用于防止皮肤损伤的含有人参皂苷F1和(－)表儿茶素－3－没食子酸酯的组合物

摘要

本发明涉及含有人参皂苷F1和(－)表儿茶素－3－没食子酸酯(EGCG)的护肤组合物。更具体地，本发明涉及能通过所述人参皂苷F1和EGCG的协同作用，即使在低浓度下也表现出极好护肤效果，抑制紫外线引起的表皮细胞中细胞凋亡的抑制剂，以及涉及抑制表皮细胞中细胞凋亡的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及用于防止皮肤损伤的含有人参皂苷F1(20-O-β-D-吡喃葡糖基-20(S)-原人参萜三醇)和(-)表儿茶素-3-没食子酸((-)epigallocatechin-3-gallate，EGCG)的组合物。更具体地，本发明涉及能通过协同作用防止紫外线引起的皮肤损伤的含有低浓度人参皂苷F1和EGCG的组合物，以及涉及防止皮肤损伤的方法。

背景技术

人的皮肤作为第一道保护屏障，保护身体重要器官不受例如温度或湿度变化、紫外线和污染的外部刺激，并且在诸如体温调节的生物内环境稳定的调节中起着重要作用。然而，皮肤暴露于外部环境而容易受到外部刺激的伤害。这些外部刺激中，紫外线是引起皮肤老化和表皮中调亡细胞死亡的主要刺激。

引起皮肤老化最严重的原因是280-320纳米波长的紫外线(UVB)。如果皮肤暴露于紫外线，可能损伤诸如DNA或蛋白质的细胞成分形成晒斑细胞，紫外线激活一种酶——胱天蛋白酶，并且经历细胞凋亡途径(apoptoticpathway)，伴随酶作用的DNA片段化，最后终止于细胞死亡。以此方式，细胞凋亡(apoptosis)诱发受伤细胞的死亡，防止它们发展成肿瘤。

Bcl-2是在这种细胞凋亡途径中起着重要作用的基因，并且编码位于核膜和线粒体外膜的26千道尔顿蛋白。Bcl-2蛋白附着于例如Bax的有利于诱导细胞凋亡的蛋白，并且阻碍该蛋白的功能，抑制细胞凋亡的诱导。因此，经历细胞凋亡的敏感性取决于Bcl-2蛋白和Bax蛋白之间的比例。

有人报道过，Bcl-2的表达受表皮中紫外线辐射的快速减量调节。此外，紫外线引发的细胞凋亡在过度表达Bcl-2蛋白的细胞中被抑制。然而，Bcl-2的过量表达也可以抑制有严重DNA损伤从而可能发展成癌症的细胞中的细胞凋亡。因此，特异性调节Bcl-2的表达是非常重要的。

EGCG，绿茶中的一种主要的多酚，有强抗氧化活性和清除有害基团的活性。还已知这种化合物能抑制紫外线辐射引起的炎症反应和皮肤癌的发生。最近，发现EGCG增强Bcl-2表达并且减小正常人表皮角质形成细胞中Bax表达，抑制紫外线引起的细胞凋亡。对鳞状癌细胞使用EGCG，减少Bax蛋白的磷酸化作用，从而抑制癌细胞增殖。然而，EGCG在涉及细胞凋亡和细胞增殖的信号转导途径中的靶标仍然未知。

成视网膜细胞瘤(Retinoblastoma，Rb)蛋白由肿瘤阻抑基因表达，并且在生殖、癌、细胞生长和分化以及细胞死亡中起着重要作用。Rb是一种核蛋白，并且该蛋白的磷酸化作用受细胞周期或DNA损伤因子调节。因此，Rb涉及与E2F转录因子一起诱导细胞凋亡。此外，已知Rb蛋白的去磷酸化作用受Bcl-2过量表达的抑制，从而Rb是稳定的。也就是说，它还涉及细胞凋亡的抑制。

但是，没有关于能通过保护受到弱伤害的细胞不经历细胞凋亡和通过诱导严重受损细胞的细胞凋亡来调节人表皮细胞中的细胞凋亡，从而能保护皮肤，并且人容易使用而无害的物质的报道。

发明内容

在上述情况下，本发明的发明人发现了具有极好的保护表皮细胞并防止其损伤的作用的含有人参皂苷F1(20-O-β-D-吡喃葡糖基-20(S)-原人参萜三醇)和EGCG((-)表儿茶素-3-没食子酸)的组合物，从而完成本发明。

详细地说，含有低浓度的人参皂苷F1和EGCG两者之一的组合物并没有表现出任何保护皮肤的作用。然而，含有所述浓度的人参皂苷F1和EGCG的混合物的组合物通过它们的协同作用而表现出极好的保护皮肤的作用。也就是说，这两种化合物的联合处理通过它们的协同作用，即使在低浓度下，也能调节抗紫外线辐射的Bcl-2的表达，而这两种化合物任何一种单独处理都没有作用。

因此，本发明涉及用于防止皮肤损伤的含有下面化学式1代表的人参皂苷F1和下面化学式2代表的EGCG作为活性成分的组合物：

                            化学式1

                            化学式2

本发明提供的组合物涉及表皮细胞的凋亡，防止皮肤老化并保持表皮细胞的功能。

所述人参皂苷F1和EGCG可以优选以组合物总重量为基准，掺入0.0001％至10％的合计量。此外，所述人参皂苷F1和EGCG可以优选以1∶0.1-10的重量比掺入。

更具体地说，本发明提供了一种由低剂量紫外线辐射诱导的细胞凋亡的抑制剂，该抑制剂含有人参皂苷F1和EGCG的结合作为活性成分。

此外，本发明提供了一种由紫外线辐射减量调节的Bcl-2表达的调节剂，该调节剂含有人参皂苷F1和EGCG的结合作为活性成分。

另外，本发明提供了一种由紫外线辐射减量调节的Brn-3a表达的调节剂，该调节剂含有人参皂苷F1和EGCG的结合作为活性成分。

根据本发明，人参皂苷F1本身不能增强Bcl-2的表达，但是能防止Bcl-2表达不受紫外线辐射而减量调节。也就是说，人参皂苷F1将Bcl-2表达水平保持在Bcl-2-特异性转录因子Brn-3a的表达调节的正常水平，从而能抑制表皮细胞中由低剂量紫外线辐射引起的细胞调亡。同时，因为高剂量紫外线辐射减量调节Bcl-2的表达，可能诱导受损细胞的细胞凋亡，而受损细胞没有发展成皮肤癌的危险。

本发明在下文实施例的所述作用中证明人参皂苷F1与EGCG的协同作用。详细地说，低浓度的所述两种化合物的联合处理，将由紫外线辐射减量调节的Bcl-2表达恢复到人表皮角质形成细胞——HaCaT细胞的正常水平，从而抑制调亡细胞死亡，而任何一种化合物的单独处理都没有明显作用。此外，我们在先前研究的基础上证明，通过调节Brn-3a——Bcl-2特异性转录因子的表达获得与EGCG的协同作用的细胞凋亡抑制作用。只有所述这两种化合物的联合处理防止了肿瘤-抑制Rb蛋白的去磷酸化作用，从而抑制调亡细胞死亡。

上面的结果表明，人参皂苷F1和EGCG的联合处理通过这两种化合物的协同作用，即使在低浓度下，也能保持Bcl-2在细胞中的水平不变，并且能防止Rb蛋白的去磷酸化，抑制凋亡细胞死亡。

因此，人参皂苷F1和EGCG通过它们的协同作用保持Bcl-2在细胞中的水平不变来抑制凋亡细胞死亡。此外，因为人参皂苷F1本身不能增强Bcl-2的表达，并且不保护有发展成癌症的可能性的细胞使之不发生细胞凋亡，所以没有受损伤细胞发展成癌症的危险。这些结果提示使用人参皂苷F1和EGCG组合物作为抗人皮肤老化的药物的可能性，该组合物通过抑制紫外线诱导的细胞凋亡并防止细胞损伤。

结论是，本发明提供了一种含有人参皂苷F1和EGCG的结合作为活性成分的护肤组合物。本发明的组合物能防止紫外线引起的皮肤损伤从而防止老化。所述组合物可以配制成外用护肤组合物，例如化妆品组合物。然而，所述组合物的目的和制剂并不局限于此。

本发明中使用的人参皂苷F1是通过将纯化的人参皂甙(ginseng saponin)溶解于水性溶剂，例如蒸馏水或缓冲液，或者所述水性溶剂和有机溶剂的混合物中，然后与从青霉(Penicillium)分离的柚苷酶和从曲霉(Aspergillus)分离的果胶酶中的至少一种反应而获得的化合物。但是，人参皂苷F1的制备方法并不限于此。

附图说明

图1图示说明噻唑蓝还原分析(MTT-reduction assay)的结果，这项分析说明人参皂苷F1和EGCG联合处理在表皮细胞中的抗细胞凋亡作用；

图2给出蛋白质印迹分析的结果，该结果说明人参皂苷F1和EGCG联合处理对聚(腺苷酸二磷酸-核糖)聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerase，PARP)裂解的抑制作用。A显示没有紫外线辐射的结果，B显示60毫焦/平方厘米(mJ/cm²)的紫外线辐射存在下的结果。Hsp70代表使用等量蛋白质。在图2中，泳道1显示未处理的对照组的结果：泳道2显示用2μM人参皂苷F1处理的试验组的结果；泳道3是用10μM EGCG处理的结果；泳道4是用2μM人参皂苷F1和10μM EGCG处理的结果；泳道5是用5μM人参皂苷F1处理的结果；泳道6是用50μM EGCG处理的结果；

图3给出蛋白质印迹分析的结果，该结果说明人参皂苷F1和EGCG联合处理对Bcl-2表达的减量调节的抑制作用。A显示没有紫外线辐射的结果，B显示60毫焦/平方厘米紫外线辐射存在下的结果。Hsp70代表使用等量蛋白质。各受处理的试验样品的量与图2所示的相等；

图4给出蛋白质印迹分析的结果，该结果说明人参皂苷F1和EGCG联合处理对Brn-3a表达的减量调节的抑制作用。A显示没有紫外线辐射的结果，B显示60毫焦/平方厘米紫外线辐射存在下的结果。Hsp70代表使用等量蛋白质。各受处理的试验样品的量与图2所示的相等；

图5给出蛋白质印迹分析的结果，该结果说明人参皂苷F1和EGCG联合处理对Rb蛋白的去磷酸化作用的抑制作用。上面的印迹是通过使用识别Rb蛋白的所有磷酸化形式的抗体获得的，下面的印迹是使用只识别磷酸化不足的Rb蛋白的抗体对相同膜印迹得到的。A显示没有紫外线辐射的结果，B显示60毫焦/平方厘米紫外线辐射存在下的结果。各受处理的试验样品的量与图2所示的相等。

具体实施方式

本发明将通过下面的实施例更详细地描述。然而，提供这些实施例只是详细说明的目的，而不应该解释为对本发明范围的限制，这一点对本领域技术人员是显而易见的。

参考实施例1纯化的人参皂甙的制备

将含有蒸馏水的4升甲醇加入2千克红参(韩国烟草人参公社KT&G，六年龄红参)并且回流三次，然后在15℃下静置6天。将粗提取液通过滤纸过滤并离心分离残余物和滤液。减压浓缩滤液。将浓缩物悬浮于蒸馏水，然后用1升乙醚萃取五次，去除色素。用500毫升1-丁醇将含水部分(aqueouspart)萃取三次。用5％KOH处理得到的1-丁醇部分并且用蒸馏水洗涤，然后减压浓缩。将获得的1-丁醇萃取物溶解于少量甲醇并加入大量乙酸乙酯。将得到的沉淀干燥，得到70克纯化的人参皂甙。

参考实施例2人参皂苷F1的制备

将参考实施例1中获得的10克纯化的人参皂甙溶解于1000毫升柠檬酸缓冲液(pH4.0)。然后向其中加入15克从青霉分离的柚苷酶(Sigma，St.Louis，MO)，并且在40℃水浴中搅拌下反应48小时。反应终止之后，通过加热10分钟使酶失活，并用等量乙酸乙酯将反应混合物萃取三次，然后浓缩。通过硅胶柱色谱，用氯仿∶甲醇(9∶1)将得到的产物分级分离，得到1.5克人参皂苷F1。

实施例1人参皂苷F1和EGCG的联合处理在HaCaT细胞中的抗细胞调亡作用：

步骤1细胞系和细胞培养

人角质形成细胞HaCaT细胞系由N.E.Fusenig博士(DeutschesKrebsforschungszentrum(DKFZ)，海德堡，德国)提供，在加有10％胎牛血清的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)(Dulbecco’s modified Eagle’smedium，Gibco 1210-0038)中培养。培养物在37℃下在有5％CO₂的潮湿空气中孵育。

步骤2用人参皂苷F1和EGCG联合处理对HaCaT细胞中紫外线诱导的细胞调亡的抑制

用胰蛋白酶处理步骤1中培养的细胞系，得到单细胞悬浮液，并以每孔2×10⁵个细胞接种到6孔微量培养板上，然后培养24小时。接着，用不含血清的DMEM新鲜替换培养基并将细胞再培养24小时。然后用2μM人参皂苷F1；10μM EGCG；2μM人参皂苷F1和10μM EGCG组合物；5μM人参皂苷F1以及50μM EGCG分别处理微量培养板各孔。

为了参照，将人参皂苷F1以相对于培养基1/1000倍浓度溶解于100％乙醇，并且以相对于培养基1/1000倍浓度将EGCG(Sigma，美国)溶解于二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，然后以需要的量加入培养基。

对各个试验样品处理24小时之后，用磷酸缓冲盐水(phosphate bufferedsaline，PBS)冲洗各个微量培养板，并且在PBS存在下暴露于60mJ/cm²的UVB。然后去除PBS，用含有相应浓度的各化合物的培养基新鲜替换培养基。作为对照，以相同步骤培养未处理的细胞。

紫外线照射24小时之后，向用各种化合物处理的或者未处理的微量培养板加入3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide)(MTT，Sigma)溶液，然后在37℃下将细胞培养4小时。加入DMSO并完全溶解。使用酶标记免疫吸附测定(ELISA)读数器(Thermo Max，Molecular Devices Co，美国)在540纳米下测定形成的甲簪(formazan)的光密度(optical density，OD)。以相对值评价各个试验组的细胞成活率，以未处理对照细胞的OD为100％。结果在图1中给出。

如图1所示，与未处理的对照细胞相比，单独用2μM人参皂苷F1或10μM EGCG单一处理，紫外线引起的凋亡细胞总数没有差别。然而，用2μM人参皂苷F1和10μM EGCG联合处理抑制的紫外线引起的凋亡细胞死亡是未处理对照细胞的大约2倍。这与单独用5μM人参皂苷F1或50μM EGCG单一处理获得的抗细胞凋亡效果相似。

实施例2用人参皂苷F1和EGCG联合处理对PARP蛋白裂解的抑制作用：

步骤1细胞系和细胞培养

这项试验中使用的细胞系及其培养与实施例1步骤1中使用的相同。

步骤2用人参皂苷F1和EGCG联合处理对紫外线诱导的PARP裂解的抑制作用

用胰蛋白酶处理步骤1中培养的细胞系，得到单细胞悬浮液，并以每孔2×10⁵个细胞接种到6孔微量培养板上，然后培养24小时。接着，用不含血清的DMEM新鲜替换培养基并将细胞再培养24小时。然后分别用2μM人参皂苷F1；10μM EGCG；2μM人参皂苷F1和10μM EGCG组合物；5μM人参皂苷F1和50μM EGCG处理微量培养板。将人参皂苷F1以相对于培养基1/1000倍浓度溶解于100％乙醇，并且以相对于培养基1/1000倍浓度将EGCG(Sigma)溶解于二甲亚砜(DMSO)。对各个试验样品处理24小时之后，用PBS冲洗各个微量培养板，并且在PBS存在下暴露于60mJ/cm²的UVB。然后去除PBS，用含有相应浓度的各化合物的培养基新鲜替换培养基。作为对照，以相同步骤培养未处理的细胞。

紫外线照射24小时之后，用PBS洗涤用各种化合物处理的或者未处理的细胞，并用胰蛋白酶处理收获。然后将细胞溶解于含有8M尿素、2％3-[3-(胆酰氨丙基)二甲铵基]丙磺酸内盐(3-[(3-Chloamidopropyl)dimethyl-ammonio]-1-propanesulfonate，CHAPS)、50mM二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)、2M硫脲、2mM苯甲基磺酰氟化物(phenylmethylsulfonylfiuoride，PMSF)和100微克/微升抑酶醛肽的500微升蛋白萃取缓冲液中，室温下反应10分钟。4℃下以15000重力加速度(g)离心10分钟收集上清液，并使用BIO-Rad的Protein Dye Reagent^TM测定蛋白质浓度。通过8％ SDS-PAGE将20微克蛋白按大小级别分离，并在50伏下经12小时转移到PVDF膜(BioRad，美国)上。印迹(blots)在5％脱脂奶液中封闭1小时，然后使用增强化学发光(ECL)试剂盒(Amersham，瑞典)，与作为一抗的抗-PARP兔多克隆抗体(Santa Cruz，美国)和作为二抗的马辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)-偶联的抗-兔IgG(Amersham，瑞典)反应。印迹暴露给X-射线胶片(Fuji，日本)并显影，测定蛋白表达水平。使用PowerLook 2100XL(UMAX)扫描仪对印迹膜上的泳带扫描并且用ImageMaster 2D Elite软件(Amersham Biosciences，瑞典)分析。以未处理的对照组中含量为基础以相对值评价裂解的PARP的含量。结果如图2所示。

如图2所示，与未处理的对照细胞相比，或者与用等浓度的每种化合物的单一处理相比，用2μM人参皂苷F1和10μM EGCG联合处理将紫外线引起的PARP蛋白裂解抑制了大约1.4倍。

实施例3用人参皂苷F1和EGCG联合处理对Bcl-2表达的减量调节的抑制作用：

步骤1细胞系和细胞培养

这项试验中使用的细胞系及其培养与实施例1步骤1中使用的相同。

步骤2用人参皂苷F1和EGCG联合处理对紫外线诱导的Bcl-2表达的减量调节的抑制作用

用胰蛋白酶处理步骤1中培养的细胞系，得到单细胞悬浮液，并以每孔2×10⁵个细胞接种到6孔微量培养板上，然后培养24小时。接着，用不含血清的DMEM新鲜替换培养基并将细胞再培养24小时。然后分别用2μM人参皂苷F1；10μM EGCG；2μM人参皂苷F1和10μM EGCG组合物；5μM人参皂苷F1以及50μM EGCG处理微量培养板。将人参皂苷F1以相对于培养基1/1000倍浓度溶解于100％乙醇，并且以相对于培养基1/1000倍浓度将EGCG(Sigma，美国)溶解于DMSO。对各个试验样品处理24小时之后，用PBS冲洗各个微量培养板，并且在PBS存在下暴露于60mJ/cm²的UVB。然后去除PBS，用含有相应浓度的各化合物的培养基新鲜替换培养基。作为对照，以相同步骤培养未处理的细胞。

紫外线照射24小时之后，用PBS洗涤用各种化合物处理的或者未处理的细胞，并用胰蛋白酶处理收获。然后将细胞溶解于含有8M尿素、2％CHAPS、50mM DTT、2M硫脲、2mM PMSF和100微克/微升抑酶醛肽的500微升蛋白萃取缓冲液中，室温下反应10分钟。4℃下以15000重力加速度(g)离心10分钟收集上清液，并使用BIO-Rad Protein Dye Reagent^TM测定蛋白浓度。通过8％SDS-PAGE将20微克蛋白按大小级别分离，并在50伏下经12小时转移到PVDF膜(BioRad，美国)上。印迹在5％脱脂奶液中封闭1小时，然后使用增强的化学发光(ECL)试剂盒(Amersham，瑞典)，与作为一抗的抗-Bcl-2兔多克隆抗体(Santa Cruz)和作为二抗的HRP-偶联的抗-兔IgG(Amersham，瑞典)反应。印迹暴露给X-射线胶片(Fuji，日本)并显影，测定蛋白表达水平。使用PowerLook 2100XL(UMAX)扫描仪对膜上的泳带扫描并且用ImageMaster 2D Elite软件(AmershamBiosciences，瑞典)分析。结果如图3所示。

如图3所示，紫外线照射下未处理的细胞中没有表达Bcl-2蛋白质。此外，与未处理的对照组相比，只用2μM人参皂苷F1或10μM EGCG单一处理，Bcl-2表达没有差别。但是，用2μM人参皂苷F1或10μM EGCG联合处理，紫外线照射下Bcl-2表达水平维持在没有紫外线照射时的相同水平。也就是说，与未处理的对照组或用一种化合物单一处理相比，两种化合物联合处理将Bcl-2表达提高大约3倍。

实施例4用人参皂苷F1和EGCG联合处理对Brn-3a表达的减量调节的抑制作用：

步骤1细胞系和细胞培养

这项试验中使用的细胞系及其培养与实施例1步骤1中使用的相同。

步骤2用人参皂苷F1和EGCG联合处理对紫外线诱导的Brn-3a表达的减量调节的抑制作用

用胰蛋白酶处理步骤1中培养的细胞系，得到单细胞悬浮液，并以每孔2×10⁵个细胞接种到6孔微量培养板上，然后培养24小时。接着，用不含血清的DMEM新鲜替换培养基并将细胞再培养24小时。然后分别用2μM人参皂苷F1；10μM EGCG；2μM人参皂苷F1和10μM EGCG组合物；5μM人参皂苷F1以及50μM EGCG处理微量培养板。将人参皂苷F1以相对于培养基1/1000倍浓度溶解于100％乙醇，并且以相对于培养基1/1000倍浓度将EGCG(Sigma)溶解于DMSO。对各个试验样品处理24小时之后，用PBS冲洗各个微量培养板，并且在PBS存在下暴露于60mJ/cm²的UVB。然后去除PBS，用含有相应浓度的各化合物的培养基新鲜替换培养基。作为对照，以相同步骤培养未处理的细胞。

紫外线照射24小时之后，用PBS洗涤用各种化合物处理的或者未处理的细胞，并用胰蛋白酶处理收获。然后将细胞溶解于含有8M尿素、2％CHAPS、50mM DTT、2M硫脲、2mM PMSF和100微克/微升抑酶醛肽的500微升蛋白萃取缓冲液中，室温下反应10分钟。4℃下以15000重力加速度(g)离心10分钟收集上清液，并使用BIO-Rad Protein Dye Reagent^TM测定蛋白浓度。通过8％SDS-PAGE将20微克蛋白质按大小级别分离，并在50伏下经12小时转移到PVDF膜(BioRad，美国)上。印迹在5％脱脂奶液中封闭1小时，并且使用ECL试剂盒(Amersham，瑞典)与作为一抗的抗-Brn-3a兔多克隆抗体(Santa Cruz)和作为二抗的HRP-偶联的抗-兔IgG(Amersham，瑞典)反应。印迹暴露给X-射线胶片(Fuji，日本)并显影，测定蛋白表达水平。使用PowerLook 2100XL(UMAX)对膜上的泳带扫描并且用ImageMaster 2D Elite软件(Amersham Biosciences，瑞典)分析。结果如图4所示。

如图4所示，紫外线照射降低了Brn-3a蛋白的表达，只有用两种化合物联合处理才恢复。

实施例5用人参皂苷F1和EGCG联合处理对Rb蛋白的去磷酸化作用的抑制作用：

步骤1细胞系和细胞培养

这项试验中使用的细胞系及其培养与实施例1步骤1中使用的相同。

步骤2用人参皂苷F1和EGCG联合处理对紫外线诱导的Rb蛋白质的去磷酸化作用的抑制作用

用胰蛋白酶处理步骤1中培养的细胞系，得到单细胞悬浮液，并以每孔2×10⁵个细胞接种到6孔微量培养板上，然后培养24小时。接着，用不含血清的DMEM新鲜替换培养基并将细胞再培养24小时。然后分别用2μM人参皂苷F1；10μM EGCG；2μM人参皂苷F1和10μM EGCG组合物；5μM人参皂苷F1以及50μM EGCG处理微量培养板。将人参皂苷F1以相对于培养基1/1000倍浓度溶解于100％乙醇，并且以相对于培养基1/1000倍浓度将EGCG(Sigma)溶解于DMSO。对各个试验样品处理24小时之后，用PBS冲洗各个微量培养板，并且在PBS存在下暴露于60mJ/cm²的UVB。然后去除PBS，用含有相应浓度的各化合物的培养基新鲜替换培养基。作为对照，以相同步骤培养未处理的细胞。

紫外线照射24小时之后，用PBS洗涤用各种化合物处理的或者未处理的细胞，并用胰蛋白酶处理收获。然后将细胞溶解于含有8M尿素、2％CHAPS、50mM DTT、2M硫脲、2mM PMSF和100微克/微升抑酶醛肽的500微升蛋白萃取缓冲液中，室温下反应10分钟。4℃下以15000重力加速度(g)离心10分钟收集上清液，并使用BIO-Rad Protein Dye Reagent^TM测定蛋白浓度。通过8％SDS-PAGE将20微克蛋白按大小级别分离，并在50伏下经12小时转移到PVDF膜(BioRad)上。印迹在5％脱脂奶液中封闭1小时，并且使用ECL试剂盒(Amersham，瑞典)与作为一抗的抗-Rb兔多克隆抗体(识别所有形式的Rb(高度磷酸化形式、磷酸化不足形式等)，SantaCruz)和作为二抗的HRP-偶联的抗-兔IgG(Amersham，瑞典)反应。印迹暴露给X-射线胶片(Fuji，日本)并显影，测定蛋白表达水平。50℃下，使用含有6.25mM Tris、2％SDS和100mM β-巯基乙醇的缓冲液，将相同的印迹冲洗两次，每次10分钟。印迹在5％脱脂奶液中又封闭1小时，并且使用ECL试剂盒(Amersham，瑞典)，与作为一抗的单克隆抗体抗磷酸化不足的Rb(只识别Rb的磷酸化不足形式，BD Biosciences，美国)和作为二抗的HRP-偶联的抗-小鼠IgG(Amersham，瑞典)反应。印迹暴露给X-射线胶片(Fuji，日本)并显影，测定蛋白表达水平。使用PowerLook 2100XL(UMAX)扫描仪对膜上的泳带扫描并且用ImageMaster 2D Elite软件(Amersham Biosciences，瑞典)分析。结果如图5所示。

如图5所示，紫外线照射下，单独用两种化合物中的一种处理的细胞中或者未处理的细胞中Rb蛋白被去磷酸化成为磷酸化不足的形式。然而，使用两种化合物联合处理抑制Rb蛋白去磷酸化作用，产生所有形式的Rb蛋白。

下面，根据本发明，以下面的配方提供含有人参皂苷F1和EGCG的外用组合物。然而，本发明的外用组合物制剂不局限于此。

表1

制剂1：皮肤软化剂

  材料  含量(重量％)  甜菜碱(Betain)  4.0  Natogum  0.1  羧甲基纤维素钠(Cellulose gum)  5.0  乙醇  5.0  丁二醇  5.0  聚氧乙烯氢化蓖麻油  0.2  生育酚乙酸酯  5.0  防腐剂  适量(q.s.)  色素  适量(q.s.)  EGCG  0.0005  人参皂苷F1  0.0001  蒸馏水  至100

表2

制剂2：营养化妆水(toilet water)

  材料  含量(重量％)  己酸十六烷基乙酯(Cetyl ethyl hexanoate)  5.0  十六醇十八醇混合物  1.5  亲脂性一硬脂酸硬脂酸盐  1.2  角鲨烷  2.0  吐温60  1.2  失水山梨糖醇倍半油酸酯  0.8  甘油  8.0  三乙醇胺  0.2  羧乙烯聚合物  0.2  EGCG  0.001  人参皂苷F1  0.001  防腐剂  适量(q.s)  色素  适量(q.s)  香料  适量(q.s.)  蒸馏水  至100

表3

制剂3：营养霜

  材料  含量(重量％)  蜂蜡  1.0  硬脂酸甘油酯  2.0  十六烷酸酯十八烷酸酯混合物(Cetostearate)  2.5  吐温60  1.2  失水山梨糖醇倍半油酸酯  0.4  己酸十六烷酯乙酯  5.0  角鲨烷  7.0  液体石蜡  8.0  甘油  8.0  丙二醇  5.0  植物提取物  5.0  EGCG  0.05  人参皂苷F1  0.01  防腐剂  适量(q.s.)  色素  适量(q.s.)  香料  适量(q.s.)  蒸馏水  至100

表4

制剂4：香精

  材料  含量(重量％)  甘油  15.0  丙二醇  5.0  羧甲基纤维素钠(Cellulose gum)  0.1  Natogum  5.0  透明质酸  8.0  氨基丙烷磺酸  2.0  羧乙烯聚合物  0.3  乙醇  5.0  聚氧乙烯氢化蓖麻油  0.5  三乙醇胺  0.3  EGCG  0.1  人参皂苷F1  0.01  防腐剂  适量(q.s.)  香料  适量(q.s.)  色素  适量(q.s.)  蒸馏水  至100

表5

制剂5：洗液

  材料  含量(重量％)  硬脂酸甘油酯  1.5  吐温60  1.5  失水山梨糖醇倍半油酸酯  0.5  己酸十六烷基乙酯  2.0  角鲨烷  3.0  甘油  8.0  羧乙烯聚合物  0.5  水解胶原(Collagen hydrolysate)  1.0  三乙醇胺  0.5  EGCG  1.0  人参皂苷F1  0.5  防腐剂  适量(q.s.)  香料  适量(q.s.)  色素  适量(q.s)  蒸馏水  至100

表6

制剂6：软膏

  材料  含量(重量％)  癸酸/辛酸甘油三酯  10.0  液态石蜡  10.0  失水山梨糖醇倍半油酸酯  6.0  辛基Dodeth-25  10.0  己酸十六烷基乙酯(Cetyl ethyl hexanoate)  10.0  角鲨烷  1.0  水杨酸  1.0  丙二醇  15.0  山梨糖醇(Sorbitol)  1.0  EGCG  0.01  人参皂苷F1  0.01  蒸馏水  至100

表7

制剂7：喷雾剂

  材料  含量(重量％)  三乙醇胺  0.2  聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙酯  3.0  丙二醇  8.0  聚丙烯酸酯  0.2  EGCG  0.0005  人参皂苷F1  0.0001  蒸馏水  至100

本发明的工业实用性

如上所述，本发明中用人参皂苷F1和EGCG联合处理，通过它们的协同作用，即使在低浓度下，通过抑制紫外线引起的Bcl-2表达或Bcl-2转录因子——Brn-3a表达的减量调节，或者通过防止Rb蛋白的去磷酸化作用，能抑制紫外线诱导的细胞凋亡，而任何单一处理都没有效果。这样，本发明提供使用人参皂苷F1和EGCG的组合物作为抗老化剂对人皮肤防止紫外线引起的细胞损伤的可能性。此外，本发明通过以低浓度使用两种昂贵的化合物，能提供低价格、高功效的化妆品(单一处理情况下，对于目标效果分别需要2.5倍和5倍浓度的人参皂苷F1和EGCG)。