人源化CTLA－4单链抗体与人穿孔素通道形成肽P34的重组免疫毒素

摘要

本发明涉及新型的重组人源化免疫毒素hS83－P34，该免疫毒素含有由人源化细胞毒性T细胞抗原4的抗原结合分子与人穿孔素的通道形成活性分子组成的融合蛋白。本发明的免疫毒素具有严格的靶向性，能避免对正常细胞的伤害，毒副作用小；不需经过内化及细胞内转运过程，作用效率高；不易产生相应抗体，免疫原性弱；不易产生耐药性。可用于治疗某些肿瘤和自身免疫性疾病，以及用于抑制器官移植时的免疫排斥反应。

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型重组免疫毒素，具体地说涉及基于细胞毒性T细胞抗原4(Cytotoxic T Lymphocyte Antigen 4，CTLA-4)的抗原结合分子与膜活性毒素的通道形成活性小分子片段，通过基因重组构建的融合蛋白hS83-P34。

本发明还涉及该免疫毒素的核苷酸序列和氨基酸序列。

本发明还涉及包含该重组免疫毒素的药物组合物。

背景技术

根据抗原与抗体，细胞因子、生长因子和激素与受体等相互识别原理，将对细胞有杀伤作用的分子与抗体等导向分子连接，构建成免疫毒素，可对细胞进行特异性杀伤，实现药物的靶向治疗。

人源化细胞毒性T细胞抗原4(Cytotoxic T Lymphocyte Antigen 4，CTLA-4)是一种仅表达于活化T细胞而静止T细胞不表达的分子，在一些与T细胞相关的肿瘤细胞上也发现CTLA-4的表达(Tazzari PL et al.，The Journalof Immunology，2001，167：4222-9)。因此，CTLA-4的抗原结合分子成为目前理想的导向分子之一，由之产生的免疫毒素只对活化T细胞或肿瘤细胞有杀伤作用，避免了对正常静息T细胞的非特异性损伤，不会使机体免疫力全面下降。

目前，免疫毒素中的毒素分子大多为细菌毒素和植物毒素功能片段。目前使用的细菌毒素包括：白喉杆菌毒素(Diphtheria Toxin，DT)N端388个氨基酸、绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas Exotoxin，PE)C端334个氨基酸(KreitmanRJ，Current Opinion in immunology，2001，11：570-8)；植物毒素主要是蓖麻毒素A链(Ricin A Chain，RTA)，约291个氨基酸(Vitetta ES，Princess Takamatsu Symp，1988，19：333-40)。基于这些毒素片段的免疫毒素在肿瘤、移植排斥等的治疗方面取得了一定效果，其中一种命名为ONTAK的分子，经临床验证后已通过美国FDA(食品与药品监督管理局)批准上市(Frankel AE et al.，Clinical CancerResearch，2000，6：326-34)。但这些毒素存在以下缺点：

1、毒副作用大：这些毒素本身对正常细胞有害，往往造成非特异损伤，即便经过分子修饰，毒性仍然存在(Onda M.et al.，The Journal of Immunology，2000，165：7150-6)；

2、作用效率低：这些毒素都必须经过分子的内化，即穿透细胞膜，输送至细胞内才能启动一系列酶学反应导致细胞凋亡，而内化步骤往往不高，较大地影响了免疫毒素效用的发挥(Panchal RG.，Biochemical Phamacology，1998，55：247-52)；

3、免疫原性强：这些毒素的分子量仍很大，有很强的抗原性，易产生抗体。而且人体内往往存在病原性细菌毒素的天然抗体，对天然毒素和修饰后的毒素都存在一定的中和效应，这必然使靶向分子的杀伤效率大大降低(Hall PD.et al.，Clinical Immunology，2001，100：191-7)。

4、易产生耐药性：目前杀伤分子主要通过抑制胞内蛋白质合成的机制杀灭靶细胞，容易产生耐药性。

除上述毒素外，还存在另一类不需内化、通过在细胞膜上形成通道而杀伤细胞的膜活性毒素，但对其结构认识的不足一直制约着它们的应用。随着研究的发展，越来越多膜活性毒素的结构和功能已被了解。研究发现，杀伤性T细胞用于清除非自身细胞或病变细胞的一种通道形成蛋白——穿孔素(Perforin)，仅由N端前34个氨基酸构成的结构域(简称P34)也具有通道形成能力(Ojcius DM.et al.，PNAS，1991，88：4621-5)。如果选择人穿孔素的通道形成活性小分子片段则可避免以往毒素带来的缺点。

中国专利申请98113025.9公开了—种新的免疫毒素，该免疫毒素利用人源性毒素穿孔素(Perforin)的活性片段作为毒素分子，通过基因工程技术将毒素分子与载体分子的基因重组在大肠杆菌中表达出来。其优点是对人体不具有免疫原性，有严格靶向性，可直接激发细胞损伤过程，杀灭靶细胞，不需要内化及细胞内转运过程。其可用于治疗某些肿瘤和自身免疫性疾病，特别是适合用于抑制器官移植时的免疫排斥反应。在该发明中，与穿孔素的活性片段连接的分子为IL-2的基因片段。

目前，尚没有相关文献涉及基于CTLA-4单链抗体和小分子通道形成肽的重组免疫毒素。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组免疫毒素，其含有由人源化细胞毒性T细胞抗原4的抗原结合分子与人穿孔素的通道形成活性分子P34组成的融合蛋白。

本发明的另一个目的在于提供该重组免疫毒素的核苷酸序列和氨基酸序列。

本发明的再一个目的在于提供包含该重组免疫毒素的药物组合物。

根据本发明的一个方面，本发明的重组免疫毒素为一种采用基因工程方法构建的重组融合蛋白，由细胞毒性T细胞抗原4(Cytotoxic T LymphocyteAntigen 4，CTLA-4)的抗原结合分子与膜活性毒素的通道形成活性小分子片段通过基因重组构建。

在本发明的一个具体实施方案中，该抗原结合分子为人源化细胞毒性T细胞抗原4的单链抗体，膜活性毒素的通道形成活性小分子片段可以是包括人穿孔素N端前34个氨基酸组成的通道形成结构域。该重组免疫毒素的构建利用人源化细胞毒性T细胞抗原4的单链抗体作为导向片段，人穿孔素N端前34个氨基酸组成的通道形成结构域作为杀伤片段。

在本发明中，将本发明提供的重组免疫毒素蛋白简称为hS83-P34；将人源化细胞毒性T细胞抗原4的单链抗体蛋白简称为hS83；将人穿孔素N端前34个氨基酸组成的通道形成结构域蛋白简称为P34。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了编码该重组免疫毒素的核苷酸序列及其氨基酸序列，根据已知的Anti-CTLA-4-hS83和Perforin序列，设计相应的PCR引物，以人源性CTLA-4噬菌体抗体库中的阳性克隆Anti-CTLA-4-hS83为模板，分别扩增编码hS83基因的导向片段基因和编码P34基因的杀伤片段基因，并引入限制性内切酶(HindIII)酶切位点，将制备的编码hS83基因和编码P34基因连接，其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列并编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。将连接后的基因克隆进入质粒pQE30，筛选获得含有编码hS83-P34基因的质粒载体pQE30-hS83-P34，再将获得的质粒载体转化大肠杆菌M15，获得转化的宿主细胞，该宿主细胞表达产物即为本发明的重组免疫毒素。

本发明中使用的质粒载体pQE30中含有一段Met Arg Gly Ser His His HisHis His His Gly Ser Ala Cys Glu Leu氨基酸序列，相应地通过本发明构建的含融合基因的载体pQE30-hS83-P34所表达的蛋白中也含有这段氨基酸序列，如SEQ ID NO.3所示。Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ala Cys GluLeu序列的引入，一方面可以使所述重组免疫毒素因为改变了载体而高表达，另一方面也有利于纯化和检测。

根据本发明的再一个方面，本发明提供了一种药物组合物，该组合物包含治疗有效量的上述重组免疫毒素，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

本发明利用基因工程技术制备的新型重组免疫毒素对以CTLA-4表达为特征的活化T细胞及白血病细胞具有细胞毒性，可用于预防和/或治疗移植排斥，以及治疗某些T细胞淋巴瘤疾病。

本发明优于传统免疫毒素之处在于：

1、本发明使用的毒素是人体固有蛋白，毒性小，且不会受到预存抗体的中和，效价高；

2、传统毒素必经的内化过程效率低，本发明所用毒素只需插入细胞膜就起作用，不需分子内化，因而效率高；

3、本发明中所用毒素为34个氨基酸，为传统毒素的1/10，抗原性弱；

4、本发明使用的毒素为新型作用机制，其通过在细胞膜上形成通道导致细胞内容物泄露而死亡，细胞不容易通过改变细胞膜的脂质双分子层组成和结构来产生耐药性。

经体外实验证明，本发明的重组免疫毒素对以CTLA-4表达为特征的活化T细胞及白血病细胞具有明显的细胞毒性。

为了更好地理解本发明的本质，下面结合附图，通过对本发明较佳实施方式的描述，详细说明但不限制本发明。

附图的简要说明

图1为pQE30-hS83-P34质粒结构图；

图2为本发明的hS83-P34制备过程中各PCR产物和克隆质粒的酶切图谱；

图中：M、DL2000；1、hS83fPCR；2、pBS-hS83f；3、pBS-hS83f，SacI/HindIII双酶切；4、P34PCR；5、pBS-P34HS；6、pBS-P34HS，HindIII/SalI双酶切；7、pQE30-hS83-P34；8、pQE30-hS83-P34SacI/SalI双酶切；9、pQE30-hS83-P34SacI/PstI双酶切

图3为hS83-P34蛋白SDS-PAGE电泳和Western印迹图；

A SDS-PAGE M、marker；1、hS83-P34诱导前；2、hS83-P34诱导后；3、hS83-P34破菌上清；4、hS83-P34破菌沉淀

B western 1、hS83-P34诱导前；2、hS83-P34诱导后；3、hS83-P34破菌上清；4、hS83-P34破菌沉淀

图4为对照分子hS83制备过程中各PCR产物和克隆质粒的酶切图谱；

图中：M、DL2000；1、hS83PCR；2、pBS-hS83；3、pBS-hS83SacI/SalI双酶切；4、pQE30-hS83；5、pQE30-hS83SacI/SalI双酶切；6、pQE30-hS83SacI/PstI双酶切；

图5为hS83-P34蛋白对活化T和非活化T细胞杀伤作用的比较；

图6为hS83-P34蛋白对抗原阳性和阴性细胞杀伤作用的比较；

图7为不同浓度hS83-P34蛋白对相同数量活化T细胞作用的比较；

图8为不同浓度hS83-P34蛋白对相同数量6T-CEM作用的比较；

图9为不同浓度hS83-P34蛋白对相同数量Raji作用的比较；

图10为相同浓度hS83-P34对不同量活化T细胞的作用；

图11为相同浓度hS83-P34对不同量白血病细胞的作用；

图12为hS83-P34对活化T细胞的作用时效曲线；

图13为hS83-P34对CEM和Raji的作用时效曲线。

发明的具体实施方式

本发明所用的试验材料如无特别说明均为市售购买产品。

                重组免疫毒素hS83-P34的获得

【实施例1】

1、导向片段基因的克隆

扩增的模板为装载了Anti-CTLA-4-hS83基因的pCANTAB 5E质粒(GE公司)，也可以按照Pistillo等描述的方法制备扩增模板(Pistillo MP et al，Molecular characterization and applications of recombinant scFv Abs to CTLA-4co-stimulatory molecule.Tissue Antigens，2000，55：229-38)。

根据Anti-CTLA-4-hS83的基因序列设计引物：

P1 5’-CAGTGAGCTCATGGCCGAGGTGCAGCTGG-3’

P2 5’-AGTCAAGCTTACCTAGGACGGTCAGCTTGG-3’

用高保真的Platimum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，USA)进行PCR扩增，PCR扩增条件如下：94℃10min后，94℃45sec，50℃1min，68℃2min，共30个循环。PCR扩增获得了约750bp的导向片段基因，并引入相应酶切位点。

PCR产物经小量胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司提供)纯化后，以SacI/HindIII双酶切，然后克隆于pBlueselect(BBI公司)。用SacI/HindIII双酶切鉴定，鉴定的阳性克隆再测序(Gene Tech(上海)有限公司，LI-COR 4300系统)验证，测序正确的质粒命名为pBS-hS83f。

2、杀伤片段基因的克隆

以质粒pGT60-hPFN(InvivoGen，USA)为模板，根据人穿孔素(perforin)的N端前34个氨基酸(序列如SEQ ID NO.6所示)的基因序列设计引物：

P3 5’-AGTCAAGCTTCCGTGCCACACAGCCGCACGCTCAGA-3’

P4 5’-CACTGTCGACTCAGCGGCGGAGGCTGGT-3’

用高保真的Platimum Pfx DNA聚合酶进行PCR扩增，PCR扩增条件如下：94℃10min后，94℃45sec，50℃1min，68℃2min，共30个循环。PCR扩增获得了约120bp的杀伤片段基因，并引入相应酶切位点。

PCR产物经小量胶回收试剂盒纯化后，以HindIII/SalI双酶切，然后克隆于pBlueselect。用HindIII/SalI双酶切鉴定，鉴定的阳性克隆再测序验证，测序正确的质粒命名为pBS-P34HS。

3、重组免疫毒素HS83-P34表达质粒的构建及诱导表达

以SacI/HindIII双酶切pBS-hS83f，回收约750bp的DNA片段，然后连接到经同样酶切的pBS-P34HS中，SacI/SalI双酶切鉴定的阳性克隆命名为pBS-hS83-P34。

用SacI/SalI双酶切pBS-hS83-P34，回收约870bp的DNA片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2。再克隆到pQE30(QIAGEN公司)，SacI/SalI以及SacI/PstI双酶切鉴定的阳性克隆命名为pQE30-hS83-P34，其质粒结构图见图1。

上述PCR产物和质粒阳性克隆的酶切鉴定结果如图2所示。

提取pQE30-hS83-P34质粒，转化到表达菌株大肠杆菌M15(QIAGEN公司)中，表达产物的氨基酸序列如SEQ ID NO.3。挑取单菌落，接种后过夜培养。次日按1∶100转接，培养至OD₅₅₀约为0.5时，加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为0.1mmol/L，诱导5h。SDS-PAGE和western分析，结果见图3，可见经IPTG诱导获得了高表达，表达量约占总菌量的30％(通过Quantity One软件分析)。

4℃下8000rpm离心10min收获细菌。用50mM Tris-HCl按10ml/g重悬菌体，以功率300W、工作2秒、间隙2秒、总时间3分钟为一循环，共6次进行超声破碎。8000g，30分钟离心，上清和沉淀进行SDS-PAGE和western，结果表明表达产物主要以不溶性包涵体存在。

4、重组免疫毒素hS83-P34的分离纯化和复性

将包涵体先用2mol/L尿素(溶于50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，含2％TritonX-100及1mmol/L EDTA)缓冲液洗涤(30℃，1小时)，然后5000g，30分钟离心，重复该操作1次；再用Tris-HCl缓冲液重悬沉淀，5000g，30分钟离心洗涤共两次。然后用变性液(8mol/L尿素，50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，20mmol/Lβ-巯基乙醇)按约12ml/g 4℃过夜溶解包涵体。

变性蛋白经金属鳌和亲和介质Chelating Sepharose Fast Flow(Pharmacia公司)结合后，用清洗缓冲液(8mol/L尿素，50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，20mmol/Lβ-巯基乙醇，20mmol/L咪唑)除去非特异性结合的蛋白，用洗脱缓冲液(8mol/L尿素，50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，20mmol/Lβ-巯基乙醇，250mmol/L咪唑)洗脱，可获得除去了大部分杂质的蛋白。然后用DEAE-Sephedex Fast Flow(Pharmacia公司)进一步纯化，该介质可吸附杂蛋白，在穿透峰中获得的即是纯度大于90％的重组免疫毒素hS83-P34。

纯化后的蛋白用复性缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，含0.15mmol/LNaCl，及1mmol/L氧化型谷胱甘肽3mmol/L还原型谷胱甘肽，0.01％SDS)透析48h，即获得复性蛋白。再用缓冲液(含50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，含0.15mmol/L NaCl)进行透析过夜，再用PBS(20mmol/L，pH 7.4，0.9％NaCl)透析，使蛋白处于PBS体系，即可进行功能测定。

                    对照分子hS83的制备

【实施例2】

1、hS83基因的克隆

以Anti-CTLA-4-hS83质粒为模板，根据其基因序列设计引物：

P5 5’-CAGTGAGCTCATGGCCGAGGTGCAGCTGG-3’

P6 5’-CAGTGTCGACTCAACCTAGGACGGTCAGCTTGG-3’

用高保真的Platimum Pfx DNA聚合酶进行PCR，PCR条件如下：94℃10min后，94℃ 45sec，50℃ 1min，68℃ 2min，共30个循环。PCR扩增获得了约750bp的导向片段基因，并引入相应酶切位点。

PCR产物经小量胶回收试剂盒纯化后，以SacI/SalI双酶切，然后克隆于pBlueselect。用SacI/SalI双酶切鉴定，鉴定的阳性克隆再测序验证，测序正确的质粒命名为pBS-hS83。酶切图谱见图4。

2、hS83表达质粒的构建及诱导表达

以SacI/SalI双酶切pBS-hS83，回收约750bp的DNA片段，然后克隆到pQE30，SacI/SalI以及SacI/PstI双酶切鉴定的阳性克隆命名为pQE30-hS83。

提取pQE30-hS83质粒，转化到表达菌株大肠杆菌M15中，其表达产物的DNA序列如SEQ ID NO.4，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.5。

挑取单菌落，接种后过夜培养。次日按1∶100转接，培养至OD₅₅₀约为0.5时，加IPTG至终浓度为0.1mmol/L，诱导5h。SDS-PAGE和western分析，可见经IPTG诱导获得了高表达，表达量约占总菌量的50％。

4℃下8000rpm离心10min收获细菌。用50mM Tris-HCl按10ml/g重悬菌体，以功率300W、工作2秒、间隙2秒、总时间3分钟为一循环，共6次进行超声破碎。8000g，30分钟离心，上清和沉淀进行SDS-PAGE和western，结果表明表达产物主要以不溶性包涵体存在。

将包涵体先用2mol/L尿素(溶于50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，含2％TritonX-100及1mM EDTA)缓冲液洗涤(30℃，1小时)，然后5000g，30分钟离心，重复该操作1次；再用Tris-HCl缓冲液重悬沉淀，5000g，30分钟离心洗涤共两次。然后用变性液(8mol/L尿素，50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，10mMDTT)按约12ml/g 4℃过夜溶解包涵体。

变性蛋白经金属鳌和亲和介质Chelating Sepharose Fast Flow(Pharmacia公司)结合后，用清洗缓冲液(8mol/L尿素，50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，20mmol/Lβ-巯基乙醇，20mmol/L咪唑)除去非特异性结合的蛋白，用洗脱缓冲液(8mol/L尿素，50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，20mmol/Lβ-巯基乙醇，250mmol/L咪唑)洗脱，可获得除去了大部分杂质的蛋白。然后用DEAE-Sephedex Fast Flow(Pharmacia公司)进一步纯化，该介质可吸附杂蛋白，在穿透峰中获得的即是纯度大于90％的hS83。

纯化后的蛋白用复性缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，pH8.0，含0.15mmol/LNaCl，及1mmol/L氧化型谷胱甘肽，3mmol/L还原型谷胱甘肽，0.01％SDS)透析48h，即获得复性蛋白。再用buffer(含50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，含0.15mmol/L NaCl)进行透析过夜，再用PBS(20mmol/L，pH7.4，0.9％NaCl)透析，使蛋白处于PBS体系，即可用于后续实验。

                    重组免疫毒素的体外功能检测

【实施例3】

在下述试验中所用的细胞株均购于中国科学院细胞库，它们的产品编号和全称如下：

Raji：编号TcHu44，人Burkitt’s淋巴瘤的瘤细胞株；

6T-CEM：编号TcHu2，人T细胞白血病细胞株；

(上述两种细胞株均组成型表达CTLA-4。)

ECV-304：编号GNHu3，正常人脐带静脉内皮细胞。

一、细胞杀伤特异性分析

1、对活化与非活化T细胞杀伤作用的比较

收集活化的T细胞(Ta)、非活化T细胞(To)，按1.5×10⁵/孔接种于96孔板，再加入hS83-P34，终浓度为1.5μmol/L，24小时后，MTS法490nm测定存活细胞的量，以hS83为对照。以PBS空白对照组的细胞存活率作为100％计算基准，分析hS83-P34对不同细胞的影响。

结果见图5。结果显示，1.5μmol/L hS83-P34对活化T细胞作用，细胞存活率仅约为33％；而对非活化T细胞作用，细胞存活率约为83％。hS83对活化与非活化T细胞作用后，细胞存活率均为80％左右。以上结果说明，hS83-P34对活化后表达CTLA-4抗原的T细胞有显著的特异性杀伤作用。

2、对抗原阳性和阴性细胞杀伤作用的比较

抗原阳性细胞6T-CEM、Raji按3×10⁴/孔，阴性细胞ECV304按1×10⁴/孔接种于96孔板，再加入hS83-P34，终浓度为1.5μmol/L，24小时后，MTS法490nm测定存活细胞的量，以hS83为对照。以PBS空白对照组的细胞存活率作为100％计算基准，分析hS83-P34对不同细胞的影响。

结果见图6。结果显示，1.5μmol/L hS83-P34对抗原阳性细胞6T-CEM、Raji作用后，细胞存活率仅为30％左右；而对阴性细胞作用时，细胞存活率约为89％；hS83对抗原阳性和阴性细胞作用后，细胞存活率均为85％以上。

以上结果说明，hS83-P34对活化后表达CTLA-4的细胞株有显著的特异性杀伤作用。

二、杀伤效果

1、量效关系

1.1不同浓度hS83-P34对相同数量靶细胞的作用情况

1.1.1对活化T细胞的作用

收集Con A(伴刀豆球蛋白A，Sigma公司)活化的T细胞，按1.5×10⁵/孔接种于96孔板，再与不同浓度的hS83-P34作用，24小时后，MTS法490nm测定存活细胞的量，以hS83为对照。以PBS空白对照组的细胞存活率作为100％计算基准，分析不同浓度的hS83-P34对细胞的影响。

结果见图7。结果表明，hS83-P34对活化T细胞作用后，细胞存活率显著下降，当hS83-P34为0.2μmol/L时，细胞存活率降低至约50％，当hS83-P34进一步增加到1.5μmol/L时，细胞存活率仅约10％。

1.1.2对白血病细胞株的作用

收集6T-CEM、Raji细胞，按3×10⁴/孔接种于96孔板，再与不同浓度的hS83-P34作用，24小时后，MTS法490nm测定存活细胞的量，以hS83为对照。以PBS(磷酸盐缓冲液)空白对照组的细胞存活率作为100％计算基准，分析不同浓度的hS83-P34对白血病细胞的影响。

结果见图8和图9。结果表明：hS83-P34对6T-CEM、Raji作用后，细胞存活率均有明显的降低。对6T-CEM，随着hS83-P34浓度的增加，细胞存活率相应降低，当hS83-P34为1.5μmol/L时，细胞存活率降低至45.38％，当hS83-P34进一步增加到2.5μmol/L时，细胞存活率降低至29.21％。相同浓度的hS83对照组细胞存活率也有降低，但降低幅度明显低于实验组。对Raji也显示了相似的结果，当hS83-P34为1.0μmol/L时，细胞存活率降低至42.9％，当hS83-P34进一步增加到2.5μmol/L时，细胞存活率降低至17.52％。

以上结果说明，在细胞量为3×10⁴/孔时，hS83-P34对6T-CEM、Raji具有明显的杀伤作用；hS83-P34浓度在1.0μmol/L左右，即可达到50％的杀伤效果。

1.2同一浓度hS83-P34对不同数量细胞的作用情况。

1.2.1对活化T细胞的作用

收集Con A活化的T细胞，按1×10⁵/孔、2×10⁵/孔、3×10⁵/孔、4×10⁵/孔、5×10⁵/孔和6×10⁵/孔的细胞量接种于96孔板，再加入20μl的hS83-P34，终浓度为1.0μmol/L，24小时后，MTS法490nm测定存活细胞的量。以PBS空白对照组的细胞存活率作为100％计算基准，分析hS83-P34对不同数量细胞的影响。

结果见图10。结果表明，随着细胞量的增加，细胞存活率逐渐增加。当细胞量为1×10⁵时，细胞存活率约为40％；细胞量增加到4×10⁵～6×10⁵时，细胞存活率达71％～73％左右。

1.2.2对白血病细胞株的作用

收集6T-CEM、Raji细胞，按1×10⁴/孔、3×10⁴/孔、5×10⁴/孔、7×10⁴/孔、9×10⁴/孔、12×10⁴/孔和15×10⁴/孔的细胞量接种于96孔板，体积为180μl，再加入20μl的hS83-P34，终浓度为1.5μmol/L，24小时后，MTS法490nm测定存活细胞的量。以PBS空白对照组的细胞存活率作为100％计算基准，分析hS83-P34对不同数量细胞的影响。

结果见图11。结果表明，随着细胞量的增加，细胞存活率逐渐增加。当细胞量为1×10⁴时，细胞全部死亡；细胞量为9×10⁴时，细胞存活率约为51％；细胞量增加到15×10⁴时，细胞存活率达到约75％。

2、时效关系

一定浓度hS83-P34对一定数量细胞作用不同时间的情况。

2.1对活化T细胞的作用

收集Con A活化的T细胞，按1.5×10⁵/孔接种于96孔板，再加入20μl的hS83-P34，终浓度为1.0μmol/L，分别在4、8、12、18、24、36、48、72小时用MTS法490nm测定存活细胞的量，以hS83为对照。以PBS空白对照组的细胞存活率作为100％计算基准，分析不同浓度的hS83-P34对细胞的影响。

结果见图12。结果显示，在蛋白作用的前8hr，细胞存活率在86％以上；随着作用时间的延长，细胞的存活率降低，在18hr时达最低，细胞存活率约为41％；继续延长作用时间，在18～36hr，细胞存活率未见明显变化，在50％左右；36hr以后，细胞存活率有所升高；72hr时检测，细胞存活率达到约63％。

该结果提示，hS83-P34对细胞的杀伤作用发生较早，在12～24小时；之后，hS83-P34蛋白的作用减弱。

2.2对白血病细胞株的作用

收集6T-CEM、Raji细胞，按3×10⁴/孔接种于96孔板，再加入20μl的hS83-P34，终浓度为1.0μmol/L，分别在4、8、12、18、24、36、48、72小时用MTS法490nm测定存活细胞的量，以hS83为对照。以PBS空白对照组的细胞存活率作为100％计算基准，分析不同浓度的hS83-P34对细胞的影响。

结果见图13。结果表明，蛋白作用于6T-CEM细胞，在蛋白作用的前12hr，细胞存活率在88％以上；随着作用时间的延长，细胞的存活率降低，在18hr时达最低，细胞存活率为47.88％；继续延长作用时间，在18～36hr，细胞存活率未见明显变化，在50％左右；36hr以后，细胞存活率有所升高；72hr时检测，细胞存活率达到约70％。作用于Raji细胞，蛋白作用12hr时，细胞存活率约为92％；而在18hr时，细胞存活率仅有约56％；18～72hr时，细胞的存活率稳定在60％～65％左右。

该结果提示，hS83-P34对细胞的杀伤作用发挥较早，在12～24小时；之后，蛋白的作用减弱。

以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

SEQUENCE LISTING

<110>四川人学华西医院

<120>人源化CTLA-4单链抗体与人穿孔素通道形成肽P34的重组免疫毒素

<130>CD92-04P100168

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>837

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(834)

<223>

<400>1

atg gcc gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc tta gtt cag cct    48

Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1               5                   10                  15

ggg ggg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt    96

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

            20                  25                  30

agc tac tgg atg cac tgg gtc cgc caa gct cca ggg aag ggg ctg gtg    144

Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val

        35                  40                  45

tgg gtc tca cgt att aat agt gat ggg agt agc aca agc tac gcg gac    192

Trp Val Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp

    50                  55                  60

tcc gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac acg    240

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

65                  70                  75                  80

ctg tat ctg caa atg aac agt ctg aga gcc gag gac acg gcc gtg tat    288

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

                85                  90                  95

tac tgt gca aga cgt agg cct acg ggt cat tgg cat tgg ggc caa ggt    336

Tyr Cys Ala Arg Arg Arg Pro Thr Gly His Trp His Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

acc ctg gtc acc gtg tcg aga ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc    384

Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

        115                 120                 125

tct ggc ggt ggc gga tcg tct gag ctg act cag gac cct gct gtg tct    432

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser

    130                 135                 140

gtg gcc ttg gga cag aca gtc agg atc aca tgc caa gga gac agc ctc    480

Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu

145                 150                 155                 160

aga agc tat tat gca agc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct    528

Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

                165                 170                 175

gta ctt gtc atc tat ggt aaa aac aac cgg ccc tca ggg atc cca gac    576

Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp

            180                 185                 190

cga ttc tct ggc tcc agc tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act    624

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr

        195                 200                 205

ggg gct cag gcg gaa gat gag gct gac tat tac tgt aac tcc cgg gac    672

Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp

    210                 215                 220

agc agt ggt aac cat gtg gta ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc    720

Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val

225                 230                 235                 240

cta ggt aag ctt ccg tgc cac aca gcc gca cgc tca gag tgc aag cgc    768

Leu Gly Lys Leu Pro Cys His Thr Ala Ala Arg Ser Glu Cys Lys Arg

                245                 250                 255

agc cac aag ttc gtg cct ggt gca tgg ctg gcc ggg gag ggt gtg gac    816

Ser His Lys Phe Val Pro Gly Ala Trp Leu Ala Gly Glu Gly Val Asp

            260                 265                 270

gtg acc agc ctc cgc cgc tga                                        837

Val Thr Ser Leu Arg Arg

        275

<210>2

<211>278

<212>PRT

<213>Artificial

<400>2

Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1               5                   10                  15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

            20                  25                  30

Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val

        35                  40                  45

Trp Val Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp

    50                  55                  60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

65                  70                  75                  80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

                85                  90                  95

Tyr Cys Ala Arg Arg Arg Pro Thr Gly His Trp His Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser

    130                 135                 140

Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu

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Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

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Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr

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Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp

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Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val

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Leu Gly Lys Leu Pro Cys His Thr Ala Ala Arg Ser Glu Cys Lys Arg

                245                 250                 255

Ser His Lys Phe Val Pro Gly Ala Trp Leu Ala Gly Glu Gly Val Asp

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Val Thr Ser Leu Arg Arg

        275

<210>3

<211>294

<212>PRT

<213>Artificial

<400>3

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ala Cys Glu Leu

1               5                   10                  15

Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

            20                  25                  30

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

        35                  40                  45

Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val

    50                  55                  60

Trp Val Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp

65                  70                  75                  80

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

                85                  90                  95

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

            100                 105                 110

Tyr Cys Ala Arg Arg Arg Pro Thr Gly His Trp His Trp Gly Gln Gly

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Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

    130                 135                 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser

145                 150                 155                 160

Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu

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Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

            180                 185                 190

Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp

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Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr

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Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp

225                 230                 235                 240

Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val

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Leu Gly Lys Leu Pro Cys His Thr Ala Ala Arg Ser Glu Cys Lys Arg

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Ser His Lys Phe Val Pro Gly Ala Trp Leu Ala Gly Glu Gly Val Asp

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Val Thr Ser Leu Arg Arg

    290

<210>4

<211>777

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(774)

<223>

<400>4

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Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ala Cys Glu Leu

1               5                   10                  15

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Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

            20                  25                  30

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Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

        35                  40                  45

agc tac tgg atg cac tgg gtc cgc caa gct cca ggg aag ggg ctg gtg    192

Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val

    50                  55                  60

tgg gtc tca cgt att aat agt gat ggg agt agc aca agc tac gcg gac    240

Trp Val Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp

65                  70                  75                  80

tcc gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac acg    288

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

                85                  90                  95

ctg tat ctg caa atg aac agt ctg aga gcc gag gac acg gcc gtg tat    336

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

            100                 105                 110

tac tgt gca aga cgt agg cct acg ggt cat tgg cat tgg ggc caa ggt    384

Tyr Cys Ala Arg Arg Arg Pro Thr Gly His Trp His Trp Gly Gln Gly

        115                 120                 125

acc ctg gtc acc gtg tcg aga ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc    432

Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

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tct ggc ggt ggc gga tcg tct gag ctg act cag gac cct gct gtg tct    480

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser

145                 150                 155                 160

gtg gcc ttg gga cag aca gtc agg atc aca tgc caa gga gac agc ctc    528

Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu

                165                 170                 175

aga agc tat tat gca agc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct    576

Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

            180                 185                 190

gta ctt gtc atc tat ggt aaa aac aac cgg ccc tca ggg atc cca gac    624

Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp

        195                 200                 205

cga ttc tct ggc tcc agc tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act    672

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr

    210                 215                 220

ggg gct cag gcg gaa gat gag gct gac tat tac tgt aac tcc cgg gac    720

Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp

225                 230                 235                 240

agc agt ggt aac cat gtg gta ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc    768

Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val

                245                 250                 255

cta ggt tga                                                        777

Leu Gly

<210>5

<211>258

<212>PRT

<213>Artificial

<400>5

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ala Cys Glu Leu

1               5                   10                  15

Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

            20                  25                  30

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

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Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val

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Trp Val Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp

65                  70                  75                  80

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

                85                  90                  95

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

            100                 105                 110

Tyr Cys Ala Arg Arg Arg Pro Thr Gly His Trp His Trp Gly Gln Gly

        115                 120                 125

Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

    130                 135                 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser

145                 150                 155                 160

Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu

                165                 170                 175

Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

            180                 185                 190

Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp

        195                 200                 205

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr

    210                 215                 220

Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp

225                 230                 235                 240

Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val

                245                 250                 255

Leu Gly

<210>6

<211>34

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(34)

<223>

<400>6

Pro Cys His Thr Ala Ala Arg Ser Glu Cys Lys Arg Ser His Lys Phe

1               5                   10                  15

Val Pro Gly Ala Trp Leu Ala Gly Glu Gly Val Asp Val Thr Ser Leu

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Arg Arg