从胰渣中提取及纯化胰蛋白酶的方法

摘要

本发明从胰渣中提取及纯化胰蛋白酶的方法涉及酶学、及其分离或纯化方法技术领域。公开了一种从胰渣中提取和纯化胰蛋白酶的方法，以解决现有技术中存在的胰酶激活程序复杂、纯化过程中有机溶剂污染环境的技术缺陷。本发明提取和纯化胰蛋白酶的方法包括用无机酸从胰渣中抽提胰蛋白酶；抽提液调整pH至6.0－8.0，用Ca2+激活；调节上清的pH至3.0－4.0，经阳离子交换层析收集含有胰蛋白酶活性的洗脱液；用亲和层析进一步纯化即得纯化的胰蛋白酶。本发明的收率达1.2g胰蛋白酶/Kg胰渣，比活性大于10000U/mg蛋白质。激活胰酶的操作简单，整个纯化过程中未使用任何有机溶剂因而减少了环境污染。

说明书

技术领域

本发明涉及酶学、及其分离或纯化方法技术领域，尤其涉及一种从胰渣中提取及纯化胰蛋白酶的方法。

背景技术

胰蛋白酶是一种常用的蛋白质水解酶，催化赖氨酸或精氨酸残基羧基端组成的肽键水解，而无论该肽链的长短或其氨基酸序列。但是胰蛋白酶本身很容易自发降解，由原先的β-胰蛋白酶转化为α-胰蛋白酶，再进一步降解为拟胰蛋白酶乃至碎片，活力因而也逐步下降直至完全丧失。

从胰脏中提取和纯化胰蛋白酶具有重大的产业价值，因为胰蛋白酶作为蛋白质水解酶已经广泛应用于医学领域、去除啤酒雾和肉类嫩化。现在胰蛋白酶在蛋白质化学领域尤其蛋白质分析领域获得了广泛的应用，在基因工程领域如重组人胰岛素的生产过程中也有广泛的用途。

动物胰脏如猪胰脏、牛胰脏等含有大量具有生物学活性的化合物，如胰岛素、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等。由于胰脏是相当昂贵的而且屠宰量也限制了胰脏的供应，因此应当回收胰脏中大部分的上述活性化合物，从而尽最大可能充分利用动物胰脏。

用传统的纯化方法如盐析或溶剂沉淀的方法纯化胰蛋白酶是非常困难的。傅渝滨等公开了一种从猪胰脏中提取胰酶的工艺，将冰冻胰脏或者新鲜胰脏与十二指肠一起绞碎，然后与乙醇水溶液混合后，先加入CaCl₂，再加入NaOH在低温下搅拌激活胰酶，过滤激活的胰浆、滤液经乙醇沉淀、压榨、脱脂、干燥获得胰酶原粉，系胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶的混合物〖傅渝滨、母昭德、景淑华、李勤耕、邓春平、尚景川，从猪胰脏中提取胰酶的优化工艺探索，重庆医科大学学报，1995，20(4)：305-307〗。刘军及赵小兰也分别公开了一种胰酶制备工艺，前者采用十二指肠和Ca²⁺激活而后者采用苦胆和胰酶原粉激活，均采用乙醇、丙酮等有机溶剂脱脂〖刘军，胰酶工艺研究，中国生化药物杂志，1993，(2)：40-41；赵小兰，胰酶制备工艺研究，青海医药杂志，2000，30(4)：56-57〗，产品均为胰酶混合物，胰酶激活程序复杂。

几个基于蛋白质抑制剂的亲和层析纯化胰蛋白酶的方法已经被开发〖G.Feinstein，Biochim.Biophys.Acta，214，244，1970；G.Feinstein，Fed.Eur.Biochem.Soc.Lett.，7，353，1970；N.Robinson，R.Tye，H.Neurath and K.Walsh，Biochemistry，10，2743，1971〗。该系统由共价结合了配体分子(胰蛋白酶抑制剂)的固定化不溶性介质如纤维素衍生物、聚丙烯酰铵、聚苯乙烯、颗粒琼脂糖等组成。该系统直接用于含有胰蛋白酶的抽提物时，由于采用的是填充柱的形式可能会存在堵塞和结垢的问题。

目前，超滤技术已经广泛用于分离溶质分子。该技术除了易于放大外，还具有生产能力高、可以间歇操作或连续操作。然而超滤的缺点是其分辨率低，实践中分子量相差十倍时可以获得最佳分辨率。美国专利4973554公开了一种亲和——超滤纯化胰蛋白酶的方法，该方法包括将含有胰蛋白酶的水溶液和对胰蛋白酶具有亲和力的水溶性亲和聚合物混合保温形成溶解的聚合物-胰蛋白酶复合物，而该聚合物是由N-丙稀酰-氨基苯甲醚和丙稀酰胺共聚而成，平均分子量至少约100000Da；超滤上述混合物去除未结合的胰蛋白酶，截留酶-亲和聚合物复合物；用选择性解离胰蛋白酶的洗脱液洗脱从酶-亲和聚合物上去除胰蛋白酶，回收解离的聚合物；超滤上述洗脱液，分离胰蛋白酶和洗脱剂。该方法存在的缺点是采用苯甲醚洗脱对环境有污染，在连续操作时需要四个超滤系统而且超滤膜易于结垢，而且超滤系统价格昂贵。

发明内容

发明人广泛而深入地研究了胰蛋白酶的提取和纯化方法，选用提取过胰岛素的胰渣作为原料提取和纯化胰蛋白酶，并优化了抽提和激活胰蛋白酶的条件，对胰蛋白酶的纯化方法进行了广泛研究，最终提供了一种提取和纯化胰蛋白酶的方法。

本发明的思路是通过胰渣抽提胰蛋白酶、然后激活，再经过离子交换和亲和层析进一步纯化胰蛋白酶，并对工艺条件进行优化。

因而，本发明所要解决的技术问题是提供一种从胰渣中提取和纯化胰蛋白酶的方法，以解决现有技术中存在的胰酶激活程序复杂、胰蛋白酶亲和层析柱易于结垢及纯化过程中的有机溶剂对环境的污染的技术缺陷，最终本发明的方法达到提高胰蛋白酶的收率和活性、及降低成本减少污染的目的。

本发明所采用的技术方案是：提取和纯化胰蛋白酶的方法包括如下步骤：

(a)用无机酸从胰渣中抽提胰蛋白酶；

(b)含有胰蛋白酶的抽提液调整pH至6.0-8.0，Ca²⁺激活；

(c)调节上述(b)中的激活上清的pH至3.0-4.0，经阳离子交换层析收集含有胰蛋白酶活性的洗脱液；

(d)上述(c)收集的含有胰蛋白酶的洗脱液与对胰蛋白酶有特异性亲和力的介质接触，洗去未结合的蛋白质，用解离胰蛋白酶的洗脱液洗脱结合的胰蛋白酶，收集洗脱液即得纯化的胰蛋白酶。

其中步骤(a)中抽提胰蛋白酶的无机酸选自盐酸、硫酸和磷酸，优选地采用盐酸。胰渣用2-6倍量(v/w，mL/g)水混匀，用盐酸将悬浊液pH调节至1.5-2.5，搅拌2-3hr，抽提胰蛋白酶。更优选地，胰渣先用4倍量(v/w，mL/g)水混匀，用6mol/L的盐酸调节pH至1.5-2.5，搅拌2-3hr，抽提胰蛋白酶。另外，在本发明的一个实施例中直接用2-6倍量(v/w，mL/g)pH1.5-2.5的盐酸混匀胰渣，搅拌2-3hr，抽提胰蛋白酶。

优选地提取和纯化胰蛋白酶的方法中步骤(b)激活胰蛋白酶的方法是：含有胰蛋白酶的抽提液用碱溶液如NaOH、KOH溶液调节pH至6.0-8.0，加入CaCl₂使Ca²⁺浓度达到10-20mmol/L，搅拌2～3hr，离心或者过滤收集清液。优选地用10mol/L的NaOH调节pH。

提取和纯化胰蛋白酶的方法中步骤(c)中的阳离子交换介质采用本领域技术人员公知的离子交换介质，如CM-Sepharose^TM CL-6B、CM-Sepharose^TMFast Flow、SP-Sepharose^TM Fast Flow(GE Healthcare，PharmaciaBiosciences)等，优选地采用SP-Sepharose^TM Fast Flow。平衡缓冲液为100-200mmol/L柠檬酸缓冲液(pH3.0-4.0)，洗脱缓冲液为100-200mmol/L柠檬酸缓冲液(pH3.0-4.0)、NaCl线性梯度0-1M/(5-10倍柱体积)，操作流速为8-15cm/hr。优选地缓冲液为200mmol/L柠檬酸缓冲液(pH3.0-4.0)、操作流速9.5-12.5cm/hr。层析柱的装填按照厂家提供的说明书进行操作，或者选择厂商提供的预装柱如HiLoad^TM SP Sepharose等，层析操作按照说明书进行。

提取和纯化胰蛋白酶的方法中步骤(d)中采用Benzamindine Sepharose4FF H-sub(Pharmacia)，按照厂商提供的说明书进行操作，平衡缓冲液：50mmol/LTris-HCl，0.5mol/LNaCl，pH7.4；洗脱缓冲液：10mmolHCl，0.5mol/LNaCl；操作流速40-100cm/hr，优选地55-90.5cm/hr。

优选地，提取和纯化胰蛋白酶的方法另外包括浓缩步骤，浓缩采用本领域常用的方法，如可以将含有胰蛋白酶的亲和层析洗脱液对含有3-5％(重量体积g/100mL)甘露醇的缓冲液透析浓缩，或者选用截留分子量为5000-10000Da的超滤膜超滤浓缩，在浓缩液中加入3-5％(重量体积g/100mL)的甘露醇。浓缩液冷冻干燥获得胰蛋白酶干粉。

胰蛋白酶活力的测定采用紫外吸收法，参照《中华人民共和国药典》(2000年版)的方法。具体为底物为N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐，配成吸收度为0.575～0.585的底物溶液，底物溶液制成后应在2小时内使用。反应体系为0.067mol/L磷酸盐缓冲液，pH为7.6；反应温度为25℃±0.5℃，首先在3.0ml底物溶液中，加0.001mol/L盐酸溶液200μl作为空白，然后在3.0ml底物溶液中加入酶液200μl后，立即摇匀并记时。在253nm测其吸收度增值，每隔30s读数一次，5min内吸收度的增值应呈线性，否则酶液应稀释后再测。

胰蛋白酶浓度的测定采用双缩脲法〖张龙翔，张庭芳等：双缩脲法，生化实验方法和技术，136-138〗。

本发明的从胰渣中提取和纯化胰蛋白酶的方法具有显著的技术进步。本发明从提取过胰岛素的胰渣中提取和纯化胰蛋白酶，收率达1.2g胰蛋白酶/Kg胰渣，比活性大于10000U/mg胰蛋白酶，收率提高40％以上，胰蛋白酶的比活远大于药典2500U/mg蛋白质的标准。由于从胰渣出发达到了废物利用的目的，可以充分利用昂贵的胰脏资源。仅用Ca²⁺在pH6.0-8.0条件下激活胰酶，因而操作简单，易于操作。整个纯化过程中未使用任何有机溶剂因而减少了环境污染。从阳离子交换层析洗脱胰蛋白酶后再经亲和层析也大大降低了亲和填充柱被堵塞和结垢的风险，无需任何特殊设备，便于常规操作及产业化生产。

本发明的提取和纯化胰蛋白酶的方法用选自猪胰脏、牛胰脏等动物胰脏提取胰岛素后的胰渣提取和纯化胰蛋白酶。

本发明的方法虽然从胰渣出发提取和纯化胰蛋白酶，但显然也可以用于从胰脏组织出发提取和纯化胰蛋白酶。

附图说明

附图1是提取和纯化胰蛋白酶的工艺路线。

附图2是阳离子交换层析图谱，纵坐标为A_280nm吸光度值，横坐标为保留时间，峰1是穿透峰、峰2是杂质峰、峰3是含有胰蛋白酶的洗脱峰。

附图3是亲和层析图谱，纵坐标为A_280nm吸光度值，横坐标为保留时间，峰1是穿透峰、峰2是含有胰蛋白酶的洗脱峰。

以下结合具体的实施方式详细说明本发明，但所有这些实施方式只能理解为说明性的，仅为进一步阐明本发明的技术内容，不以任何方式限制本发明的范围。

具体实施方式

实施例一 胰蛋白酶的抽提和激活

将提取过胰岛素的胰渣250g用1000mL水混匀，用6mol/L HCl溶液调pH至1.5，搅拌2.5小时；过滤，收集清液。将抽提上清液，用10mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.0，加入氯化钙，使Ca²⁺终浓度为10mmol/L，搅拌2.5小时；过滤，收集清液，操作温度4-25℃。

实施例二 胰蛋白酶的抽提和激活

直接用1000mLpH2.0的盐酸和250g胰渣混匀，搅拌2.5hr，抽提胰蛋白酶，过滤，收集清液。将抽提上清液，用10mol/L氢氧化钠溶液调pH至7.0，加入氯化钙，使Ca²⁺终浓度为10mmol/L，搅拌2.5小时；过滤，收集清液。操作温度4-25℃。

实施例三 胰蛋白酶的抽提和激活

将提取过胰岛素的胰渣250g用1000mL水混匀，用6mol/L HCl溶液调pH至2.5，搅拌2小时；过滤，收集清液。将抽提上清液，用10mol/L氢氧化钠溶液调pH至7.0，加入氯化钙，使Ca²⁺终浓度为20mmol/L，搅拌3小时；过滤，收集清液。操作温度4-25℃。

实施例四 胰蛋白酶的抽提和激活

将提取过胰岛素的胰渣250g用1000mL水混匀，用6mol/L HCl溶液调pH至2.5，搅拌2小时；过滤，收集清液。将抽提上清液，用10mol/L氢氧化钠溶液调pH至8.0，加入氯化钙，使Ca²⁺终浓度为20mmol/L，搅拌3小时；过滤，收集清液。操作温度4-25℃。

实施例五 胰蛋白酶的纯化

实施例一的激活清夜用6mol/LHCl溶液调节pH至3.5，上柱，用平衡缓冲液平衡，检测A_280nm，穿透峰弃去，待A_280nm下至基线后，开始NaCl梯度洗脱，收集含有胰蛋白酶的洗脱峰。层析条件为：

层析柱：11×20cm

离子交换介质：SP Sepharose Fast Flow

流速：9.5cm/hr

平衡缓冲液：200mmol/L柠檬酸缓冲液，pH3.0

洗脱缓冲液：200mmol/L柠檬酸缓冲液，pH3.0，线性梯度0～1MNaCl/10倍柱体积

洗脱曲线如附图2，收集峰3洗脱液。

亲和层析方法为：上述峰3洗脱液上预先用平衡缓冲液平衡的层析柱，上样完毕用平衡缓冲液平衡，穿透峰弃去，待A_280nm下至基线后，洗脱缓冲液洗脱，收集目的洗脱峰，层析条件如下：

层析柱：2.6×15cm

凝胶：Benzamindine Sepharose 4FF H-sub

流速：55cm/hr

平衡液：50mmol/LTris-HCl，0.5mol/LNaCl，pH7.4

洗脱液：10mmolHCl，0.5mol/LNaCl，pH2.0

洗脱曲线如附图3，峰2为胰蛋白酶洗脱峰，收集该洗脱液，用双缩脲法测定胰蛋白酶浓度，获得300mg胰蛋白酶，用紫外吸收法测定胰蛋白酶活性，其比活为10500U/mg胰蛋白酶，胰蛋白酶收率为1200mg/kg胰渣。

实施例六

取实施例二之激活清夜，按实施例五操作，离子交换层析pH4.0，流速12.5cm/hr。亲和层析步骤流速55cm/hr。用双缩脲法测定胰蛋白酶浓度，用紫外吸收法测定胰蛋白酶活性。结果：获得305mg胰蛋白酶，其比活为10050U/mg胰蛋白酶，胰蛋白酶收率为1220mg/kg胰渣。

实施例七

取实施例三之激活上清，按照实施例五操作，离子交换层析pH4.0，流速12.5cm/hr。亲和层析步骤流速100cm/hr。结果：用双缩脲法测定胰蛋白酶浓度，获得310mg胰蛋白酶，胰蛋白酶收率1240mg/kg胰渣；用紫外吸收法测定胰蛋白酶活性，其比活为10100U/mg胰蛋白酶。

实施例八

取实施例四之激活上清，按照实施例五操作，离子交换层析pH3.5，流速12.5cm/hr。亲和层析步骤流速90.5cm/hr。结果：用双缩脲法测定胰蛋白酶浓度，获得330mg胰蛋白酶，胰蛋白酶收率为1320mg/kg胰渣；用紫外吸收法测定胰蛋白酶活性，其比活为11000U/mg胰蛋白酶。

实施例九

实施例七和八的纯化胰蛋白酶，用截留分子量10000Da的超滤膜超滤，超滤浓缩液中加入3-5％(重量体积比g/100mL)甘露醇，冷冻干燥即得胰蛋白酶干粉。