2位含脯氨酸或环状氨基酸的肽类内皮素受体拮抗剂

摘要

本发明涉及具有内皮素受体拮抗活性的2位含脯氨酸或环状氨基酸的肽类衍生物，其制备方法，含它们的药物组合物及它们在治疗与内皮素及前列腺有关疾病的用途。

说明书

发明领域

本发明涉及具有内皮素受体拮抗活性的2位含脯氨酸或环状氨基酸的肽类衍生物，其制备方法，含它们的药物组合物及它们在预防或治疗与内皮素及前列腺有关疾病的用途。

背景技术

内皮素(Endothelin，简称ET)是由血管内皮分泌的，它们是一类迄今发现的收缩血管作用最强的生物因子之一。人类或其它哺乳动物基因组存在三种分别编码内皮素的基因，形成的大内皮素在内皮素转换酶的作用下，转变为ET-1、ET-2、ET-3。它们均为二十一肽，含有两个二硫桥键。ET-1不但表达于非血管细胞，而且是唯一存在于血管内皮细胞的内皮素。ET-2和ET-3主要在脑、肾和肾上腺及小肠中。ET与靶细胞中的特异受体结合，最终产生相应的生物学效应。迄今已发现三类ET受体，即ET_A，ET_B，和ET_C。ET_A主要分布于主动脉、心房、胎盘，肺、脑血管及肾脏血管的平滑肌中；ET_B存在于中枢神经系统中的神经胶质细胞、脉落丛上皮细胞、肺、胎血、肾小球内皮、心室、脑中等，在血管平滑肌也有分布；ET_C则主要分布于内皮细胞中。三种受体对各型ET的亲和力不同。内皮素及受体在人体内具有广泛的生理病理学反应。参与了如高血压、充血性心衰、心肌缺血、脑窒息、休克、急性肾衰、肺源性高血压、血管痉挛性疾病等过程。因此ET受体被认为是治疗心脑血管疾病的切实可行的新靶点，其受体拮抗剂有助于预防/治疗心脑血管疾病。

发明内容

本发明的目的是寻找水溶性良好的新的内皮素受体拮抗剂。

本发明人经研究，现已发现式(I)肽类衍生物

R-CO-AA₁-AA₂-AA₃-OH    式(I)

或其立体异构体具有良好的内皮素受体拮抗活性，而且水溶性良好，因此式(I)肽类衍生物或其立体异构体可作为药物用于预防或治疗与内皮素及前列腺有关的疾病。

本发明第一方面涉及式(I)肽类衍生物或其立体异构体，

R-CO-AA₁-AA₂-AA₃-OH    式(I)

其中，R为双取代链烃亚胺基、六亚甲基亚胺基或以下基团

式中n₁、n₂、n₃为0，1，2，3整数，n₃≠0，0≤n₁+n₂≤4；X₁为NH、O、S、CH₂；X₂为N、CH；当n₁＝n₂＝1，n₃＝2，X₁为CH₂，X₂为N原子时，R缩写为ABO；

m₁、m₂、m₃和m₄为0，1，2整数，0≤m₁+m₂≤4，0≤m₃+m₄≤4；y₁、y₂和y₃为CH₂、O、S和NH，当它们为NH或CH₂时，可作为N端结构R，形式为N或CH；当m₁＝m₂＝1，m₃＝m₄＝2，y₁、y₂为O原子，y₃为N原子时，R缩写为DAD；当m₁＝m₂＝1，m₃＝m₄＝2，y₃为CH₂，y₁为O原子，y₂为N原子时，R缩写为CSO；

z为O、S、NH、CH₂；k为N、Ck₁(k₁为H、CH₃、CH₂CH₃)；j为H、CH₃、CH₂CH₃、CH₁(CH₃)₂；当z＝NH，k＝N，j＝H，R为哌嗪基；当z＝O，k＝N，j＝H，R为吗啉基；

AA₁为L或D型Ser、Thr、Phe、Cys、Gln、Asn、Ala、Ile、Leu、MeVal、Val或其它脂肪族非天然氨基酸，如β-Ala、γ-氨基丁酸、或氨基异丁酸；

AA₂为如下结构：(包括D构型和L构型)

式中n为0、1、2整数；A为O、S、CH₂；R₁为H、COOH、OH；R₂为H、COOH、OH；R₃为H、COOH、OH；R₁，R₂，R₃中有且只有一个为COOH；其中，当n＝0，A＝CH₂，R₁＝COOH，R₂＝R₃＝H时，AA₂为脯氨酸；当n＝0，A＝CH₂，R₁＝COOH，R₂＝OH，R₃＝H时AA₂为羟脯氨酸；

AA₃为D型的非天然芳香性氨基酸、色氨酸、苯基甘氨酸或非氨基酸，其中芳香环中的苯基可在2、3、4或5位上被选自卤素，硝基，脲基，甲氧基，羧基或C₁-C₄烷基单取代或二取代。

本发明还涉及含至少一种式(I)肽类衍生物或其立体异构体，

R-CO-AA₁-AA₂-AA₃-OH    式(I)

其中，R为双取代链烃亚胺基、六亚甲基亚胺基或以下基团

式中n₁、n₂、n₃为0，1，2，3整数，n₃≠0，0≤n₁+n₂≤4；X₁为NH、O、S、CH₂；X₂为N、CH；当n₁＝n₂＝1，n₃＝2，X₁为CH₂，X₂为N原子时，R缩写为ABO；

m₁、m₂、m₃和m₄为0，1，2整数，0≤m₁+m₂≤4，0≤m₃+m₄≤4；y₁、y₂和y₃为CH₂、O、S和NH，当它们为NH或CH₂时，可作为N端结构R，形式为N或CH；当m₁＝m₂＝1，m₃＝m₄＝2，y₁、y₂为O原子，y₃为N原子时，R缩写为DAD；当m₁＝m₂＝1，m₃＝m₄＝2，y₃为CH₂，y₁为O原子，y₂为N原子时，R缩写为CSO；

z为O、S、NH、CH₂；k为N、Ck₁(k₁为H、CH₃、CH₂CH₃)；j为H、CH₃、CH₂CH₃、CH₁(CH₃)₂；当z＝NH，k＝N，j＝H，R为哌嗪基；当z＝O，k＝N，j＝H，R为吗啉基；

AA₁为L或D型Ser、Thr、Phe、Cys、Gln、Asn、Ala、Ile、Leu、MeVal、Val或其它脂肪族非天然氨基酸，如β-Ala、γ-氨基丁酸、或氨基异丁酸；

AA₂为如下结构：(包括D构型和L构型)

式中n为0、1、2整数；A为O、S、CH₂；R₁为H、COOH、OH；R₂为H、COOH、OH；R₃为H、COOH、OH；R₁，R₂，R₃中有且只有一个为COOH。其中，当n＝0，A＝CH₂，R₁＝COOH，R₂＝R₃＝H时，AA₂为脯氨酸；当n＝0，A＝CH₂，R₁＝COOH，R₂＝OH，R₃＝H时AA₂为羟脯氨酸；

AA₃为D型的非天然芳香性氨基酸、色氨酸、苯基甘氨酸或非氨基酸，其中芳香环中的苯基可在2、3、4或5位上被选自卤素，硝基，脲基，甲氧基，羧基或C₁-C₄烷基单取代或二取代。

本发明还涉及制备式(I)肽类衍生物或其立体异构体的方法，其包括：

1)将化合物RCO-A-OH与B-OP在DMF-DCM，NMM，DCC-HOBt中反应，生成RCO-A-B-OP，其中R，A和B，如前面所定义，P为C_1-4烷基。

2)将1)中所得产物在1M碱/醇溶液中皂化，然后用酸酸化，生成RCO-A-B-OH。

3)将2)中产物RCO-A-B-OH与C-OP在DMF-DCM，NMM，DCC-HOBt中反应，生成RCO-A-B-C-OP，其中P为C_1-4烷基。所得产物如2)中所述进行皂化反应，生成式(I)RCO-A-B-C-OH。

4)将2)中产物RCO-A-B-OH在THF、NMM中与氯甲酸异丁酯反应5-10分钟，再加入C-ONa，生成RCO-A-B-C-ONa，然后用酸酸化，生成式(I)RCO-A-B-C-OH。

本发明涉及一种药物组合物，其包括式(I)肽类衍生物或其立体异构体及药用载体或赋形剂。

本发明还涉及式(I)肽类衍生物或其立体异构体在预防或治疗与内皮素及前列腺有关疾病或症状的药物中用途。

本发明所用术语“式(I)肽类衍生物立体异构体”是指其相应的D-或L-立体构型。

根据该发明，式(I)肽类衍生物或其立体异构体包含下面2位为D型脯氨酸的化合物：

序列1：

R-CO-AA₁-D-Pro-D-Phe(4-Cl)-OH

R＝ABO，DAD，HIM，MOP；

AA₁＝Ser，Thr，Phe，Cys，Gln，Asn，Ala，Ile，Leu，MeVal，Val。

序列2：

R-CO-AA₁-D-Pro-D-Phe(4-F)-OH

R＝ABO，DAD，HIM，MOP；

AA₁＝Ser，Thr，Phe，Cys，Gln，Asn，Ala，Ile，Leu，MeVal，Val。

序列3：

R-CO-AA₁-D-Pro-D-Trp-OH

R＝ABO，DAD，HIM，MOP；

AA₁＝Ser，Thr，Phe，Cys，Gln，Asn，Ala，Ile，Leu，MeVal，Val。

根据本发明，式(I)肽类衍生物或其立体异构体可按本领域已知方法、文献方法或下面所示的反应路线1制备：

反应路线1

在反应路线1中式R-CO-AA₁-OH化合物(其中R，AA₁如上定义)与AA₂-OP(其中AA₂如上定义，P为C_1-4烷基，其可选自甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，叔丁基，优选甲基和乙基)在DMF-DCM，NMM，DCC-HOBt中反应，生成R-CO-AA₁-AA₂-OP化合物(其中R，AA₁，AA₂，P如上定义)。将R-CO-AA₁-AA₂-OP化合物在1M NaOH/甲醇溶液中皂化，然后用盐酸酸化，生成R-CO-AA₁-AA₂-OH化合物(其中R，AA₁，AA₂如上定义)。将式R-CO-AA₁-AA₂-OH与AA₃-OP(其中AA₃，P如上定义)在DMF-DCM，NMM，DCC-HOBt中反应，生成式R-CO-AA₁-AA₂-AA₃-OP(其中R，AA₁，AA₂，AA₃，P如上定义)化合物。然后将所得R-CO-AA₁-AA₂-AA₃-OP在1M NaOH/甲醇溶液中皂化，然后用盐酸酸化，生成式(I)R-CO-AA₁-AA₂-AA₃-OH。或者将化合物R-CO-AA₁-AA₂-OH在THF、NMM中与氯甲酸异丁酯反应，再与AA₃-ONa生成R-CO-AA₁-AA₂-AA₃-ONa，然后用盐酸酸化，生成式(I)R-CO-AA₁-AA₂-AA₃-OH三肽衍生物或其立体异构体。

根据该发明，式(I)肽类衍生物立体异构体是指其相应的D-或L-立体构型。

根据该发明，式(I)肽类衍生物及其立体异构体在动物抗ET1受体模型中显示出优良效果，因此可作为心脑血管药用于动物，优选用于哺乳动物，特别是人。

本发明因此还涉及含有作为活性成分的有效剂量的至少一种式(I)肽类衍生物和/或其立体异构体以及常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。药物组合物可根据本领域已知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将式(I)肽类衍生物和/或其立体异构体与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人用的适当的施用形式或剂量形式。

本发明式(I)肽类衍生物及其立体异构体或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。给药剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子，如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、乳糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、硫酸钙、氯化钠、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将给药单元制成胶囊，将有效成分式(I)肽类衍生物或其立体异构体与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分式(I)肽类衍生物或其立体异构体制成微囊剂，混悬于水性介质中制成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。为了将给药单元制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，如水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧基化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

本发明式(I)肽类衍生物或其立体异构体的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，所用的具体化合物，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、在、四个剂量形式给药。

在本发明中使用的缩写具有下面的含义：

Ala-丙氨酸，

Asn-天冬酰胺，

DAD-1，4-二氧-8-氮杂螺[4，5]癸烷，

DCC-二环己基碳二亚胺，

DCM-二氯甲烷，

DMF-二甲基甲酰胺，

GABA-γ-氨基丁酸，

Gly-甘氨酸，

Gln-谷氨酰胺，

HIM-六亚甲基亚胺，

HMPA-六甲基膦酰胺，

HOBt-1-羟基苯并三唑，

Ile-异亮氨酸，

Leu-亮氨酸，

MeVal-甲基缬氨酸，

Mob-β-胡椒基丙氨酸，

MOP-吗啡啉，

NMM-N-甲基吗啡啉，

Phe-苯丙氨酸，

Phg-苯基甘氨酸，

Pro-脯氨酸，

Pya-β-吡啶基丙氨酸，

Ser-丝氨酸，

TEA-三乙胺，

THF-四氢呋喃，

Thr-苏氨酸，

Trp-色氨酸，

Trt-三苯甲基，

Val-缬氨酸，

本发明中，所有氨基酸构型除注明为D-型外，均为L-型。

具体实施方式

实施例

下面的实例及生物活性实验用来进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的任何限制。

实施例化合物熔点由RY-1型熔点仪测定，温度未经校正；¹H NMR图谱由Bruker ARX 400型或US Varian Unity Inova 600型核磁仪测定；FAB质谱由Zabspect高分辨磁质谱仪测定；元素分析由CarloErba 1106型元素分析仪测定；紫外光谱由UV-260紫外可见分光光度计测定；红外光谱由Magna IR^TM550红外仪测定。实施例制备所用反应试剂均为商品化产品。

实施例1：HIM-CO-Leu-D-Pro-D-Phe(4-Cl)-OH的制备

将D-脯氨酸甲酯盐酸盐83毫克(0.5mmol)，溶于2毫升DMF中，加入N-甲基吗啡啉55微升(0.5mmol)，使其溶解，加入HIM-CO-Leu-OH128毫克(0.5mmol)，用2毫升DCM溶解。冰浴条件下加入HOBt71毫克(0.525mmol)和DCC108毫克(0.525mmol)。继续保持冰浴0.1-5小时后，室温反应1-10小时。浓缩，加入乙酸乙酯，水洗一次后，分别用1％-30％柠檬酸、饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠各洗三次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥3-6小时。滤除干燥剂，浓缩滤液，得无色油状物。将该油状物用2毫升甲醇溶解，于冰水浴中加入1.25毫升1M氢氧化钠，室温下搅拌，TLC检测，待反应完全后，用1％-30％柠檬酸酸化至pH2-4左右，析出固体，乙酸乙酯提取，饱和氯化钠溶液洗涤后，用无水硫酸钠干燥3-6小时。滤除干燥剂，浓缩滤液，得无色油状物。冰浴下加入石油醚，析出固体，滤集干燥得176毫克固体(100％)。将该固体溶于2毫升DCM中，加入125毫克D-4-氯苯丙氨酸甲酯盐酸盐，用2毫升DMF溶解，再加入N-甲基吗啡啉55微升(0.5mmol)。冰浴条件下加入HOBt71毫克(0.525mmol)和DCC108毫克(0.525mmol)。继续保持冰浴0.1-5小时后，室温反应1-10小时。浓缩，加入乙酸乙酯，水洗一次后，分别用1％-30％柠檬酸、饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠各洗三次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥3-6小时。滤除干燥剂，浓缩滤液，得无色油状物。将该油状物用2毫升甲醇溶解，于冰水浴中加入1.25毫升1M氢氧化钠，室温下搅拌，TLC检测，待反应完全后，用1％-30％柠檬酸酸化至pH2-4左右，析出固体，乙酸乙酯提取，饱和氯化钠溶液洗涤后，用无水硫酸钠干燥3-6小时。滤除干燥剂，浓缩滤液，得无色油状物。冰浴下加入石油醚，析出固体，滤集干燥得251毫克固体(93.7％)。MS：[M+H]＝535.5。TLC检测：氯仿∶甲醇∶冰醋酸(10∶1∶0.5)，Rf＝0.69。

按照实施例1的方法合成的化合物举例：

    编号  一级结构 分子量 MS[M+H]    LKGF003    LKGF004    LKGF005    LKGF006    LKGF007    LKGF009    LKGF010    LKGF011    LKGF012    LKGF013    LKGF014    LKGF015    LKGF016    LKGF017    LKGF018    LKGF019    LKGF020  DAD-CO-Leu-D-Pro-D-Phe(4-Cl)-OH  DAD-CO-Leu-D-Pro-D-Trp-OH  HIM-CO-Leu-D-Pro-D-Phe(4-Cl)-OH  HIM-CO-Leu-D-Pro-D-Trp-OH  HIM-CO-Leu-D-Pro-D-Phe(4-F)-OH  MOP-CO-Leu-D-Pro-D-Phe(4-Cl)-OH  MOP-CO-Leu-D-Pro-D-Trp-OH  ABO-CO-Leu-D-Pro-D-Phe(4-Cl)-OH  ABO-CO-Leu-D-Pro-D-Trp-OH  HIM-CO-Phe-D-Pro-D-Phe(4-Cl)-OH  HIM-CO-Phe-D-Pro-D-Trp-OH  DAD-CO-Leu-D-Pro-D-Phe(4-F)-OH  MOP-CO-Leu-D-Pro-D-Phe(4-F)-OH  HIM-CO-Ser-D-Pro-D-Phe(4-Cl)-OH  HIM-CO-Ser-D-Pro-D-Trp-OH  HIM-CO-Thr-D-Pro-D-Phe(4-Cl)-OH  HIM-CO-Thr-D-Pro-D-Trp-OH 579.1 583.7 535.1 539.7 518.6 523.0 527.6 547.1 557.1 569.1 573.7 562.6 506.6 509.O 513.6 523.0 527.6 580.2 584.6 535.5 540.6 519.6 524.3 528.8 547.9 558.0 569.9 574.2 563.7 507.8 509.6 514.8 524.1 528.1

其余化合物也均按照实施例1的方法和途径合成。

生物活性

实验材料

Wistar大鼠：                  军事医学科学院实验动物中心

台式自动平衡记录仪：          上海大华仪器厂

ET-1：                        American peptide company

10％碳酸钾                    自配

改良Kreb’s-Ringer缓冲液：    自配

抗ET-1致离体大鼠主动脉环收缩实验

实验方法

样品溶液的配制：

定量称取样品2×10^-6摩尔，加入120微升10％碱金属碳酸盐和1-80微升DMSO溶解，用改良Kreb’s-Ringer缓冲液定量稀释为5.0毫升，作为贮备液冰箱中保存。用缓冲液稀释为10^-6、10^-7、10^-8和10^-9摩尔四个浓度。

体外血管实验：

将大鼠断头处死，迅速开胸，摘取主动脉，置于盛有血管营养液的培养皿中，清除血污，仔细分离血管周围组织，剪成长约3毫米的动脉环，分别将两根直径为0.1毫米的不锈钢钢丝小心穿入，做成三角环状。随后置于盛有10毫升血管营养液的37℃恒温浴槽中，下端固定，上端通迁张力换能器连于台式自动平衡记录仪，持续通入95％氧气和5％二氧化碳混合气。动脉环负荷0.5克，稳定后开始给药。

拮抗实验

先用10nM量的ET-1诱发血管环收缩，约10分钟左右，达到平台后，给予10^-9M样品，观察拮抗收缩效应。当低浓度没效时，逐渐升高浓度至10^-6M。

结果：

按照上述方法，测试了已合成化合物，大部分表现出较强的拮抗活性。举例如下：LKGF004(DAD-CO-Leu-D-Pro-D-Trp-OH)的IC50为2.22nM，LKGF005(DAD-CO-Leu-D-Pro-D-Phe(4-Cl)-OH)的IC50为6.80nM。

抗ET-1诱发整体大鼠血压升高实验

实验方法

Wistar大鼠，雄性，戊巴比妥钠50～60mg/kg腹腔麻醉，切开颈部皮肤，分离皮下组织，做气管插管术，右侧颈动脉插管，并与压力换能器相连，稳定10～15min后静注ET-1，记录ET-1给药前及给药后5、10、20、30min血压变化。计算预防给药后ET-1诱发高血压大鼠的颈动脉血压升高幅度。

用以上方法测试了已合成化合物，大部分有明显的降压活性，举例如下：

  药物  动  物  (n)       给药后时间(min)平均动脉压升高幅度(mmHg)(X±S)       5       10       20       30  NS  LKGF003  LKGF004  LKGF005  LKGF006  LKGF007  LKGF009  LKGF010  3  3  3  3  4  3  3  3    34.1±13.9    16.7±2.2    5.1±4.5    8.7±4.8    4.5±9.6    8.1±3.2    8.6±7.4    16.9±6.5    40.5±18.9    23.0±0.7    6.3±7.3    15.9±9.2    12.9±3.7    14.1±3.7    16.9±3.7    25.8±8.8     43.1±24.2     26.2±4.0     12.2±9.8     24.2±9.1     16.0±6.5     16.3±4.0     16.5±6.8     25.8±4.9     38.3±21.7     17.1±7.5     4.5±5.1     23.6±12.3     13.1±8.3     8.7±5.8     12.3±8.3     24.2±0.9