgg ctgaggggtg ttttccccga aactgctgtg    23160

gtcacagctg ctgccgctgt gacccatgca gcattgttga acgcagtggg cattcttggc    23220

acactaggcc gtctgagctg gtggggactc aaggactggg tgcccaggga gctgggacag    23280

aacccaggca ggggcacttc tggtggggtg gccttggggc tctgcatatg ctggcagaca    23340

gagtcaagtc tgcccagggg agtctggcct gagtgtgaga ggatgggaca ctgggggctg    23400

gaggtgaaaa ttccttgccg cttccccaga gttggtgaga tcactcccat gccctcgcag    23460

ctctggtgcc tggtgagtgg gatcattcct ggactcagat tgttctgaag aagcccagtt    23520

ctgggtggca tcaagtgctt gctagatggg gggcttgcct tgatccggct acacttggag    23580

gtgacttgtt cttggacggc tacatacaga aagagagaag tggggatgag ttccaaaggc    23640

atcctcgact tcggctgtgg ccaccggagg gtagctcctg gcccaacacg gacttctcac    23700

ctcccgccct tggctctcta ctgagctccc ccctgctccc caattcctcg ccattcccct    23760

catttctctg ccctcagcct ggactgcagt tcttctggga agctgcccca actccctagg    23820

tctgtgctca ccaagagcag atcacactgg actgaaatgc cagctgattt gtctcttcaa    23880

gaaaattgga agctcctgga ggtcagggtc catgtctgct tttacactca gtgctctgta    23940

tgcaggcctg gcactgccca ccctttgaca ggtggtgcat attttgtaga aggaaggaag    24000

gggccaggtg gggtgggctg ggctggtggc gggagctagc tcagcctctt agattctcta    24060

cccgatggat gtgacctggg acagcaagtg agtgtggtga gtgagtgcag acggtgcttt    24120

gttcccctct tgtctcatag cctagatggc ctctgagccc agatctgggg ctcagacaac    24180

atttgttcaa ctgaacggta atgggtttcc tttctgaagg ctgaaatctg ggagctgaca    24240

ttctggactc cctgagttct gaagagcctg gggatggaga gacacggagc agaagatgga    24300

aggtagagtc ccaggtgcct aagatgggga atacatctcc cctcattgtc atgagagtcc    24360

actctagctg atatctactg tggccaatat ctaccggtac ttttttgggg tggacactga    24420

gtcatgcagc agtcttatgg tttacccaag gtcaggtagg ggagacagtg cagtcagagc    24480

acaagcccag tgtgtctgac ccacccaaga atccatgctc gtatctacaa aaatgatttt    24540

ttctcttgta atggtgccta ggttctttta ttatcatggc atgtgtatgt ttttcaacta    24600

ggttacaatc tggccttata aggttaacct cctggaggcc accagccttc ctgaaacttg    24660

tctgtgctgt ccctgcaact ggagtgtgcc tgatgtggca ctccagcctg gacaagtggg    24720

acacagactc cgctgttatc aggcccaaag atgtcttcca taagaccaga agagcaatgg    24780

tgtagaggtg tcatgggcta caataaagat gctgacctcc tgtctgaggg caagcagcct    24840

cttctggccc tcagacaaat gctgagtgtt cccaagacta ccctcggcct ggtccaatct    24900

catcccactg gtgcgtaagg gttgctgaac tcatgactt cttggctagcc tgcaacctcc    24960

acggagtggg aactacatca ggcattttgc taactgctgt atcctaggcc aataaatgtt    25020

gatcacattt atagctgcca tggtagggtg gggacccctg ctatctatct gtggaggctc    25080

tgggagcccc tgacacaaac tttctgaagc agagcctccc caaccccttt tccattccct    25140

atacctgaca gatggcccag gaacccatta gaaatggaag gtcactgcag cagtatgtga    25200

atgtgcgtgt gggagaaggg caggatcaga gccctggggg tgtggcagcc cccaagtgat    25260

tctaatccag atcctagggt tgtttccctg tcccattgaa atagctgctt taaggggcct    25320

gactcaggga aatcagtctc ttgaattaag tggtgatttt ggagtcattt agaccaggcc    25380

ttcaattggg atcctgctct tagagttgga tgaattattt aactgatttt cagatctcct    25440

ctttctcaat gctttcagaa gcacagtaac tgcttactct gaaatgaatt ctcaccccac    25500

ttccacatat gcaccccttg cccacccctt tgggaacact ggccttaact gcttaccttc    25560

aaatggactc atctgttggg agatatatgc attctgccgt tcaggggtca ttgccataag    25620

acctgatctc tgttcctctt gctaaacaga agatgaaaaa gacaaattag attacagcta    25680

ccaattaata attagcctta ggatcgctgc gtggggacct aggacttggc tttggtgcag    25740

cagaaagcat gaataaacac accagcatac actcgcatgc atgccccacc ctctcgagca    25800

aaattccaca ggtataaata aagtaagatt ctgcacctgg gttaaaaaca caactgcaac    25860

agcatagaat ggggcaggag agacagaact taatagcaag agcacacaga aaaaagtttt    25920

aggcattttg gatgtccatc tgctcaggat gggtcagcag tgagatgcgg tcaccaaaag    25980

aacaaatgta acattaggct gcattaatag aagcagagta tgtagaagga gggaggtgac    26040

agtcctatgc taactctgcc ttggccagac tatacccaca ggagtctggg catgccagtc    26100

tcagggagac ccagacagac tggctgcatt cagaggatgg taagtaatga gagtggggat    26160

tggacttcaa actacccaga caaagaatgg ctgagcaagc caaggatgct gtggctgggg    26220

cagagcagac tgtgggctat gtagtggtgg atacctagcc tctgcagggc tgtcataggg    26280

aaaggacatt gagaagagga ctgaggcttg ttcctggtgg tcctggcatg aacggccaga    26340

tgatcacatg gtcaggtgga cacagtctcc aacactggga gtagccaaac acttactgcc    26400

aacctcccgc ccttctcctg actagttgca gcataggcaa ttgggaggag cttcctgtct    26460

ccatctgaaa gctggctggg tgggcagggg gaggagcgag ccaagtttca aggccgcagt    26520

ttcagcactc agtctgggat cggctcaagg agcaaagggg aagaacatag ccaggaggga    26580

ataacatgaa ggcccccaga cccagaaaag gcatgacttg ctctgagacc ctcagccggt    26640

tggtgtcagg ttgtgactcg gatccaggtc tgactcccag tccagtgctt gaagcctcac    26700

cccacacagt gaggggagcc cggccatctc tgctcaactg ctgccatctc tctccccttc    26760

tcaaccacca aggcagctct gtctgggagc acaagctcca agtccacttt ctggtctgtg    26820

tcccccccaa gatgccagag gacttgcctc tacaacacgg gctgcccgtg cagtgcctgc    26880

ttttccagca aagggcttct gggaaccctt ctctgcactc agtggggctg gtgggagtgg    26940

ggcggggtag cgacccagtg cttgggactg tgcccagctc tcaggcctgg cagcagttcc    27000

tggccttggt tcctgccaag gcagagagga caaacacatg gcaccgggaa gactacacca    27060

gaagcgattc caccagactg gggtttgctt ttctatcccg cccttagcct gcttcctgtc    27120

ctggtccctg cctccccctc cactggagct gccgtgtggg cagtgagggg ctgtttctca    27180

gctgccctat ggagctgccc tctccctgcc aaagcattgg caaggcggca aggggtgggg    27240

gtggggatgg ggggtgggat ctgccttctc aagctctcat tatactgagc acgtctcacc    27300

cattatttta tgtcatctag caacacccca tgtggacact gaggagcatg ggggtcacat    27360

gaccactgcc caaggccaca ccatccggat ctgcctgaga tggtcagggt tggcagccat    27420

ttctgaaggc agtcctttcg ctttggctct tcttgtacca gtctcaggac atcagggcag    27480

aagatctaca gtccccagct tactgatgtg acagcagagg ctcagagagg ttaaatgact    27540

tgcccaaggt gacacggcta agaagtacag tatctcctaa ctgcagacca ggtgcttctg    27600

ctgcttctgg ggacagattc ctgcgtggct ggctaggtct aaacggtcct taactccatc    27660

cccaccggtt gctgcattag tttcatcaaa taacacagtt gtacagaggt aggggttcag    27720

gggcaggggc agatggaggc tggagagtgt gactaaggaa acagcagggg aagtgcggta    27780

aagtccgaag ggagggacgg aaagagaaag ccaagcccag gggcgtgcca gacaaaagga    27840

aaggccacgc cggggcaggg caggcttcag cgggtgctgg ggcgtcttca tcccgggaag    27900

cacacattcc agaggacccc ggagtctaat ggaaaagctg gccagcctat cactatggaa    27960

actgccaagg ccacacagcg ctgctgacac ccagcctggg tgccggtggc cagctctgca    28020

ggatcttcaa gtctggggtg ccaccagcaa gcgacggtcc tccatgggct cttcacctta    28080

cggcagtgtc cagaggcacc gccagtcctc tgctcctatg ctggtcctgc tgtccctggc    28140

aaaaggagcc agagcattct ctccaggcct cccgaggagg ctgcttcctt tgttttgcag    28200

atggaggctc ccatcctttg ttctgaatca atgtgctcca aagataagcc ccaagaaaac    28260

agttgttgcc ttttgacact gacaattaga atcgttggaa aatggagaaa acaggaaatg    28320

gcaaatggtt tcagtgacca ggaggaaacc gtgcctgaaa gttgctgctt agtgactggg    28380

acactcgctt tctgctctct tatgaaggac agcctaggcc gtgtggcctt ttataaacaa    28440

agctatgaag gggtcgtcaa attttctagg gctgcaactg tggcactacg tcctgttgtg    28500

ccaggtgaca ctgacaagca gcactgagtt ctatgcaagc ccaggtgtgc ttctctcatg    28560

gtgaccccca gagaactaag gcccagctct tcctctgtca cacccctccc agcccccact    28620

gtcagacaag ggaccacatt cacagacagt ctcagccaag atggcaacct tggaagtcct    28680

ggggatgcct ttctagaagc tcgcgcccct aggggccggc cttaattaaa tcaagcttat    28740

cgataccgtc gagacctcga gggggggcat cactccgccc taaaacctac gtcacccgcc    28800

ccgttcccac gccccgcgcc acgtcacaaa ctccaccccc tcattatcat attggcttca    28860

atccaaaata aggtatatta ttgatgatgt tt                                  28892

<210>9

<211>29511

<212>DNA

<213>嵌合的

<220>

<221>5′ITR

<222>(1)..(438)

<223>第一反向末端重复序列和用于包装的信号序列

<220>

<221>填充片段

<222>(439)..(10905)

<223>第一非编码填充片段序列

<220>

<221>AFP(p+e)

<222>(10906)..(11845)

<223>α甲胎蛋白(AFP)启动子.包括启动子区域(p)和增强子区域(e)

<220>

<221>SFV

<222>(12175)..(19281)

<223>SFV复制子序列区域

<220>

<221>LacZ

<222>(19325)..(22397)

<223>Escherichia coli LacZ基因序列(外源基因作为报告基因)

<220>

<221>PolyA

<222>(23295)..(23554)

<223>衍生自SV40病毒的多聚腺苷酸化序列

<220>

<221>Relleno

<222>(23555)..(29350)

<223>第二填充片段非编码序列

<220>

<221>3′ITR

<222>(29351)..(29511)

<223>第二反向末端重复序列

<400>9

aaacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat gagggggtgg     60

agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg acgtagtagt gtggcggaag    120

tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt    180

ttggtgtgcg ccggtgtaca caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg    240

tagtaaattt gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt cgcgggaaaa ctgaataaga    300

ggaagtgaaa tctgaataat tttgtgttac tcatagcgcg taatatttgt ctagggccgc    360

ggggactttg accgtttacg tggagactcg cccaggtgtt tttctcaggt gttttccgcg    420

ttccgggtca aagttggcgt tttgatatca agcttatcga taccgtcaaa caagtcttta    480

attcaagcaa gactttaaca agttaaaagg agcttatggg taggaagtag tgttatgatg    540

tatgggcata aagggtttta atgggatagt gaaaatgtct ataataatac ttaaatggct     600

gcccaatcac ctacaggatt gatgtaaaca tggaaaaggt caaaaacttg ggtcactaaa     660

atagatgatt aatggagagg atgaggttga tagttaaatg tagataagtg gtcttattct     720

caataaaaat gtgaacataa ggcgagtttc tacaaagatg gacaggactc attcatgaaa     780

cagcaaaaac tggacatttg ttctaatctt tgaagagtat gaaaaattcc tattttaaag     840

gtaaaacagt aactcacagg aaataccaac ccaacataaa atcagaaaca atagtctaaa     900

gtaataaaaa tcaaacgttt gcacgatcaa attatgaatg aaattcacta ctaaaattca     960

cactgatttt gtttcatcca cagtgtcaat gttgtgatgc atttcaattg tgtgacacag    1020

gcagactgtg gatcaaaagt ggtttctggt gcgacttact ctcttgagta tacctgcagt    1080

cccctttctt aagtgtgtta aaaaaaaagg gggatttctt caattcgcca atactctagc    1140

tctccatgtg ctttctagga aacaagtgtt aacccacctt atttgtcaaa cctagctcca    1200

aaggactttt gactccccac aaaccgatgt agctcaagag agggtatctg tcaccagtat    1260

gtatagtgaa aaaagtatcc caagtcccaa cagcaattcc taaaaggagt ttatttaaaa    1320

aaccacacac acctgtaaaa taagtatata tcctccaagg tgactagttt taaaaaaaca    1380

gtattggctt tgatgtaaag tactagtgaa tatgttagaa aaatctcact gtaaccaagt    1440

gaaatgaaag caagtatggt ttgcagagat tcaaagaaaa tataagaaaa cctactgttg    1500

ccactaaaaa gaatcatata ttaaatatac tcacacaata gctcttcagt ctgataaaat    1560

ctacagtcat aggaatggat ctatcactat ttctattcag tgctttgatg taatccagca    1620

ggtcagcaaa gaatttatag ccccccttga gcacacagag ggctacaatg tgatggcctc    1680

ccatctcctt catcacatct cgagcaagac gttcagtcct acagaaataa aatcaggaat    1740

ttaatagaaa gtttcataca ttaaacttta taacaaacac ctcttagtca ttaaacttcc    1800

acaccaacct gggcaatata gtgagacccc atgcctgcaa aaaaaaaaaa attagccagg    1860

catggtagca tgtacctgta gtcccagcta cttgagaggt gaggtgggaa aatcacttta    1920

gtgcaggatg ttgaggctgg agtgaactgt gattgtgcca ctgcactcca gcctggacaa    1980

tagagcaaga ccttgtctca aaaaaatgca ttaaaaattt tttttaaatc ttccacgtat    2040

cacatccttt gccctcatgt ttcataaggt aaaaaatttg ataccttcaa aaaaaccaag    2100

cataccacta tcataatttt ttttaaatgc aaataaaaac aagataccat tttcacctat    2160

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cgttaaaata taaatgtata tatgtacttt tgcatatagt atacatgcat aggccagtgc    2880

ttgagaagaa atgtgtacag aaggctgaaa ggagagaact ttagtcttct tgtttatggc    2940

ctccatagtt agaatatttt ataacacaaa tattttgata ttataatttt aaaataaaaa    3000

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ttgacttaac agaaaatttt caagctagat gtgcataata ataaaaatct gaccttgcct    3120

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attaagatgt taaaaaataa ccttagtcta tcagagaaat ttaggtgtaa gatgatatta    3660

gtaactgtta actttgtagg tatgataatg aattatgtaa gaaaacaaca ggccgggcgg    3720

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caaaaacaaa acaaaaaacc atgtaactat atgtcttagt catcttagtc aagaatgtag    4440

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cgggaggtgg aggttgcagt gagccgagat cacaccactg cactccagcc tgggtgacac    5280

agcaataccc tacctcaaaa taaaaaagaa aaagaaaaga aaagttgctg tccccgctac    5340

cccaatccca aatccaaaca gcctctctca tctcacagta agggggaaaa atcacccaaa    5400

aaagctaagt gatcttttga aaacccaaac tcttagaagt ctaagattat tatagtcaac    5460

tcatgaagtg tcatcataaa agatactcta atattattta agtagaacca catattggtt    5520

gtcttggtat gtctagcccc tggcatacaa aatatttaat aacactgata tggtacctgt    5580

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aaaaaataca acaaaatcat aaaagcactt atctttgaaa gaggagttac agcaatttta    5700

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ttaaaaaaat tcaatggtct ttcttataaa ttatctttgg cagcatgcgt ttttatatat    5820

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agggtgggtg ggtatagaga aatataccaa ataatggtaa gaagtggggt cttgacactt    6000

tctacacttt ttttaaataa aaaaaatttt tttctctctc tttttttttt ttagagacga    6060

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tttaatatat atattttttc attttcaatg tcatttttat tagttaattt ataataccca    6240

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ctcacatgct attcaatact aaattacctt tcaaatcaca ttcaagaagc tgatgattta    6360

agctttggcg gtttccaata aatattggtc aaaccataat taaatctcaa tatatcagtt    6420

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gcataaaaaa tttgtcaata caactcttcc caaaaggcat aaacaaaaat tcataaaact    7680

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tcaaatatca aatactaatt tttttttttt tttttttttt gagacggagt ctcgctctgt    8220

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cacgccattc tcctgcctca gcctcccgag tagctgggat tacagacatg cgccaccacg    8340

cccggctaat tttgtatttt tagtagagat ggggtttctc catgttggtc aggctggtct    8400

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aattgctatt taaaaaaaaa gacggctggg cgctgtggct catgcctgta atcccagcac    8880

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cgtggtaaaa ccccgtctct actaaaaata caaaaaaaaa attagccagg catggtggca    9000

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tacaaaaaat acaaaaatta gccgggtgtg gtggcacgtg cctgtagtcc cagttacttg     9780

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tgtgccactg cactccactt cagcctgggc gacaagagca agactccgtc acaaaaaaaa     9900

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aaagttcagt ttactgttcc atgttgcttc tgagtggctt cacagactta tgaaaaagta    11040

aacggaatca gaattacatc aatgcaaaag cattgctgtg aactctgtac ttaggactaa    11100

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gtcctactac catgtggatc ggccattccg gtccctgagt ttcaagcttt gagcgagagc    13860

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cacggaccgt cgctgaacac cgacgaggag aactacgaga aagtcagagc tgaaagaact    13980

gacgccgagt acgtgttcga cgtagataaa aaatgctgcg tcaagagaga ggaagcgtcg    14040

ggtttggtgt tggtgggaga gctaaccaac cccccgttcc atgaattcgc ctacgaaggg    14100

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aagatgcgca cgaccaaccc gtgcaacaaa cccataatca tagacaccac aggacagacc    14640

aagcccaagc caggagacat cgtgttaaca tgcttccgag gctgggcaaa gcagctgcag    14700

ttggactacc gtggacacga agtcatgaca gcagcagcat ctcagggcct cacccgcaaa    14760

ggggtatacg ccgtaaggca gaaggtgaat gaaaatccct tgtatgcccc tgcgtcggag    14820

cacgtgaatg tactgctgac gcgcactgag gataggctgg tgtggaaaac gctggccggc    14880

gatccctgga ttaaggtcct atcaaacatt ccacagggta actttacggc cacattggaa    14940

gaatggcaag aagaacacga caaaataatg aaggtgattg aaggaccggc tgcgcctgtg    15000

gacgcgttcc agaacaaagc gaacgtgtgt tgggcgaaaa gcctggtgcc tgtcctggac    15060

actgccggaa tcagattgac agcagaggag tggagcacca taattacagc atttaaggag    15120

gacagagctt actctccagt ggtggccttg aatgaaattt gcaccaagta ctatggagtt    15180

gacctggaca gtggcctgtt ttctgccccg aaggtgtccc tgtattacga gaacaaccac    15240

tgggataaca gacctggtgg aaggatgtat ggattcaatg ccgcaacagc tgccaggctg    15300

gaagctagac ataccttcct gaaggggcag tggcatacgg gcaagcaggc agttatcgca    15360

gaaagaaaaa tccaaccgct ttctgtgctg gacaatgtaa ttcctatcaa ccgcaggctg    15420

ccgcacgccc tggtggctga gtacaagacg gttaaaggca gtagggttga gtggctggtc    15480

aataaagtaa gagggtacca cgtcctgctg gtgagtgagt acaacctggc tttgcctcga    15540

cgcagggtca cttggttgtc accgctgaat gtcacaggcg ccgataggtg ctacgaccta    15600

agtttaggac tgccggctga cgccggcagg ttcgacttgg tctttgtgac attcacacg     15660

gaattcagaa tccaccacta ccagcagtgt gtcgaccacg ccatgaagct gcagatgctt    15720

gggggagatg cgctacgact gctaaaaccc ggcggcatct tgatgagagc ttacggatac    15780

gccgataaaa tcagcgaagc cgttgtttcc tccttaagca gaaagttctc gtctgcaaga    15840

gtgttgcgcc cggattgtgt caccagcaat acagaagtgt tcttgctgtt ctccaacttt    15900

gacaacggaa agagaccctc tacgctacac cagatgaata ccaagctgag tgccgtgtat    15960

gccggagaag ccatgcacac ggccgggtgt gcaccatcct acagagttaa gagagcagac    16020

atagccacgt gcacagaagc ggctgtggtt aacgcagcta acgcccgtgg aactgtaggg    16080

gatggcgtat gcagggccgt ggcgaagaaa tggccgtcag cctttaaggg agcagcaaca    16140

ccagtgggca caattaaaac agtcatgtgc ggctcgtacc ccgtcatcca cgctgtagcg    16200

cctaatttct ctgccacgac tgaagcggaa ggggaccgcg aattggccgc tgtctaccgg    16260

gcagtggccg ccgaagtaaa cagactgtca ctgagcagcg tagccatccc gctgctgtcc    16320

acaggagtgt tcagcggcgg aagagatagg ctgcagcaat ccctcaacca tctattcaca    16380

gcaatggacg ccacggacgc tgacgtgacc atctactgca gagacaaaag ttgggagaag    16440

aaaatccagg aagccattga catgaggacg gctgtggagt tgctcaatga tgacgtggag    16500

ctgaccacag acttggtgag agtgcacccg gacagcagcc tggtgggtcg taagggctac    16560

agtaccactg acgggtcgct gtactcgtac tttgaaggta cgaaattcaa ccaggctgct    16620

attgatatgg cagagatact gacgttgtgg cccagactgc aagaggcaaa cgaacagata    16680

tgcctatacg cgctgggcga aacaatggac aacatcagat ccaaatgtcc ggtgaacgat    16740

tccgattcat caacacctcc caggacagtg ccctgcctgt gccgctacgc aatgacagca    16800

gaacggatcg cccgccttag gtcacaccaa gttaaaagca tggtggtttg ctcatctttt    16860

cccctcccga aataccatgt agatggggtg cagaaggtaa agtgcgagaa ggttctcctg    16920

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cactcagatc ggtcgttacg agggtttgac ttggactgga ccaccgactc gtcttccact    17040

gccagcgata ccatgtcgct acccagtttg cagtcgtgtg acatcgactc gatctacgag    17100

ccaatggctc ccatagtagt gacggctgac gtacaccctg aacccgcagg catcgcggac    17160

ctggcggcag atgtgcaccc tgaacccgca gaccatgtgg acctcgagaa cccgattcct    17220

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gcgccgagaa agccgacgcc tgccccaagg actgcgttta ggaacaagct gcctttgacg    17340

ttcggcgact ttgacgagca cgaggtcgat gcgttggcct ccgggattac tttcggagac    17400

ttcgacgacg tcctgcgact aggccgcgcg ggtgcatata ttttctcctc ggacactggc    17460

agcggacatt tacaacaaaa atccgttagg cagcacaatc tccagtgcgc acaactggat    17520

gcggtccagg aggagaaaat gtacccgcca aaattggata ctgagaggga gaagctgttg    17580

ctgctgaaaa tgcagatgca cccatcggag gctaataaga gtcgatacca gtctcgcaaa    17640

gtggagaaca tgaaagccac ggtggtggac aggctcacat cgggggccag attgtacacg    17700

ggagcggacg taggccgcat accaacatac gcggttcggt acccccgccc cgtgtactcc    17760

cctaccgtga tcgaaagatt ctcaagcccc gatgtagcaa tcgcagcgtg caacgaatac    17820

ctatccagaa attacccaac agtggcgtcg taccagataa cagatgaata cgacgcatac    17880

ttggacatgg ttgacgggtc ggatagttgc ttggacagag cgacattctg cccggcgaag    17940

ctccggtgct acccgaaaca tcatgcgtac caccagccga ctgtacgcag tgccgtcccg    18000

tcaccctttc agaacacact acagaacgtg ctagcggccg ccaccaagag aaactgcaac    18060

gtcacgcaaa tgcgagaact acccaccatg gactcggcag tgttcaacgt ggagtgcttc    18120

aagcgctatg cctgctccgg agaatattgg gaagaatatg ctaaacaacc tatccggata    18180

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ttcgctaaga cccacaactt ggttccgctg caggaggttc ccatggacag attcacggtc    18300

gacatgaaac gagatgtcaa agtcactcca gggacgaaac acacagagga aagacccaaa    18360

gtccaggtaa ttcaagcagc ggagccattg gcgaccgctt acctgtgcgg catccacagg    18420

gaattagtaa ggagactaaa tgctgtgtta cgccctaacg tgcacacatt gtttgatatg    18480

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gagacggaca ttgcatcatt cgacaaaagc caggacgact ccttggctct tacaggttta    18600

atgatcctcg aagatctagg ggtggatcag tacctgctgg acttgatcga ggcagccttt    18660

ggggaaatat ccagctgtca cctaccaact ggcacgcgct tcaagttcgg agctatgatg    18720

aaatcgggca tgtttctgac tttgtttatt aacactgttt tgaacatcac catagcaagc    18780

agggtactgg agcagagact cactgactcc gcctgtgcgg ccttcatcgg cgacgacaac    18840

atcgttcacg gagtgatctc cgacaagctg atggcggaga ggtgcgcgtc gtgggtcaac    18900

atggaggtga agatcattga cgctgtcatg ggcgaaaaac ccccatattt ttgtggggga    18960

ttcatagttt ttgacagcgt cacacagacc gcctgccgtg tttcagaccc acttaagcgc    19020

ctgttcaagt tgggtaagcc gctaacagct gaagacaagc aggacgaaga caggcgacga    19080

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ttggcgaggg acattaaggc gtttaagaaa ttgagaggac ctgttataca cctctacggc    19260

ggtcctagat tggtgcgtta atacacagaa ttctgattat agcgcactat tatatagcac    19320

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cgtcccctca aactggcaga tgcacggtta cgatgcgccc atctacacca acgtaaccta    19620

tcccattacg gtcaatccgc cgtttgttcc cacggagaat ccgacgggtt gttactcgct    19680

cacatttaat gttgatgaaa gctggctaca ggaaggccag acgcgaatta tttttgatgg    19740

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tcgtttgccg tctgaatttg acctgagcgc atttttacgc gccggagaaa accgcctcgc    19860

ggtgatggtg ctgcgttgga gtgacggcag ttatctggaa gatcaggata tgtggcggat    19920

gagcggcatt ttccgtgacg tctcgttgct gcataaaccg actacacaaa tcagcgattt    19980

ccatgttgcc actcgcttta atgatgattt cagccgcgct gtactggagg ctgaagttca    20040

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cgctaatcac gacgcgctgt atcgctggat caaatctgtc gatccttccc gcccggtgca    20760

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cgtggatgaa gaccagccct tcccggctgt gccgaaatgg tccatcaaaa aatggctttc    20880

gctacctgga gagacgcgcc cgctgatcct ttgcgaatac gcccacgcga tgggtaacag    20940

tcttggcggt ttcgctaaat actggcaggc gtttcgtcag tatccccgtt tacagggcgg    21000

cttcgtctgg gactgggtgg atcagtcgct gattaaatat gatgaaaacg gcaacccgtg    21060

gtcggcttac ggcggtgatt ttggcgatac gccgaacgat cgccagttct gtatgaacgg    21120

tctggtcttt gccgaccgca cgccgcatcc agcgctgacg gaagcaaaac accagcagca    21180

gtttttccag ttccgtttat ccgggcaaac catcgaagtg accagcgaat acctgttccg    21240

tcatagcgat aacgagctcc tgcactggat ggtggcgctg gatggtaagc cgctggcaag    21300

cggtgaagtg cctctggatg tcgctccaca aggtaaacag ttgattgaac tgcctgaact    21360

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ggggaaaacc ttatttatca gccggaaaac ctaccggatt gatggtagtg gtcaaatggc    21900

gattaccgtt gatgttgaag tggcgagcga tacaccgcat ccggcgcgga ttggcctgaa    21960

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gtataccccg tacgtcttcc cgagcgaaaa cggtctgcgc tgcgggacgc gcgaattgaa    22140

ttatggccca caccagtggc gcggcgactt ccagttcaac atcagccgct acagtcaaca    22200

gcaactgatg gaaaccagcc atcgccatct gctgcacgcg gaagaaggca catggctgaa    22260

tatcgacggt ttccatatgg ggattggtgg cgacgactcc tggagcccgt cagtatcggc    22320

ggaattccag ctgagcgccg gtcgctacca ttaccagttg gtctggtgtc aaaaataata    22380

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tggctcccgt cgtccccgac ttccaggccc agcagatgca gcaactcatc agcgccgtaa    22560

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agcaaaagaa gaaagacaag caagccgaca agaagaagaa gaaacccgga aaaagagaaa    22740

gaatgtgcat gaagattgaa aatgactgta tcttcgtatg cggctagcca cagtaacgta    22800

gtgtttccag acatgtcggg caccgcacta tcatgggtgc agaaaatctc gggtggtctg    22860

ggggccttcg caatcggcgc tatcctggtg ctggttgtgg tcacttgcat tgggctccgc    22920

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agggtaagca atggcatata accataactg tataacttgt aacaaagcgc aacaagacct    23040

gcgcaattgg ccccgtggtc cgcctcacgg aaactcgggg caactcatat tgacacatta    23100

attggcaata attggaagct tacataagct taattcgacg aataattgga tttttatttt    23160

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ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa    23460

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gtaaaacctc tacaaatgtg gtaaaatcga taaggatctc gacctcgagg gggggccctg    23580

taccgggctc tgcctgaggc tctggctgcc cagcaggctg aagctggggt tgttggccag    23640

gggcacttgt gttcccatcg cagcgggcac ttgtgcctcc caatcagatg gcctctgaag    23700

gcaggcctgg ccagaaggtg agtgctgctg aacgctatta tccacttggc tgaggggtgt    23760

tttccccgaa actgctgtgg tcacagctgc tgccgctgtg acccatgcag cattgttgaa    23820

cgcagtgggc attcttggca cactaggccg tctgagctgg tggggactca aggactgggt    23880

gcccagggag ctgggacaga acccaggcag gggcacttct ggtggggtgg ccttggggct    23940

ctgcatatgc tggcagacag agtcaagtct gcccagggga gtctggcctg agtgtgagag    24000

gatgggacac tgggggctgg aggtgaaaat tccttgccgc ttccccagag ttggtgagat    24060

cactcccatg ccctcgcagc tctggtgcct ggtgagtggg atcattcctg gactcagatt    24120

gttctgaaga agcccagttc tgggtggcat caagtgcttg ctagatgggg ggcttgcctt    24180

gatccggcta cacttggagg tgacttgttc ttggacggct acatacagaa agagagaagt    24240

ggggatgagt tccaaaggca tcctcgactt cggctgtggc caccggaggg tagctcctgg    24300

cccaacacgg acttctcacc tcccgccctt ggctctctac tgagctcccc cctgctcccc    24360

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ttacactcag tgctctgtat gcaggcctgg cactgcccac cctttgacag gtggtgcata    24600

ttttgtagaa ggaaggaagg ggccaggtgg ggtgggctgg gctggtggcg ggagctagct    24660

cagcctctta gattctctac ccgatggatg tgacctggga cagcaagtga gtgtggtgag    24720

tgagtgcaga cggtgctttg ttcccctctt gtctcatagc ctagatggcc tctgagccca    24780

gatctggggc tcagacaaca tttgttcaac tgaacggtaa tgggtttcct ttctgaaggc    24840

tgaaatctgg gagctgacat tctggactcc ctgagttctg aagagcctgg ggatggagag    24900

acacggagca gaagatggaa ggtagagtcc caggtgccta agatggggaa tacatctccc    24960

ctcattgtca tgagagtcca ctctagctga tatctactgt ggccaatatc taccggtact    25020

tttttggggt ggacactgag tcatgcagca gtcttatggt ttacccaagg tcaggtaggg    25080

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tatctacaaa aatgattttt tctcttgtaa tggtgcctag gttcttttat tatcatggca    25200

tgtgtatgtt tttcaactag gttacaatct ggccttataa ggttaacctc ctggaggcca    25260

ccagccttcc tgaaacttgt ctgtgctgtc cctgcaactg gagtgtgcct gatgtggcac    25320

tccagcctgg acaagtggga cacagactcc gctgttatca ggcccaaaga tgtcttccat    25380

aagaccagaa gagcaatggt gtagaggtgt catgggctac aataaagatg ctgacctcct    25440

gtctgagggc aagcagcctc ttctggccct cagacaaatg ctgagtgttc ccaagactac    25500

cctcggcctg gtccaatctc atcccactgg tgcgtaaggg ttgctgaact catgacttct    25560

tggctagcct gcaacctcca cggagtggga actacatcag gcattttgct aactgctgta    25620

tcctaggcca ataaatgttg atcacattta tagctgccat ggtagggtgg ggacccctgc    25680

tatctatctg tggaggctct gggagcccct gacacaaact ttctgaagca gagcctcccc    25740

aacccctttt ccattcccta tacctgacag atggcccagg aacccattag aaatggaagg    25800

tcactgcagc agtatgtgaa tgtgcgtgtg ggagaagggc aggatcagag ccctgggggt    25860

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gagtcattta gaccaggcct tcaattggga tcctgctctt agagttggat gaattattta    26040

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caggggtcat tgccataaga cctgatctct gttcctcttg ctaaacagaa gatgaaaaag    26280

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ttaaaaacac aactgcaaca gcatagaatg gggcaggaga gacagaactt aatagcaaga    26520

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gagatgcggt caccaaaaga acaaatgtaa cattaggctg cattaataga agcagagtat    26640

gtagaaggag ggaggtgaca gtcctatgct aactctgcct tggccagact atacccacag    26700

gagtctgggc atgccagtct cagggagacc cagacagact ggctgcattc agaggatggt    26760

aagtaatgag agtggggatt ggacttcaaa ctacccagac aaagaatggc tgagcaagcc    26820

aaggatgctg tggctggggc agagcagact gtgggctatg tagtggtgga tacctagcct    26880

ctgcagggct gtcataggga aaggacattg agaagaggac tgaggcttgt tcctggtggt    26940

cctggcatga acggccagat gatcacatgg tcaggtggac acagtctcca acactgggag    27000

tagccaaaca cttactgcca acctcccgcc cttctcctga ctagttgcag cataggcaat    27060

tgggaggagc ttcctgtctc catctgaaag ctggctgggt gggcaggggg aggagcgagc    27120

caagtttcaa ggccgcagtt tcagcactca gtctgggatc ggctcaagga gcaaagggga    27180

agaacatagc caggagggaa taacatgaag gcccccagac ccagaaaagg catgacttgc    27240

tctgagaccc tcagccggtt ggtgtcaggt tgtgactcgg atccaggtct gactcccagt    27300

ccagtgcttg aagcctcacc ccacacagtg aggggagccc ggccatctct gctcaactgc    27360

tgccatctct ctccccttct caaccaccaa ggcagctctg tctgggagca caagctccaa    27420

gtccactttc tggtctgtgt cccccccaag atgccagagg acttgcctct acaacacggg    27480

ctgcccgtgc agtgcctgct tttccagcaa agggcttctg ggaacccttc tctgcactca    27540

gtggggctgg tgggagtggg gcggggtagc gacccagtgc ttgggactgt gcccagctct    27600

caggcctggc agcagttcct ggccttggtt cctgccaagg cagagaggac aaacacatgg    27660

caccgggaag actacaccag aagcgattcc accagactgg ggtttgcttt tctatcccgc    27720

ccttagcctg cttcctgtcc tggtccctgc ctccccctcc actggagctg ccgtgtgggc    27780

agtgaggggc tgtttctcag ctgccctatg gagctgccct ctccctgcca aagcattggc    27840

aaggcggcaa ggggtggggg tggggatggg gggtgggatc tgccttctca agctctcatt    27900

atactgagca cgtctcaccc attattttat gtcatctagc aacaccccat gtggacactg    27960

aggagcatgg gggtcacatg accactgccc aaggccacac catccggatc tgcctgagat    28020

ggtcagggtt ggcagccatt tctgaaggca gtcctttcgc tttggctctt cttgtaccag    28080

tctcaggaca tcagggcaga agatctacag tccccagctt actgatgtga cagcagaggc    28140

tcagagaggt taaatgactt gcccaaggtg acacggctaa gaagtacagt atctcctaac    28200

tgcagaccag gtgcttctgc tgcttctggg gacagattcc tgcgtggctg gctaggtcta    28260

aacggtcctt aactccatcc ccaccggttg ctgcattagt ttcatcaaat aacacagttg    28320

tacagaggta ggggttcagg ggcaggggca gatggaggct ggagagtgtg actaaggaaa    28380

cagcagggga agtgcggtaa agtccgaagg gagggacgga aagagaaagc caagcccagg    28440

ggcgtgccag acaaaaggaa aggccacgcc ggggcagggc aggcttcagc gggtgctggg    28500

gcgtcttcat cccgggaagc acacattcca gaggaccccg gagtctaatg gaaaagctgg    28560

ccagcctatc actatggaaa ctgccaaggc cacacagcgc tgctgacacc cagcctgggt    28620

gccggtggcc agctctgcag gatcttcaag tctggggtgc caccagcaag cgacggtcct    28680

ccatgggctc ttcaccttac ggcagtgtcc agaggcaccg ccagtcctct gctcctatgc    28740

tggtcctgct gtccctggca aaaggagcca gagcattctc tccaggcctc ccgaggaggc    28800

tgcttccttt gttttgcaga tggaggctcc catcctttgt tctgaatcaa tgtgctccaa    28860

agataagccc caagaaaaca gttgttgcct tttgacactg acaattagaa tcgttggaaa    28920

atggagaaaa caggaaatgg caaatggttt cagtgaccag gaggaaaccg tgcctgaaag    28980

ttgctgctta gtgactggga cactcgcttt ctgctctctt atgaaggaca gcctaggccg    29040

tgtggccttt tataaacaaa gctatgaagg ggtcgtcaaa ttttctaggg ctgcaactgt    29100

ggcactacgt cctgttgtgc caggtgacac tgacaagcag cactgagttc tatgcaagcc    29160

caggtgtgct tctctcatgg tgacccccag agaactaagg cccagctctt cctctgtcac    29220

acccctccca gcccccactg tcagacaagg gaccacattc acagacagtc tcagccaaga    29280

tggcaacctt ggaagtcctg gggatgcctt tctagaagct cgcgccccta ggggccggcc    29340

ttaattaaat caagcttatc gataccgtcg agacctcgag ggggggcatc actccgccct    29400

aaaacctacg tcacccgccc cgttcccacg ccccgcgcca cgtcacaaac tccaccccct    29460

cattatcata ttggcttcaa tccaaaataa ggtatattat tgatgatgtt t             29511

<210>10

<211>28191

<212>DNA

<213>嵌合的

<220>

<221>5′ITR

<222>(1)..(438)

<223>第一反向末端重复序列和用于包装的信号序列

<220>

<221>填充片段

<222>(439)..(10990)

<223>第一非编码填充片段序列

<220>

<221>TERT

<222>(10991)..(11285)

<223>端粒酶启动子(TERT)

<220>

<221>SFV

<222>(11556)..(18665)

<223>SFV复制子序列区域

<220>

<221>mIL-12

<222>(18688)..(21021)

<223>小鼠白介素-12(IL12)基因序列

<220>

<221>PolyA

<222>(21920)..(22179)

<223>衍生自SV40病毒的多聚腺苷酸化序列

<220>

<221>填充片段

<222>(22180)..(28030)

<223>第二非编码填充片段序列

<220>

<221>3′ITR

<222>(28031)..(28191)

<223>第一反向末端重复序列

<400>10

aaacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat gagggggtgg     60

agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg acgtagtagt gtggcggaag    120

tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt    180

ttggtgtgcg ccggtgtaca caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg    240

tagtaaattt gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt cgcgggaaaa ctgaataaga    300

ggaagtgaaa tctgaataat tttgtgttac tcatagcgcg taatatttgt ctagggccgc    360

ggggactttg accgtttacg tggagactcg cccaggtgtt tttctcaggt gttttccgcg    420

ttccgggtca aagttggcgt tttgatatca agcttatcga taccgtcaaa caagtcttta    480

attcaagcaa gactttaaca agttaaaagg agcttatggg taggaagtag tgttatgatg    540

tatgggcata aagggtttta atgggatagt gaaaatgtct ataataatac ttaaatggct    600

gcccaatcac ctacaggatt gatgtaaaca tggaaaaggt caaaaacttg ggtcactaaa    660

atagatgatt aatggagagg atgaggttga tagttaaatg tagataagtg gtcttattct    720

caataaaaat gtgaacataa ggcgagtttc tacaaagatg gacaggactc attcatgaaa    780

cagcaaaaac tggacatttg ttctaatctt tgaagagtat gaaaaattcc tattttaaag    840

gtaaaacagt aactcacagg aaataccaac ccaacataaa atcagaaaca atagtctaaa    900

gtaataaaaa tcaaacgttt gcacgatcaa attatgaatg aaattcacta ctaaaattca    960

cactgatttt gtttcatcca cagtgtcaat gttgtgatgc atttcaattg tgtgacacag   1020

gcagactgtg gatcaaaagt ggtttctggt gcgacttact ctcttgagta tacctgcagt   1080

cccctttctt aagtgtgtta aaaaaaaagg gggatttctt caattcgcca atactctagc   1140

tctccatgtg ctttctagga aacaagtgtt aacccacctt atttgtcaaa cctagctcca   1200

aaggactttt gactccccac aaaccgatgt agctcaagag agggtatctg tcaccagtat   1260

gtatagtgaa aaaagtatcc caagtcccaa cagcaattcc taaaaggagt ttatttaaaa   1320

aaccacacac acctgtaaaa taagtatata tcctccaagg tgactagttt taaaaaaaca   1380

gtattggctt tgatgtaaag tactagtgaa tatgttagaa aaatctcact gtaaccaagt   1440

gaaatgaaag caagtatggt ttgcagagat tcaaagaaaa tataagaaaa cctactgttg   1500

ccactaaaaa gaatcatata ttaaatatac tcacacaata gctcttcagt ctgataaaat   1560

ctacagtcat aggaatggat ctatcactat ttctattcag tgctttgatg taatccagca   1620

ggtcagcaaa gaatttatag ccccccttga gcacacagag ggctacaatg tgatggcctc   1680

ccatctcctt catcacatct cgagcaagac gttcagtcct acagaaataa aatcaggaat   1740

ttaatagaaa gtttcataca ttaaacttta taacaaacac ctcttagtca ttaaacttcc   1800

acaccaacct gggcaatata gtgagacccc atgcctgcaa aaaaaaaaaa attagccagg   1860

catggtagca tgtacctgta gtcccagcta cttgagaggt gaggtgggaa aatcacttta    1920

gtgcaggatg ttgaggctgg agtgaactgt gattgtgcca ctgcactcca gcctggacaa    1980

tagagcaaga ccttgtctca aaaaaatgca ttaaaaattt tttttaaatc ttccacgtat    2040

cacatccttt gccctcatgt ttcataaggt aaaaaatttg ataccttcaa aaaaaccaag    2100

cataccacta tcataatttt ttttaaatgc aaataaaaac aagataccat tttcacctat    2160

cagactggca ggttctgatt aaatgaaatt ttctggataa tatacaatat taagagagac    2220

tgtagaaact gggccagtgg ctcatgcctg taatcccagc actttgggag gctgggtaac    2280

atggcgaacc ctgtttctac aaaataaaaa tattagctgg gagtggtggc gcacacctat    2340

agtcccagct actcaggagg ctgaggtgga aggatcgctt gaacccagga ggttgagact    2400

gcagtgaact gtgatcattc tgctgcactg caccccagcc tgggcaacag agaccttgtc    2460

tcaaaaaaaa aaaaaaaaga gacaaattgt gaagagaaag gtactctcat ataacatcag    2520

gagtataaaa tgattcaact tcttagagga aaatttggca ataccaaaat attcaataaa    2580

ctctttcccc ttgacccaga aattccactt gaataaagct gaacaagtac caaacatgta    2640

aaagaatgtt tcttctagta cagtcggtaa gaacaaaata gtgtctatca atagtggact    2700

ggttaaatca gttatggtat ctccataaga cagaatgcta tgcaaccttt aaaatatatt    2760

agatagctct agacacacta atattaaaag tgtccaataa catttaaaac tatactcata    2820

cgttaaaata taaatgtata tatgtacttt tgcatatagt atacatgcat aggccagtgc    2880

ttgagaagaa atgtgtacag aaggctgaaa ggagagaact ttagtcttct tgtttatggc    2940

ctccatagtt agaatatttt ataacacaaa tattttgata ttataatttt aaaataaaaa    3000

cacagaatag ccagacatac aatgcaagca ttcaatacca ggtaaggttt ttcactgtaa    3060

ttgacttaac agaaaatttt caagctagat gtgcataata ataaaaatct gaccttgcct    3120

tcatgtgatt cagccccagt ccattaccct gtttaggact gagaaatgca agactctggc    3180

tagagttcct tcttccatct cccttcaatg tttactttgt tctggtccct acagagtccc    3240

actataccac aactgatact aagtaattag taaggccctc ctcttttatt tttaataaag    3300

aagattttag aaagcatcag ttatttaata agttggccta gtttatgttc aaatagcaag    3360

tactcagaac agctgctgat gtttgaaatt aacacaagaa aaagtaaaaa acctcatttt    3420

aagatcttac ttacctgtcc ataattagtc catgaggaat aaacaccctt tccaaatcct    3480

cagcataatg attaggtatg caaaataaat caaggtcata acctggttca tcatcactaa    3540

tctgaaaaag aaatatagct gtttcaatga gagcattaca ggatacaaac atttgattgg    3600

attaagatgt taaaaaataa ccttagtcta tcagagaaat ttaggtgtaa gatgatatta    3660

gtaactgtta actttgtagg tatgataatg aattatgtaa gaaaacaaca ggccgggcgg    3720

gttggttcac acgtgtaatc ccagcacttt gggaggctga ggcaggcaga ctgcctgagc    3780

tcaggagttc gagaccagcc tgggcaacac ggtgaaatcc cgtctctact aaaaatacaa    3840

aaaaattagc cgggtgtggt gacacatgcc tgtagtccca gctacttggg aggctgaggc    3900

aggagaatca cttgaacctg ggaggtgaag gttgcagtga gccaagatgg caccacttca    3960

ctccagcctg ggaaacagag caagactctg tctctgagct gagatggcac cacttcactc    4020

cagcctggga aacagagcaa gactctgtct caaaaaaaac aaaacacaca aacaaaaaaa    4080

caggctgggc gcggtggctc acgcctgtaa tcccagcact ttgggaggcc gaggcgggtg    4140

gatcacctga ggtcaggagt tccagaccag ccttgtcaac atggtgaaac ctccccccgc    4200

cgtctctact aaaaatacaa aaattagcca ggcgtggtgg caggagcctg taatcccagc    4260

tacttgggag gctgaggcag gagaatcgct tgtacccaga aggcagaggt tgcactgagc    4320

tgagatggca ccattgcact ccagcctggg ggacaagagc gagatttcgt ctttaaaaaa    4380

caaaaacaaa acaaaaaacc atgtaactat atgtcttagt catcttagtc aagaatgtag    4440

aagtaaagtg ataagatatg gaatttcctt taggtcacaa agagaaaaag aaaaatttta    4500

aagagctaag acaaacgcag caaaatcttt atatttaata atattctaaa catgggtgat    4560

gaacatacgg gtattcatta tactattctc tccacttttg agtatgtttg aaaatttagt    4620

aaaacaagtt ttaacacact gtagtctaac aagataaaat atcacactga acaggaaaaa    4680

ctggcatggt gtggtggctc acacttgtaa tcccagtgct ttgggaggct gagacaggag    4740

agttgcttga ggccaggagt tcaagaccga catggggaat gtagcaagac cccgtcccta    4800

caaaaaactt tgtaaaaatt tgccaggtat ggtggtgcat acctgtagtc ccagctactc    4860

gggaggcgga ggcagaagga atcacttgag cccaggagtt tgaggctgca gtgagctacg    4920

atcataccac agcactccag cgtggacaac agagtaagac cctatctcaa aaacaaaaca    4980

aaacaaaaca aacaaaaaaa accacaagaa aaactgctgg ctgatgcagc ggctcatgcc    5040

tgtaatccca gtattttggg aggcccaggt gggcgtatca cctgaggtca ggagttagag    5100

accagcctgg ccaacatggt gaaaccccat ctctactaaa aatacaaaat tagccaggca    5160

tgtggcacgc gcctgtagtc ccagttactg ggaggctgaa gcaggaggat cacctgagcc    5220

cgggaggtgg aggttgcagt gagccgagat cacaccactg cactccagcc tgggtgacac    5280

agcaataccc tacctcaaaa taaaaaagaa aaagaaaaga aaagttgctg tccccgctac    5340

cccaatccca aatccaaaca gcctctctca tctcacagta agggggaaaa atcacccaaa    5400

aaagctaagt gatcttttga aaacccaaac tcttagaagt ctaagattat tatagtcaac    5460

tcatgaagtg tcatcataaa agatactcta atattattta agtagaacca catattggtt    5520

gtcttggtat gtctagcccc tggcatacaa aatatttaat aacactgata tggtacctgt    5580

gatgtgaaaa tgtactatga gtacagcttt ataaatacta tatatgtacc tatatacaga    5640

aaaaaataca acaaaatcat aaaagcactt atctttgaaa gaggagttac agcaatttta    5700

tttagttctt tattgctttg ctatatattc taaatttttt tcaatgaata tatatcactt    5760

ttaaaaaaat tcaatggtct ttcttataaa ttatctttgg cagcatgcgt ttttatatat    5820

acatataaaa tgtatgggaa atttttaaag gatacattaa attaaagcaa aatatacaaa    5880

caaaaaatca gaatacaaaa agataaaaag attgggaagg gagggaggga gtaaggagga    5940

agggtgggtg ggtatagaga aatataccaa ataatggtaa gaagtggggt cttgacactt    6000

tctacacttt ttttaaataa aaaaaatttt tttctctctc tttttttttt ttagagacga    6060

agtctcgcta tgttgcccag gctggtcttg aactcctggg atcaagagat cctcctgcct    6120

cagcctccca aggtgcttgg attacaggtg tgagccacca cgcctggtca ctttctacac    6180

tttaatatat atattttttc attttcaatg tcatttttat tagttaattt ataataccca    6240

ttcaccatta tattcaaagt ctatttgaag aaataaacca gaaagaatga aatactctag    6300

ctcacatgct attcaatact aaattacctt tcaaatcaca ttcaagaagc tgatgattta    6360

agctttggcg gtttccaata aatattggtc aaaccataat taaatctcaa tatatcagtt    6420

agtacctatt gagcatctcc ttttacaacc taagcattgt attaggtgct taaatacaag    6480

cagcttgact tttaatacat ttaaaaatac atatttaaga cttaaaatct tatttatgga    6540

attcagttat attttgaggt ttccagtgct gagaaatttg aggtttgtgc tgtctttcag    6600

tccccaaagc tcagttctga gttctcagac tttggtggaa cttcatgtat tgtcaggttg    6660

gcccgtaata cctgtgggac aacttcagcc cctgtgcaca tggccaggag gctggttgca    6720

aacattttca ggtaggtgga ccaggacatg cccctggtca tggccaggtg gaggcatagt    6780

gctatacagc aggcagaagt caatattgat ttgtttttaa agaaacatgt actactttca    6840

taagcagaaa aaatttctat tcttggggga aaagattatg ccagatcctc taggattaaa    6900

tgctgatgca tctgctaaac cttcacatat cagaacatat ttactataga aagaatgaaa    6960

atgggacatt tgtgtgtcac ctatgtgaac attccaaaaa tattttacaa caactaagta    7020

ttttataaat tttatgaact gaaatttagt tcaagttcta ggaaaataca aaccttgcta    7080

gatattataa aaatgataca atatatattc atttcaggct catcagaata tatctgttat    7140

cacttgacaa gaatgaaaat gcaccatttt gtagtgcttt aaaatcagga agatccagag    7200

tactaaaaat gacttcttcc ttgaagctta ctcaccaact tcctcccagt tactcactgc    7260

ttctgccaca agcataaact aggacccagc cagaactccc ttgaaatata cacttgcaac    7320

gattactgca tctatcaaaa tggttcagtg cctggctaca ggttctgcag atcgactaag    7380

aatttgaaaa gtcttgttta tttcaaagga agcccatgtg aattctgccc agagttcatc    7440

ccagatatgc agtctaagaa tacagacaga tcagcagaga tgtattctaa aacaggaatt    7500

ctggcaatat aacaaattga tttccaatca aaacagattt acataccata cttatgtcaa    7560

gaagttgttt tgttttattg catcctagat tttatttttt tgatttatgg tttactttaa    7620

gcataaaaaa tttgtcaata caactcttcc caaaaggcat aaacaaaaat tcataaaact    7680

tgcatcactt gagatacttc aggtatgaat tcacaacttt gttacaactt actatatata    7740

tgcacacata tatatatatt tgggtatatt gggggggttc taatttaaga aatgcataat    7800

tggctataga cagacagttg tcagaacttg gcaatgggta cgtgcaggtt cattatacca    7860

agtctacttg tagttgttca aaatgtatca taatacaagg ccgggcgagg tcgtcacgcc    7920

tgtaatccca gcattttggg aggctaaggc aggaggattg cttgaggtca ggagtttgtg    7980

accagcctgg gcaacagagc aagaccctgt ctccaaaaag aaaaaaaata attttttaca    8040

aaataaaaac aaaatgtatc atcagacgaa attaaataag aggcaattca tttaaatgac    8100

aacttttccc agcttgacat ttaacaaaaa gtctaagtcc tcttaattca tatttaatga    8160

tcaaatatca aatactaatt tttttttttt tttttttttt gagacggagt ctcgctctgt    8220

cgcccaggct ggagtgcagt ggcgcgatcc tggctcactg caagctccgc ctcccgggtt    8280

cacgccattc tcctgcctca gcctcccgag tagctgggat tacagacatg cgccaccacg    8340

cccggctaat tttgtatttt tagtagagat ggggtttctc catgttggtc aggctggtct    8400

tgaatttccc acctcaggtg atctgcctgc ctcagcctca caaagcagta gctgggacta    8460

caggcaccca ccaccacact tggttaattc ttttgtattt tttttgtaaa gacgggattt    8520

caccatgtta gccaggatgg tctcgatctc ctgatctcat gatccgcccg cctcagcctc    8580

ccaaagtgct gggattacag gcgtgagcca ccccgcccgg ccatcaaata ctaattctta    8640

aatggtaagg acccactatt cagaacctgt atccttatca ctaatatgca aatatttatt    8700

gaatacttac tatgtcatgc atactagaga gagttagata aatttgatac agctaccctc    8760

acagaactta cagtgtaata gatggcatga catgtacatg agtaactgtg aacagtgtta    8820

aattgctatt taaaaaaaaa gacggctggg cgctgtggct catgcctgta atcccagcac    8880

tttgggaggc caaggcaagt tgatcgctcg aggtcaagag ttcgagacca gcctggccaa    8940

cgtggtaaaa ccccgtctct actaaaaata caaaaaaaaa attagccagg catggtggca    9000

caggcctgta atcccagcta ctagggaggc tgagacatgg agaactgctt gaatccagga    9060

ggcagaggtt acagtgagcc gagatcatac cactacactc cagcctgagt gacagagcga    9120

gactcctgtc taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagatacagg ttaagtgtta tggtagttga    9180

agagagaact caaactctgt ctcagaagcc tcacttgcat gtggaccact gatatgaaat    9240

aatataaata ggtataattc aataaatagg aacttcagtt ttaatcatcc caaacaccaa    9300

aacttcctat caaacaggtc caataaactc aatctctata agagctagac agaaatctac    9360

ttggtggcct ataatcttat tagcccttac ttgtcccatc tgatattaat taaccccatc    9420

taatatggat tagttaacaa tccagtggct gctttgacag gaacagttgg agagagttgg    9480

ggattgcaac atattcaatt atacaaaaat gcattcagca tctaccttga ttaaggcagt    9540

gtgcaacaga atttgcagga gagtaaaaga atgattataa atttacaacc cttaaagagc    9600

tatagctggg cgtggtggct catgcctgta aatcccagca ctttgggagg ctgaggcggg    9660

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tacaaaaaat acaaaaatta gccgggtgtg gtggcacgtg cctgtagtcc cagttacttg    9780

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aaaaaaaaaa aaagcttaaa atctagtggg aaaggcatat atacatacaa ctaactgtat    9960

agcataataa agctcataat ctgtaacaaa atctaattcg acaagcccag aaacttgtga   10020

tttaccaaaa acagttatat atacacaaaa agtaaaccta gaacccaaag ttacccagca   10080

ccaatgattc tctccctaag cagtatcaag tttaaagcag tgattacatt ctactgccta   10140

gattgtaaac tgagtaaagg agaccagcac ctttctgcta ctgaactagc acagccgtgt   10200

aaaccaacaa ggcaatggca gtgcccaact ttctgtatga atataagtta catctgtttt   10260

attatttgtg acttggtgtt gcatgtggtt attatcaaca ccttctgaaa gaacaactac   10320

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cacagttttg gaggctggga agtccaaaat taaggtacct gcaaggtagg tttcaatctc   10440

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gctctctggt gtctcttttt tttttttttt cttttttgag acagagtctc actctgtcac   10560

ccaggctgga gtacagtggc acaatctggg ctcactgcaa cctccaactc ccgggttcaa   10620

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ctgacgccgg caggttcgac ttggtctttg tgaacattca cacggaattc agaatccacc    15060

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cctctacgct acaccagatg aataccaagc tgagtgccgt gtatgccgga gaagccatgc    15360

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cgctgtactc gtactttgaa ggtacgaaat tcaaccaggc tgctattgat atggcagaga    16020

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acgtagtgtt tccagacatg tcgggcaccg cactatcatg ggtgcagaaa atctcgggtg    21480

gtctgggggc cttcgcaatc ggcgctatcc tggtgctggt tgtggtcact tgcattgggc    21540

tccgcagata agttagggta ggcaatggca ttgatatagc aagaaaattg aaaacagaaa    21600

aagttagggt aagcaatggc atataaccat aactgtataa cttgtaacaa agcgcaacaa    21660

gacctgcgca attggccccg tggtccgcct cacggaaact cggggcaact catattgaca    21720

cattaattgg caataattgg aagcttacat aagcttaatt cgacgaataa ttggattttt    21780

attttatttt gcaattggtt tttaatattt ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    21840

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aactagatcc tcgaatcaag    21900

cttatcgata ccgtcgacta gagtcggggc ggccggccgc ttcgagcaga catgataaga    21960

tacattgatg agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt    22020

gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac    22080

aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga ggttttttaa    22140

agcaagtaaa acctctacaa atgtggtaaa atcgataagg atctcgacct cgaggggggg    22200

cccggtaccc aattcgccct atagtgagtc gtattacgcg cgcccctgca gggggccctg    22260

taccgggctc tgcctgaggc tctggctgcc cagcaggctg aagctggggt tgttggccag    22320

gggcacttgt gttcccatcg cagcgggcac ttgtgcctcc caatcagatg gcctctgaag    22380

gcaggcctgg ccagaaggtg agtgctgctg aacgctatta tccacttggc tgaggggtgt    22440

tttccccgaa actgctgtgg tcacagctgc tgccgctgtg acccatgcag cattgttgaa    22500

cgcagtgggc attcttggca cactaggccg tctgagctgg tggggactca aggactgggt    22560

gcccagggag ctgggacaga acccaggcag gggcacttct ggtggggtgg ccttggggct    22620

ctgcatatgc tggcagacag agtcaagtct gcccagggga gtctggcctg agtgtgagag    22680

gatgggacac tgggggctgg aggtgaaaat tccttgccgc ttccccagag ttggtgagat    22740

cactcccatg ccctcgcagc tctggtgcct ggtgagtggg atcattcctg gactcagatt    22800

gttctgaaga agcccagttc tgggtggcat caagtgcttg ctagatgggg ggcttgcctt    22860

gatccggcta cacttggagg tgacttgttc ttggacggct acatacagaa agagagaagt    22920

ggggatgagt tccaaaggca tcctcgactt cggctgtggc caccggaggg tagctcctgg    22980

cccaacacgg acttctcacc tcccgccctt ggctctctac tgagctcccc cctgctcccc    23040

aattcctcgc cattcccctc atttctctgc cctcagcctg gactgcagtt cttctgggaa    23100

gctgccccaa ctccctaggt ctgtgctcac caagagcaga tcacactgga ctgaaatgcc    23160

agctgatttg tctcttcaag aaaattggaa gctcctggag gtcagggtcc atgtctgctt    23220

ttacactcag tgctctgtat gcaggcctgg cactgcccac cctttgacag gtggtgcata    23280

ttttgtagaa ggaaggaagg ggccaggtgg ggtgggctgg gctggtggcg ggagctagct    23340

cagcctctta gattctctac ccgatggatg tgacctggga cagcaagtga gtgtggtgag    23400

tgagtgcaga cggtgctttg ttcccctctt gtctcatagc ctagatggcc tctgagccca    23460

gatctggggc tcagacaaca tttgttcaac tgaacggtaa tgggtttcct ttctgaaggc    23520

tgaaatctgg gagctgacat tctggactcc ctgagttctg aagagcctgg ggatggagag    23580

acacggagca gaagatggaa ggtagagtcc caggtgccta agatggggaa tacatctccc    23640

ctcattgtca tgagagtcca ctctagctga tatctactgt ggccaatatc taccggtact    23700

tttttggggt ggacactgag tcatgcagca gtcttatggt ttacccaagg tcaggtaggg    23760

gagacagtgc agtcagagca caagcccagt gtgtctgacc cacccaagaa tccatgctcg    23820

tatctacaaa aatgattttt tctcttgtaa tggtgcctag gttcttttat tatcatggca    23880

tgtgtatgtt tttcaactag gttacaatct ggccttataa ggttaacctc ctggaggcca    23940

ccagccttcc tgaaacttgt ctgtgctgtc cctgcaactg gagtgtgcct gatgtggcac    24000

tccagcctgg acaagtggga cacagactcc gctgttatca ggcccaaaga tgtcttccat    24060

aagaccagaa gagcaatggt gtagaggtgt catgggctac aataaagatg ctgacctcct    24120

gtctgagggc aagcagcctc ttctggccct cagacaaatg ctgagtgttc ccaagactac    24180

cctcggcctg gtccaatctc atcccactgg tgcgtaaggg ttgctgaact catgacttct    24240

tggctagcct gcaacctcca cggagtggga actacatcag gcattttgct aactgctgta    24300

tcctaggcca ataaatgttg atcacattta tagctgccat ggtagggtgg ggacccctgc    24360

tatctatctg tggaggctct gggagcccct gacacaaact ttctgaagca gagcctcccc    24420

aacccctttt ccattcccta tacctgacag atggcccagg aacccattag aaatggaagg    24480

tcactgcagc agtatgtgaa tgtgcgtgtg ggagaagggc aggatcagag ccctgggggt    24540

gtggcagccc ccaagtgatt ctaatccaga tcctagggtt gtttccctgt cccattgaaa    24600

tagctgcttt aaggggcctg actcagggaa atcagtctct tgaattaagt ggtgattttg    24660

gagtcattta gaccaggcct tcaattggga tcctgctctt agagttggat gaattattta    24720

actgattttc agatctcctc tttctcaatg ctttcagaag cacagtaact gcttactctg    24780

aaatgaattc tcaccccact tccacatatg caccccttgc ccaccccttt gggaacactg    24840

gccttaactg cttaccttca aatggactca tctgttggga gatatatgca ttctgccgtt    24900

caggggtcat tgccataaga cctgatctct gttcctcttg ctaaacagaa gatgaaaaag    24960

acaaattaga ttacagctac caattaataa ttagccttag gatcgctgcg tggggaccta    25020

ggacttggct ttggtgcagc agaaagcatg aataaacaca ccagcataca ctcgcatgca    25080

tgccccaccc tctcgagcaa aattccacag gtataaataa agtaagattc tgcacctggg    25140

ttaaaaacac aactgcaaca gcatagaatg gggcaggaga gacagaactt aatagcaaga    25200

gcacacagaa aaaagtttta ggcattttgg atgtccatct gctcaggatg ggtcagcagt    25260

gagatgcggt caccaaaaga acaaatgtaa cattaggctg cattaataga agcagagtat    25320

gtagaaggag ggaggtgaca gtcctatgct aactctgcct tggccagact atacccacag    25380

gagtctgggc atgccagtct cagggagacc cagacagact ggctgcattc agaggatggt    25440

aagtaatgag agtggggatt ggacttcaaa ctacccagac aaagaatggc tgagcaagcc    25500

aaggatgctg tggctggggc agagcagact gtgggctatg tagtggtgga tacctagcct    25560

ctgcagggct gtcataggga aaggacattg agaagaggac tgaggcttgt tcctggtggt    25620

cctggcatga acggccagat gatcacatgg tcaggtggac acagtctcca acactgggag    25680

tagccaaaca cttactgcca acctcccgcc cttctcctga ctagttgcag cataggcaat    25740

tgggaggagc ttcctgtctc catctgaaag ctggctgggt gggcaggggg aggagcgagc    25800

caagtttcaa ggccgcagtt tcagcactca gtctgggatc ggctcaagga gcaaagggga    25860

agaacatagc caggagggaa taacatgaag gcccccagac ccagaaaagg catgacttgc    25920

tctgagaccc tcagccggtt ggtgtcaggt tgtgactcgg atccaggtct gactcccagt    25980

ccagtgcttg aagcctcacc ccacacagtg aggggagccc ggccatctct gctcaactgc    26040

tgccatctct ctccccttct caaccaccaa ggcagctctg tctgggagca caagctccaa    26100

gtccactttc tggtctgtgt cccccccaag atgccagagg acttgcctct acaacacggg    26160

ctgcccgtgc agtgcctgct tttccagcaa agggcttctg ggaacccttc tctgcactca    26220

gtggggctgg tgggagtggg gcggggtagc gacccagtgc ttgggactgt gcccagctct    26280

caggcctggc agcagttcct ggccttggtt cctgccaagg cagagaggac aaacacatgg    26340

caccgggaag actacaccag aagcgattcc accagactgg ggtttgcttt tctatcccgc    26400

ccttagcctg cttcctgtcc tggtccctgc ctccccctcc actggagctg ccgtgtgggc    26460

agtgaggggc tgtttctcag ctgccctatg gagctgccct ctccctgcca aagcattggc    26520

aaggcggcaa ggggtggggg tggggatggg gggtgggatc tgccttctca agctctcatt    26580

atactgagca cgtctcaccc attattttat gtcatctagc aacaccccat gtggacactg    26640

aggagcatgg gggtcacatg accactgccc aaggccacac catccggatc tgcctgagat    26700

ggtcagggtt ggcagccatt tctgaaggca gtcctttcgc tttggctctt cttgtaccag    26760

tctcaggaca tcagggcaga agatctacag tccccagctt actgatgtga cagcagaggc    26820

tcagagaggt taaatgactt gcccaaggtg acacggctaa gaagtacagt atctcctaac    26880

tgcagaccag gtgcttctgc tgcttctggg gacagattcc tgcgtggctg gctaggtcta    26940

aacggtcctt aactccatcc ccaccggttg ctgcattagt ttcatcaaat aacacagttg    27000

tacagaggta ggggttcagg ggcaggggca gatggaggct ggagagtgtg actaaggaaa    27060

cagcagggga agtgcggtaa agtccgaagg gagggacgga aagagaaagc caagcccagg    27120

ggcgtgccag acaaaaggaa aggccacgcc ggggcagggc aggcttcagc gggtgctggg    27180

gcgtcttcat cccgggaagc acacattcca gaggaccccg gagtctaatg gaaaagctgg    27240

ccagcctatc actatggaaa ctgccaaggc cacacagcgc tgctgacacc cagcctgggt    27300

gccggtggcc agctctgcag gatcttcaag tctggggtgc caccagcaag cgacggtcct    27360

ccatgggctc ttcaccttac ggcagtgtcc agaggcaccg ccagtcctct gctcctatgc    27420

tggtcctgct gtccctggca aaaggagcca gagcattctc tccaggcctc ccgaggaggc    27480

tgcttccttt gttttgcaga tggaggctcc catcctttgt tctgaatcaa tgtgctccaa    27540

agataagccc caagaaaaca gttgttgcct tttgacactg acaattagaa tcgttggaaa    27600

atggagaaaa caggaaatgg caaatggttt cagtgaccag gaggaaaccg tgcctgaaag    27660

ttgctgctta gtgactggga cactcgcttt ctgctctctt atgaaggaca gcctaggccg    27720

tgtggccttt tataaacaaa gctatgaagg ggtcgtcaaa ttttctaggg ctgcaactgt    27780

ggcactacgt cctgttgtgc caggtgacac tgacaagcag cactgagttc tatgcaagcc    27840

caggtgtgct tctctcatgg tgacccccag agaactaagg cccagctctt cctctgtcac    27900

acccctccca gcccccactg tcagacaagg gaccacattc acagacagtc tcagccaaga    27960

tggcaacctt ggaagtcctg gggatgcctt tctagaagct cgcgccccta ggggccggcc    28020

ttaattaaat caagcttatc gataccgtcg agacctcgag ggggggcatc actccgccct    28080

aaaacctacg tcacccgccc cgttcccacg ccccgcgcca cgtcacaaac tccaccccct    28140

cattatcata ttggcttcaa tccaaaataa ggtatattat tgatgatgtt t             28191

<210>11

<211>5844

<212>DNA

<213>质粒

<220>

<221>MCS

<222>(1)..(25)

<223>多克隆位点

<220>

<221>AFP增强子

<222>(26)..(820)

<223>AFP增强子

<220>

<221>AFP pro

<222>(828)..(1054)

<223>AFP启动子

<400>11

ggtaccgagc tcttacgcgt gctagaattc gcctgtcata cagctaataa ttgaccataa     60

gacaattaga tttaaattag ttttgaatct ttctaatacc aaagttcagt ttactgttcc    120

atgttgcttc tgagtggctt cacagactta tgaaaaagta aacggaatca gaattacatc    180

aatgcaaaag cattgctgtg aactctgtac ttaggactaa actttgagca ataacacaca    240

tagattgagg attgtttgct gttagcatac aaactctggt tcaaagctcc tctttattgc    300

ttgtcttgga aaatttgctg ttcttcatgg tttctctttt cactgctatc tatttttctc    360

aaccactcac atggctacaa taactgtctg caagcttatg attcccaaat atctatctct    420

agcctcaatc ttgttccaga agataaaaag tagtattcaa atgcacatca acgtctccac    480

ttggagggct taaagacgtt tcaacataca aaccggggag ttttgcctgg aatgtttcct    540

aaaatgtgtc ctgtagcaca tagggtcctc ttgttcctta aaatctaatt acttttagcc    600

cagtgctcat cccacctatg gggagatgag agtgaaaagg gagcctgatt aataattaca    660

ctaagtcaat aggcatagag ccaggactgt ttgggtaaac tggtcacttt atcttaaact    720

aaatatatcc aaaactgaac atgtacttag ttactaagtc tttgacttta tctcattcat    780

accactcagc tttatccagg ccacttattt gacagtctag ctagccccta gattttctgc    840

cccaaagagc tctgtgtcct tgaacataaa atacaaataa ccgctatgct gttaattatt    900

ggcaaatgtc ccattttcaa cctaaggaaa taccataaag taacagatat accaacaaaa    960

ggttactagt taacaggcat tgcctgaaaa gagtataaaa gaatttcagc atgattttcc   1020

atattgtgct tccaccactg ccaataacag gatcgggctc gagatctgcg atctaagtaa   1080

gcttggcatt ccggtactgt tggtaaagcc accatggaag acgccaaaaa cataaagaaa   1140

ggcccggcgc cattctatcc gctggaagat ggaaccgctg gagagcaact gcataaggct   1200

atgaagagat acgccctggt tcctggaaca attgctttta cagatgcaca tatcgaggtg   1260

gacatcactt acgctgagta cttcgaaatg tccgttcggt tggcagaagc tatgaaacga   1320

tatgggctga atacaaatca cagaatcgtc gtatgcagtg aaaactctct tcaattcttt   1380

atgccggtgt tgggcgcgtt atttatcgga gttgcagttg cgcccgcgaa cgacatttat   1440

aatgaacgtg aattgctcaa cagtatgggc atttcgcagc ctaccgtggt gttcgtttcc   1500

aaaaaggggt tgcaaaaaat tttgaacgtg caaaaaaagc tcccaatcat ccaaaaaatt   1560

attatcatgg attctaaaac ggattaccag ggatttcagt cgatgtacac gttcgtcaca   1620

tctcatctac ctcccggttt taatgaatac gattttgtgc cagagtcctt cgatagggac   1680

aagacaattg cactgatcat gaactcctct ggatctactg gtctgcctaa aggtgtcgct   1740

ctgcctcata gaactgcctg cgtgagattc tcgcatgcca gagatcctat ttttggcaat    1800

caaatcattc cggatactgc gattttaagt gttgttccat tccatcacgg ttttggaatg    1860

tttactacac tcggatattt gatatgtgga tttcgagtcg tcttaatgta tagatttgaa    1920

gaagagctgt ttctgaggag ccttcaggat tacaagattc aaagtgcgct gctggtgcca    1980

accctattct ccttcttcgc caaaagcact ctgattgaca aatacgattt atctaattta    2040

cacgaaattg cttctggtgg cgctcccctc tctaaggaag tcggggaagc ggttgccaag    2100

aggttccatc tgccaggtat caggcaagga tatgggctca ctgagactac atcagctatt    2160

ctgattacac ccgaggggga tgataaaccg ggcgcggtcg gtaaagttgt tccatttttt    2220

gaagcgaagg ttgtggatct ggataccggg aaaacgctgg gcgttaatca aagaggcgaa    2280

ctgtgtgtga gaggtcctat gattatgtcc ggttatgtaa acaatccgga agcgaccaac    2340

gccttgattg acaaggatgg atggctacat tctggagaca tagcttactg ggacgaagac    2400

gaacacttct tcatcgttga ccgcctgaag tctctgatta agtacaaagg ctatcaggtg    2460

gctcccgctg aattggaatc catcttgctc caacacccca acatcttcga cgcaggtgtc    2520

gcaggtcttc ccgacgatga cgccggtgaa cttcccgccg ccgttgttgt tttggagcac    2580

ggaaagacga tgacggaaaa agagatcgtg gattacgtcg ccagtcaagt aacaaccgcg    2640

aaaaagttgc gcggaggagt tgtgtttgtg gacgaagtac cgaaaggtct taccggaaaa    2700

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gtgtaattct agagtcgggg cggccggccg cttcgagcag acatgataag atacattgat    2820

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gatgctattg ctttatttgt aaccattata agctgcaata aacaagttaa caacaacaat    2940

tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg gaggtgtggg aggtttttta aagcaagtaa    3000

aacctctaca aatgtggtaa aatcgataag gatccgtcga ccgatgccct tgagagcctt    3060

caacccagtc agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg cacttatgac    3120

tgtcttcttt atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca gcgctcttcc gcttcctcgc    3180

tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg    3240

cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag    3300

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gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag    3420

gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga    3480

ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc    3540

aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg    3600

tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt    3660

ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca    3720

gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca    3780

ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag    3840

ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca    3900

agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg    3960

ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa    4020

aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta    4080

tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag    4140

cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga    4200

tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac    4260

cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc    4320

ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta    4380

gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac    4440

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gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa    4560

gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg    4620

tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag    4680

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caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat    4860

cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg    4920

ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc    4980

aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta    5040

tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg    5100

cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta    5160

cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt    5220

tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg    5280

ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat    5340

cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac    5400

tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag    5460

ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg    5520

cgaattttaa caaaatatta acgtttacaa tttcccattc gccattcagg ctgcgcaact    5580

gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagcccaag ctaccatgat    5640

aagtaagtaa tattaaggta cgggaggtac ttggagcggc cgcaataaaa tatctttatt    5700

ttcattacat ctgtgtgttg gttttttgtg tgaatcgata gtactaacat acgctctcca    5760

tcaaaacaaa acgaaacaaa acaaactagc aaaataggct gtccccagtg caagtgcagg    5820

tgccagaaca tttctctatc gata                                           5844

<210>12

<211>2334

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>12

tcgaggtcga cggtatcgat aagcttgggc tgcaggtcga tcgactctag aggatcgatc     60

cccaccatgg gtcaatcacg ctacctcctc tttttggcca cccttgccct cctaaaccac    120

ctcagtttgg ccagggtcat tccagtctct ggacctgcca ggtgtcttag ccagtcccga    180

aacctgctga agaccacaga tgacatggtg aagacggcca gagaaaaact gaaacattat    240

tcctgcactg ctgaagacat cgatcatgaa gacatcacac gggaccaaac cagcacattg    300

aagacctgtt taccactgga actacacaag aacgagagtt gcctggctac tagagagact    360

tcttccacaa caagagggag ctgcctgccc ccacagaaga cgtctttgat gatgaccctg    420

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gtgggagaag cagaccctta cagagtgaaa atgaagctct gcatcctgct tcacgccttc    660

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aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg    1200

tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg    1260

gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatatgg ccacaaccat gggtcctcag    1320

aagctaacca tctcctggtt tgccatcgtt ttgctggtgt ctccactcat ggccatgtgg    1380

gagctggaga aagacgttta tgttgtagag gtggactgga ctcccgatgc ccctggagaa    1440

acagtgaacc tcacctgtga cacgcctgaa gaagatgaca tcacctggac ctcagaccag    1500

agacatggag tcataggctc tggaaagacc ctgaccatca ctgtcaaaga gtttctagat    1560

gctggccagt acacctgcca caaaggaggc gagactctga gccactcaca tctgctgctc    1620

cacaagaagg aaaatggaat ttggtccact gaaattttaa aaaatttcaa aaacaagact    1680

ttcctgaagt gtgaagcacc aaattactcc ggacggttca cgtgctcatg gctggtgcaa    1740

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gtgacatgtg gaatggcgtc tctgtctgca gagaaggtca cactggacca aagggactat    1860

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cccattgaac tggcgttgga agcacggcag cagaataaat atgagaacta cagcaccagc    1980

ttcttcatca gggacatcat caaaccagac ccgcccaaga acttgcagat gaagcctttg    2040

aagaactcac aggtggaggt cagctgggag taccctgact cctggagcac tccccattcc    2100

tacttctccc tcaagttctt tgttcgaatc cagcgcaaga aagaaaagat gaaggagaca    2160

gaggaggggt gtaaccagaa aggtgcgttc ctcgtagaga agacatctac cgaagtccaa    2220

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aagtgggcat gtgttccctg cagggtccga tcctagaatt cattgatcca ctag          2334

<210>13

<211>2336

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>13

ctgcagacca tgggtccagc gcgcagcctc ctccttgtgg ctaccctggt cctcctggac     60

cacctcagtt tggccagaaa cctccccgtg gccactccag acccaggaat gttcccatgc    120

cttcaccact cccaaaacct gctgagggcc gtcagcaaca tgctccagaa ggccagacaa    180

actctagaat tttacccttg cacttctgaa gagattgatc atgaagatat cacaaaagat    240

aaaaccagca cagtggaggc ctgtttacca ttggagttaa ccaagaatga gagttgccta    300

aattccagag agacctcttt cataactaat gggagttgcc tggcctccag aaagacctct     360

tttatgatgg ccctgtgcct tagtagtatt tatgaagact tgaagatgta ccaggtggag     420

ttcaagacca tgaatgcaaa gcttctgatg gatcctaaga ggcagatctt tctagatcaa     480

aacatgctgg cagttattga tgagctgatg caggccctga atttcaacag tgagactgtg     540

ccacaaaaat cctcccttga agaaccggat ttttataaaa ctaaaatcaa gctctgcata     600

cttcttcatg ctttcagaat tcgggcagtg actattgata gagtgacgag ctatctgaat     660

gcttcctaac tgcagaaggg cgaattccag cacactggcg gccgttacta ggggctgcag     720

gaattccgcc cccccctctc cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga     780

ataaggccgg tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc atattgccgt cttttggcaa     840

tgtgagggcc cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc     900

tctcgccaaa ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc     960

ttcttgaaga caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg    1020

cgacaggtgc ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa agcggcacaa    1080

ccccagtgcc acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc    1140

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gggcctcggt gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc    1260

ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatatgg ccacaaccat    1320

gggtcaccag cagttggtca tctcttggtt ttccctggtt tttctggcat ctcccctcgt    1380

ggccatatgg gaactgaaga aagatgttta tgtcgtagaa ttggattggt atccggatgc    1440

ccctggagaa atggtggtcc tcacctgtga cacccctgaa gaagatggta tcacctggac    1500

cttggaccag agcagtgagg tcttaggctc tggcaaaacc ctgaccatcc aagtcaaaga    1560

gtttggagat gctggccagt acacctgtca caaaggaggc gaggttctaa gccattcgct    1620

cctgctgctt cacaaaaagg aagatggaat ttggtccact gatattttaa aggaccagaa    1680

agaacccaaa aataagacct ttctaagatg cgaggccaag aattattctg gacgtttcac    1740

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ctcttctgac ccccaagggg tgacgtgcgg agctgctaca ctctctgcag agagagtcag    1860

aggggacaac aaggagtatg agtactcagt ggagtgccag gaggacagtg cctgcccagc    1920

tgctgaggag agtctgccca ttgaggtcat ggtggatgcc gttcacaagc tcaagtatga    1980

aaactacacc agcagcttct tcatcaggga catcatcaaa cctgacccac ccaagaactt    2040

gcagctgaag ccattaaaga attctcggca ggtggaggtc agctgggagt accctgacac    2100

ctggagtact ccacattcct acttctccct gacattctgc gttcaggtcc agggcaagag    2160

caagagagaa aagaaagata gagtcttcac ggacaagacc tcagccacgg tcatctgccg    2220

caaaaatgcc agcattagcg tgcgggccca ggaccgctac tatagctcat cttggagcga    2280

atgggcatct gtgccctgca gttagatatc aagcttatcg ataccgtcga cctcga        2336

<210>14

<211>3057

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>14

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cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat     120

cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gctttgcctg gtttccggca     180

ccagaagcgg tgccggaaag ctggctggag tgcgatcttc ctgaggccga tactgtcgtc     240

gtcccctcaa actggcagat gcacggttac gatgcgccca tctacaccaa cgtaacctat     300

cccattacgg tcaatccgcc gtttgttccc acggagaatc cgacgggttg ttactcgctc     360

acatttaatg ttgatgaaag ctggctacag gaaggccaga cgcgaattat ttttgatggc     420

gttaactcgg cgtttcatct gtggtgcaac gggcgctggg tcggttacgg ccaggacagt     480

cgtttgccgt ctgaatttga cctgagcgca tttttacgcg ccggagaaaa ccgcctcgcg     540

gtgatggtgc tgcgttggag tgacggcagt tatctggaag atcaggatat gtggcggatg     600

agcggcattt tccgtgacgt ctcgttgctg cataaaccga ctacacaaat cagcgatttc     660

catgttgcca ctcgctttaa tgatgatttc agccgcgctg tactggaggc tgaagttcag     720

atgtgcggcg agttgcgtga ctacctacgg gtaacagttt ctttatggca gggtgaaacg     780

caggtcgcca gcggcaccgc gcctttcggc ggtgaaatta tcgatgagcg tggtggttat     840

gccgatcgcg tcacactacg tctgaacgtc gaaaacccga aactgtggag cgccgaaatc     900

ccgaatctct atcgtgcggt ggttgaactg cacaccgccg acggcacgct gattgaagca     960

gaagcctgcg atgtcggttt ccgcgaggtg cggattgaaa atggtctgct gctgctgaac    1020

ggcaagccgt tgctgattcg aggcgttaac cgtcacgagc atcatcctct gcatggtcag    1080

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tcggcttacg gcggtgattt tggcgatacg ccgaacgatc gccagttctg tatgaacggt    1800

ctggtctttg ccgaccgcac gccgcatcca gcgctgacgg aagcaaaaca ccagcagcag    1860

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catagcgata acgagctcct gcactggatg gtggcgctgg atggtaagcc gctggcaagc    1980

ggtgaagtgc ctctggatgt cgctccacaa ggtaaacagt tgattgaact gcctgaacta    2040

ccgcagccgg agagcgccgg gcaactctgg ctcacagtac gcgtagtgca accgaacgcg    2100

accgcatggt cagaagccgg gcacatcagc gcctggcagc agtggcgtct ggcggaaaac    2160

ctcagtgtga cgctccccgc cgcgtcccac gccatcccgc atctgaccac cagcgaaatg    2220

gatttttgca tcgagctggg taataagcgt tggcaattta accgccagtc aggctttctt    2280

tcacagatgt ggattggcga taaaaaacaa ctgctgacgc cgctgcgcga tcagttcacc    2340

cgtgcaccgc tggataacga cattggcgta agtgaagcga cccgcattga ccctaacgcc    2400

tgggtcgaac gctggaaggc ggcgggccat taccaggccg aagcagcgtt gttgcagtgc    2460

acggcagata cacttgctga tgcggtgctg attacgaccg ctcacgcgtg gcagcatcag    2520

gggaaaacct tatttatcag ccggaaaacc taccggattg atggtagtgg tcaaatggcg    2580

attaccgttg atgttgaagt ggcgagcgat acaccgcatc cggcgcggat tggcctgaac    2640

tgccagctgg cgcaggtagc agagcgggta aactggctcg gattagggcc gcaagaaaac    2700

tatcccgacc gccttactgc cgcctgtttt gaccgctggg atctgccatt gtcagacatg    2760

tataccccgt acgtcttccc gagcgaaaac ggtctgcgct gcgggacgcg cgaattgaat    2820

tatggcccac accagtggcg cggcgacttc cagttcaaca tcagccgcta cagtcaacag    2880

caactgatgg aaaccagcca tcgccatctg ctgcacgcgg aagaaggcac atggctgaat    2940

atcgacggtt tccatatggg gattggtggc gacgactcct ggagcccgtc agtatcggcg    3000

gaattccagc tgagcgccgg tcgctaccat taccagttgg tctggtgtca aaaataa       3057

<210>15

<211>336

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>15

ctgcgctgtc ggggccaggc cgggctccca gtggattcgc gggcacagac gcccaggacc     60

gcgcttccca cgtggcggag ggactgggga cccgggcacc cgtcctgccc cttcaccttc    120

cagctccgcc tcctccgcgc ggaccccgcc ccgtcccgac ccctcccggg tccccggccc    180

agccccctcc gggccctccc agcccctccc cttcctttcc gcggccccgc cctctcctcg    240

cggcgcgagt ttcaggcagc gctgcgtcct gctgcgcacg tgggaagccc tggccgatgg    300

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