γ－聚谷氨酸产生菌及利用该菌株制备γ－聚谷氨酸的方法

摘要

本发明提供一种γ－聚谷氨酸产生菌及利用该菌株制备γ－聚谷氨酸的方法，所提供的微生物菌株是经选育的γ－聚谷氨酸(γ－PGA)产生菌——枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)PGA－7 CCTCC M 206102。其生产γ－聚谷氨酸的方法，是用Bacillus substilis CCTCC M 206102做发酵菌株，利用糖质原料进行摇瓶发酵，在发酵原料中不需要添加L－谷氨酸，这比以往通常采用的需要谷氨酸作原料的微生物发酵，其原料成本有较大的降低；本发明在最佳摇瓶发酵工艺条件下，产γ－PGA最高可达18g/l，具有良好的工业化应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产γ-聚谷氨酸的微生物菌株及利用该菌株发酵生产γ-聚谷氨酸的方法。

背景技术

1937年Ivanovics等人首先发现炭疽芽孢杆菌的夹膜含有γ-聚谷氨酸(γ-PGA)，1942年Bovarnick等人发现有些芽孢杆菌属细菌能通过发酵培养积累γ-PGA。1973年Troy发现γ-聚谷氨酸(以下简称γ-PGA)是Bacillus anthracis细胞夹膜的一种化学组分，它是一种水溶性的酰胺化合物，可以通过芽孢杆菌的变种来生产。它的结构与众不同，它是由单个谷氨酸分子在γ-羟基和α-氨基形成的酰胺键而连接成的多聚体，其结构式如下：

γ-PGA是从左旋-谷氨酸(有的菌种可不必加L-谷氨酸)经发酵而制成，为一种全天然、多功能性、生物可分解性的生物高分子产品。γ-PGA分子量范围从10,000～2,000,000，可以制成不同的分子量应用于各种不同领域。比如：1、γ-PGA具食品安全性，可作为膳食纤维、保健食品、食品增稠剂、安定剂或作为化妆品用的保湿剂；2、γ-PGA可作成水凝胶，具有极高吸水能力，可吸水达3,500倍，极适合于农业土壤和环保产品之应用；3、γ-PGA可以转化成各种不同的金属盐类，具不同pH值，并有特殊多阴离子表面特性，适用于组织培养和许多其它食品、化妆品、生物医学和工业应用等。

γ-PGA生物合成的研究主要集中在芽孢杆菌属细菌的B.anthracis和B.licheniformisATCC 9945a、B.licheniformis ATCC 9945(以前叫B.subtilis ATCC9945)等菌株上，这类菌种培养和发酵时需要L-谷氨酸作营养原料才能积累γ-PGA，在添加大量的谷氨酸时，γ-PGA的生成量一般在20g·L^-1左右。但L-谷氨酸做原料存在材料价格昂贵等不利因素。

发明内容

本发明的目的是提出一种不需要谷氨酸作原料的γ-聚谷氨酸产生菌及利用该菌株制备γ-聚谷氨酸的方法。

本发明所提供的微生物菌株是经选育的γ-聚谷氨酸(γ-PGA)产生菌--枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)PGA-7，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，编号为：CCTCCM 206102。该菌株以下简称：Bacillus substilis PGA-7CCTCC M 206102。

Bacillus substilis PGA-7CCTCC M 206102菌株在固体培养基上的生长形态有多样性，在LB培养基(蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，琼脂20g，自来水1L，调pH值至7.0～7.2.)平板上，当培养基潮湿时，菌落湿润、圆形、不透明，菌苔边缘整齐，表面光滑；干燥时，菌落粗糙皱褶，中央凹陷，边缘不规则；当培养基中添加少量谷氨酸时，菌落扩展明显，经3天培养，菌落直径达15-25mm，表面呈“木耳状”。其生理生化特征见下表。

  试验项目  试验结果  试验项目  试验结果  革兰氏染色  形状  孢子位置  厌氧生长  葡萄糖产酸  葡萄糖产气  H2O2酶  明胶水解  淀粉水解  柠檬酸盐试验  硝酸盐(还原)  V.P.试验  +  短杆状  细胞中央  +  +  -  +  +  +  -  +  -  2％NaCl  5％NaCl  7％NaCl  10％NaCl  石蕊牛奶还原  葡萄糖发酵  木糖发酵  乳糖发酵  甘露醇发酵  阿拉伯糖发酵  麦芽糖发酵  棉子糖发酵  ++  +  -  -  +、胨化  +  -  -  +  -  +  -

注：+阳性，-阴性

Bacillus substilis PGA-7CCTCC M 206102菌株的遗传学特征：采用16S rRNA测序进行分类学分子鉴定。菌种基因组DNA提取采用丙酮破坏细菌细胞壁膜脂质结构，裂解液破除细菌细胞膜，释放胞内核酸，经酚/氯仿/异戊醇去除蛋白质及多糖，无水乙醇沉淀DNA，TE缓冲液溶解DNA。采用两种合成的通用引物PCR扩增细菌的16S rDNA，引物如下：27F：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′；1541R：5′-AAG GAA GTG ATG CAG CCG CA-3′。PCR扩增产物纯化后直接进行序列测定，将得到的序列送GenBank做Blast比较(测序序列的GenBank accession number为DQ415893.2)，根据GenBank中提供的基因系列，依据16S rRNA序列构建进化树进行分析，其中同源性最高菌株的是B.subtilis MA139等，同源性为99％且相似性最高，结合形态、生理生化特征以及16S rRNA系列分析的系统进化结果，该菌株鉴定为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌种。

用本发明所提供的Bacillus substilis PGA-7 CCTCC M 206102菌株，在不需要添加L-谷氨酸发酵原料的摇瓶中发酵可以产生γ-聚谷氨酸，从而可以用其作为发酵菌株生产γ-聚谷氨酸。

本发明所提供的用Bacillus substilis PGA-7 CCTCC M 206102菌株生产γ-聚谷氨酸的方法，其特点是用Bacillus substilis PGA-7 CCTCC M 206102做发酵菌株，利用糖质原料进行摇瓶发酵。所说的糖质原料可为葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等，在发酵原料中不需要添加L-谷氨酸。摇瓶发酵60-96小时，可产γ-PGA 10～18g/l。

利用Bacillus substilis PGA-7 CCTCC M 206102菌株摇瓶发酵生产γ-PGA的具体工艺过程如下：

(1)斜面菌种活化：将培养好的保藏斜面种(Bacillus substilis PGA-7 CCTCC M 206102)划线于新配制的LB斜面上，LB斜面组成如下：蛋白胨8～12g，酵母膏3～8g，NaCl 9～11g，琼脂15～22g，自来水1L，调pH值至6.8～7.4.。33-38℃培养12～24小时，再冷藏于4℃1～5天。

(2)菌种的液体活化：将上述斜面上约1cm²面积的菌种刮下，接种于液体活化培养基中，液体活化培养基组成如下：蛋白胨8～12g，酵母膏3～8g，NaCl 9～11g，自来水1L，调pH值至6.8～7.4.。液体活化培养基装于250ml三角瓶中，三角瓶装量为20ml，于32-36℃往复式摇床振荡培养18～36小时，摇床转速为80-110r/m，冲程为65-75mm。

(3)摇瓶发酵：按5％接种量，取1ml培养好的液体活化种，接入发酵培养基中，发酵培养基(培养基组成见下面的解释)用500ml三角瓶装，装量20ml，于32-48℃，冲程65-80mm，转速90-130r/m的往复式摇床振荡培养60-96小时，停止发酵。

(4)发酵完毕的摇瓶发酵醪液经提取工艺即得含γ-聚谷氨酸的制品。

提取含γ-聚谷氨酸的制品的工艺为常规工艺，一般包括对发酵液离心去除菌体，取其上清液用乙醇沉淀提取等步骤。

在步骤(3)中，适宜的发酵培养基成份如下(按每升培养基所含克重g/l计算)：60-120g糖质原料、14-20g氮源、1.0-2.0g K₂HPO₄、0.05-0.15g MgSO₄·7H₂O、0.01-0.08g FeCl₃·6H₂O、0.1-0.2g CaCl₂·2H₂O、0.05-0.104g MnSO₄·H₂O，培养基于灭菌前调pH值至6.5-7.0，可用NaOH及HCl调节。其中，所述的糖质原料可以是葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等；氮源可以是氯化铵、硫酸铵、硝酸铵等。

发酵完毕的摇瓶发酵醪液可通过以下方法分析测试发酵醪液中的γ-PGA含量：

对发酵液离心去除菌体，取上清液测谷氨酸单体的含量；将上清液与6mol/L的盐酸按1∶1(体积比)加入玻璃水解管中，真空封口后于110℃水解24h，然后测定水解液中谷氨酸总量；2次测得的谷氨酸之差为γ-PGA的含量。

上述对谷氨酸的分析方法可以采用氨基酸自动分析仪，或高效液相色谱仪(HPLC)，或纸层析方法进行测定。纸层析方法如下：取10μl离心发酵上清液或它的水解液点样，层析过夜，用0.5％茚三酮丙酮溶液显色，65℃显色10min，剪下斑点用lg/L硫酸铜洗脱液(CuSO₄·5H₂O∶75％乙醇＝2∶38)5mL浸泡20min以上至纸条无色，Λmax＝570nm测其OD值，与谷氨酸标准曲线比较算出相应含量，再计算发酵醪液含γ-PGA量。

本发明中最大的特点在于用一株不需要谷氨酸作原料的枯草芽孢杆菌菌株发酵生产γ-PGA，比以往通常采用的需要谷氨酸作原料的微生物发酵其原料成本有较大的降低；本发明在最佳摇瓶发酵工艺条件下，产γ-PGA最高可达18g/l。

利用谷氨酸作为发酵底物的研究，国内外相关研究比较丰富，其产率相对比非谷氨酸依赖型发酵较高，但从生产原料角度考虑，不需谷氨酸作为发酵底物的菌株具有成本上优势，更具有工业化应用前景，因此本发明可望为工业发酵生产γ-PGA提供另一种可行方法。

具体实施方式

下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。

下面的实施例中用到的斜面种采用如下方法培养：Bacillus substilis PGA-7 CCTCC M206102划线于新配制的LB斜面上，LB斜面组成如下：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，琼脂20g，自来水1L，调pH值至7.2.。337℃培养17小时，再冷藏于4℃冰箱备用。

实施例一：

取4℃冰箱内保藏1天的斜面种[保藏斜面培养基的组成(g/L)：蛋白胨10，NaCl 10，酵母膏5，琼脂20，pH7.0。]，用接种针将上述斜面上约1cm²面积的菌种刮下，转接到新配置的发酵培养基上，发酵培养基的组成(g/L)如下：80g果糖、18gNH₄Cl、1.5g K₂HPO₄、0.05gMgSO₄·7H₂O、0.01g FeCl₃·6H₂O、0.15g CaCl₂·2H₂O、0.05g MnSO₄·H₂O，并以NaOH及HCl调节培养基的pH值(灭菌前)为6.5，120℃灭菌20分钟。发酵培养基装于500ml三角瓶中，装量20ml，于76mm冲程、转速130r/m往复式摇床振荡培养，经37℃恒温培养96小时后，摇瓶发酵完毕后，发酵液采用20,000转/分钟离心10分钟，用纸层析法测定γ-PGA含量。采用该方法摇瓶发酵产γ-PGA可达到18g/L。

实施例二：

取4℃冰箱内保藏2天的斜面种[保藏斜面培养基的组成(g/L)：蛋白胨8，NaCl 11，酵母膏6，琼脂20，pH7.0。]，用接种针将上述斜面上约1cm²面积的菌种刮下，转接到新配置的发酵培养基上，发酵培养基的组成(g/L)如下：90g蔗糖、20g(NH₄)₂SO₄、1.0g K₂HPO₄、0.06g MgSO₄·7H₂O、0.01g FeCl₃·6H₂O、0.15g CaCl₂·2H₂O、0.05g MnSO₄·H₂O，并以NaOH及HCl调节培养基的pH值(灭菌前)为6.5，120℃灭菌20分钟。发酵培养基装于500ml三角瓶中，装量20ml，于76mm冲程、转速120r/m往复式摇床振荡培养，经37℃恒温培养90小时后，摇瓶发酵完毕后，发酵液采用20,000转/分钟离心10分钟，用纸层析法测定γ-PGA含量。采用该方法摇瓶发酵产γ-PGA可达到16.2g/L。

实施例三：

取4℃冰箱内保藏3天的斜面种[保藏斜面培养基的组成(g/L)：蛋白胨12，NaCl 9，酵母膏4，琼脂20，pH7.0。]，用接种针将上述斜面上约1cm²面积的菌种刮下，转接到新配置的发酵培养基上，发酵培养基的组成(g/L)如下：60g葡萄糖、20g NH₄NO₃、1.0g K₂HPO₄、0.01gMgSO₄·7H₂O、0.05g FeCl₃·6H₂O、0.2g CaCl₂·2H₂O、0.104g MnSO₄·H₂O，并以NaOH及HCl调节培养基的pH值(灭菌前)为7.0，120℃灭菌20分钟。发酵培养基装于500ml三角瓶中，装量20ml，于65mm冲程、转速90r/m往复式摇床振荡培养，经37℃恒温培养60小时后，摇瓶发酵完毕后，发酵液采用20,000转/分钟离心10分钟，用纸层析法测定γ-PGA含量。采用该方法摇瓶发酵产γ-PGA可达到12.6g/L。