人源化抗CTLA-4单链抗体及其免疫毒素融合蛋白的表达与纯化研究：原核大肠杆菌与真核毕赤酵母表达系统

摘要

细胞毒性T淋巴细胞抗原4(Cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4，CDl52)是T细胞共刺激受体CD28的结构同源物，通过与抗原提呈细胞上CD28的共同配体CD80/CD86相互作用，而在T细胞反应中起负调节作用。CTLA4在活化的T细胞和一些肿瘤细胞表面表达，是T细胞活化的良好标志，可以作为免疫抑制剂和肿瘤治疗的靶标。 抗CTLA-4单链抗体(anti-CTLA4 scFv)具有特异性结合CDl52的活性，在体外和体内是潜在的活化T细胞及肿瘤细胞的靶向分子。在抗CTLA-4单链抗体上融合具有特殊功能的效应分子，能起到对靶细胞特异杀伤的作用，从而为实现特异性免疫抑制和肿瘤靶向治疗提供可能途径。 人源化抗CTLA-4单链抗体及其相关免疫毒素融合蛋白在生物医学实验研究和免疫系统相关疾病、移植免疫以及肿瘤靶向治疗、诊断等领域有着广阔的应用前景。 本研究以人源化抗CTLA-4单链抗体(anti-cTLA4 scFv，简称hS)及其相关免疫毒素融合蛋白(hSP，在hS的C端融合了人穿孔素孔道形成结构域的34个氨基酸的融合蛋白)为研究对象。 为了获得一定量纯化的蛋白以深入研究它们的靶向杀伤功能，而先后在原核大肠杆菌和真核毕赤酵母系统表达hS和hSP，进行纯化，初步检测hS蛋白体外结合活性，同时比较它们在两个系统中的表达情况，为后续类似蛋白的表达提供模式和借鉴。结果如下： 针对原核大肠杆菌系统表达纯化hS和hSP的研究，构建了hS和hSP蛋白在原核大肠杆菌系统的表达质粒pQE-hS、pQE-hSP；并在大肠杆菌M15q中以包涵体形式高表达，表达量占细菌总蛋白的30--54％：建立了hS和hSP包涵体洗涤、纯化方法和包涵体复性方法，确定了hS蛋白复性的条件：在4℃，对复性液(50mM Tris-C1 pH 8.0，150mM NaCl，3mM GSH，lmM GSSG，1MUrea)透析复性48小时。hSP蛋白复性条件：在10℃，对复性液(50mM Tris-C1 pH 8.0，20 mM NaCI、0.8 mM KCl、1 mM EDTA、1Murea、0.8 ML-arginine和2mM GSH:0.2 mM GSSG)透析18d小时<'[35]>。纯化复性后蛋白的产量：hS，1L培养基产菌体3.866g，洗涤后包涵体1.483g，复性后蛋白28mg;hSP,1L培养基产菌体3.446g,洗涤后包涵体1.216g，复性后蛋白20mg。 本研究构建了hS和hSP在巴斯德毕赤酵母中的表达质粒pPIC9K-hS和pPIC9K-hSP；电穿孔转化酵母感受态细胞，用Geneticin浓度梯度平板筛选多拷贝插入重组子；经过小规模首次甲醇诱导和两轮表达条件优化(甲醇浓度、诱导时间、诱导起始OD600值)，并通过亲和纯化浓缩目的蛋白。 从1-1.2 L诱导培养基，可获得的S浓度从0.32mg／ml提高到1.516mg／ml,产量从1.908mg提高到9.505mg；hSP浓度从0.13mg／ml提高到0.505mg／ml，产量从0.95mg提高到2.525mg。但是，可获得的SP的浓度始终只有S的20％-30％；SP的产量始终只有S的20％-50％。 诱导后，hS的酵母胞内检测到a-factor-S和S两种蛋白，hSP胞内只检测到a-factor-SP，且量不及胞内S蛋白的三分之一。S蛋白的表达水平高于SP蛋白。后续将考虑继续优化hSP表达条件，如培养基pH值、降低诱导温度、考察基因拷贝数因素等，期望提高SP产量和浓度。 同时，成功构建hSP胞内可溶表达载体pPIC3.5K-hSP，进行hSP胞内表达探索，期望在不存在分泌压力的情况下，SP蛋白表达量能提高。用间接cell-ELISA方法检测hS体外结合活性：复性hS和可溶hS蛋白都能特异的结合CTLA4阳性Raji细胞，而对CTLA4阴性ECV-304细胞结合值很低。说明复性hS和可溶hS蛋白具有特异性结合人CTLA-4抗原的能力。 综合比较原核E．coli和真核Pichia pastoris表达系统，对hS和hSP蛋白的表达和纯化而言，真核Pichiapastoris表达系统是更好的选择。本研究建立的原核大肠杆菌和真核毕赤酵母表达系统，为后续类似蛋白的表达提供了模式和借鉴。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一部分hS和hSP蛋白的大肠杆菌原核表达

第二部分hS及hSP蛋白真核毕赤酵母表达的分子构建

第三部分hS及hSP分子毕赤酵母表达株的获得

第四部分hS及hSP蛋白在毕赤酵母中的分泌表达与纯化

第五部分hS蛋白体外结合功能的初步测试

讨论：hS和hSP：E.coli系统?Pichiapastris系统?还是其它表达系统?

全文总结

参考文献

综述：基因工程单链抗体(scFv)的研究进展

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