一种检测与慢性阻塞性肺部疾病相关的SNP的PCR试剂盒

摘要

一种检测与慢性阻塞性肺部疾病相关的SNP的PCR试剂盒，其特征是由分离包装的引物smad7PA、引物smad7PB、无MgCl

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地涉及SMAD基因的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，缩写为SNP)及其与慢性阻塞性肺部疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，缩写为COPD)的相关性，涉及检测这些SNP的试剂盒。

背景技术

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是具有气流受限特征的疾病，且气流受限不完全可逆，可伴有气道高反应性，并呈进行性发展，与肺部对有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关。COPD患病率和病死率之高日益引起人们的重视，COPD居世界当前死亡原因的第4位，据推测，到2020年，全球范围内对社会造成危害最大的疾病中COPD将排至第5位。美国2001年将有288万人死于COPD，并且发病率不断呈上升趋势。我国COPD的发病率也呈上升趋势，近年来对我国北部及中部地区农村102230成年人群进行调查时发现，我国15岁以上人群的COPD发病率约为3.17％。每年约有100万人死于COPD。

COPD的诊断应根据病史、症状、体征、肺功能检查和影像检查综合分析确定，但存在不完全可逆性气流受限是诊断COPD的必备条件。目前常用的诊断方法包括：

(1)当患者有咳嗽、咯痰、呼吸困难症状和(或)有危险因素接触史时，应考虑COPD，但须经肺功能检查明确诊断。慢性咳嗽、咳痰常先于气流受限存在许多年，但不是所有有咳嗽、咳痰症状的患者均会发展为COPD，少数患者仅有不可逆性气流受限改变而无慢性咳嗽、咳痰症状。

(2)体征早期体征可不明显，随着病情进展可出现桶状胸，肺部叩诊过清音，听诊双肺呼吸音减弱，呼气时间延长，可闻及湿性啰音。

(3)肺功能检查肺功能检查对于COPD的诊断、病情严重程度评估、病情进展、治疗反应、预后判断均有重要的临床意义，是诊断COPD的金标准。吸入支气管扩张剂后，FEV小于80预计值，同时FEV/FVC小于70时，表明存在气流受限，并且不能完全逆转，可诊断为COPD。

(4)COPD的影像诊断口影像检查对确定肺部过度充气和并发症及与其它肺部疾病鉴别有重要意义。常规胸片征象主要表现为双肺纹理增多，当出现肺气肿时，肺透光度增加，横膈低平，肺门血管纹理呈残根状，肺野外围血管纤细，数目减少等。但常规胸片对肺气肿的早期诊断价值有限，其主要作用是用于确定肺部过度充气的程度及其与其它疾病的鉴别诊断。CT检查尤其是高分辨率CT(HRCT)是诊断肺气肿最敏感的影像学检查方法，对明确肺气种的类型、分布和严重程度均优于常规胸片。肺气肿的CT表现为无壁和壁很薄的肺组织透亮区，气肿腔与周围正常组织分界清楚。但受层厚和照射剂量的影响，CT(HRCT)不能用于对全肺的评估，对慢性支气管炎的诊断价值有限。

众所周知，COPD是遗传因素和环境因素共同作用的结果。遗传因素，现已证明的是α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)缺乏；环境危险因素，主要是吸烟因素。COPD患者中有85％为长期吸烟者，然而仅有10％～20％的人发展为有症状的COPD患者，说明个体对COPD的易感性不同，而这种易感性是基因多态性的表型。国内外学者对于COPD的易感性做了大量的研究，探讨了基因多态性在COPD发生及发展中的作用。

但是，还没有报道SMAD基因与慢性阻塞性肺疾病(COPD)之间的相关性报道的研究，更没有证实SMAD基因的单核苷酸多态性(SNP)与慢性阻塞性肺疾病(COPD)之间相关性的报道。

已经有研究表明：TGF-β1(转化生长因子-β1)在COPD疾病的发生发展中起到非常重要的作用。而TGF信号主要由Smad家族介导，TGF-β作为配体形成受体复合物，激活Smad进入核，共同激活或抑制它们调节的靶基因的转录。

在哺乳类中共发现了有8种不同的Smad蛋白，这些蛋白可分为3个不同的亚族：R-Smad(receptor-regulated Smads)；Co-Smad(common-partner Smads)和I-Smad(inhibitory Smads)。R-Smad亚族可以进一步分为两组：BMP-Smad和TGF-β/activin-Smad。Smad1、Smad5、Smad8是由BMP型受体(ALK22、ALK23和ALK26)和ALK21磷酸化；Smad2和Smad3是由TGF-β/activin型受体(ALK25和ALK24)和孤儿受体ALK27所活化。Co-Smad可以与所有磷酸化的R-Smad形成异聚复合体，所以它是TGF-β/activin和BMP信号转导通路上的共享成分。迄今为止，在哺乳类中只发现了一种Co-Smad，即Smad4。I-Smad，即Smad6、Smad7，通过阻断R-Smad与Co-Smad的激活而抑制TGF-B超家族的信号转导。Smad蛋白是由人类基因组编码的，编码Smad2、Smad4和Smad7的基因位于18q21-22；编码Smad3和Smad6的基因位于15q21-22；编码Smad5、Smad1和Smad8的基因分别位于15q31.4和13，如图1所示。

综上所述，为了最终实现治疗COPD疾病，本领域迫切需要寻找COPD疾病的易感基因，并由此开发出检测COPD疾病的试剂盒，以及相关的治疗药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种诊断(尤其是早期诊断)COPD疾病的试剂盒。

依据本发明的试剂盒，可以提供一种对个体的COPD疾病易感性进行诊断的方法，该方法为：

检测COPD病人的SMAD基因，并与正常人SMAD基因相比较，存在差异就表明该个体患COPD的可能性高于正常人群。

在本发明中所述SMAD基因的单核苷酸多态性(SNP)位于SMAD6基因上：

+30376G→T其中SNP的详细信息位于编号为SEQ ID 111中。

在本发明中，提供了一种检测样本中是否存在SMAD基因的单核酸多态性(SNP)的方法。包括步骤：

(1)利用我们自己设计的试剂盒扩增SMAD基因，得到PCR扩增产物。

(2)利用HPLC(高效液相色谱)技术检测扩增产物中是否存在单核苷酸多态性：

+30376G→T其中SNP的详细信息位于编号为SEQ ID 111中。

在本发明中，我们试剂盒中的引物、SNP位置信息位于编号为SEQ ID 111中。

本发明中，扩增产物大小为320bp，其中含有+30376G→T

本发明人经过深入而广泛的研究，对大量候选基因的SNP进行深入的研究。首次发现和证明了SMAD基因的部分SNP与COPD密切相关，而且发现它的新功能。SMAD基因的差异可能是COPD疾病发病的一个重要因素，其中SNP(+30376G/T)在病例和对照组中的基因分布具有显著性差异(p＜0.05)，因此可以作为检测COPD疾病的特异性的SNP，在此基础上我们完成了本发明。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种鉴定SMAD6基因外显子中SNP分子标记的方法，通过提取宿主细胞的基因组DNA，采用本发明提供的试剂盒进行PCR扩增，扩增目的基因，利用HPLC技术进行检测，发现SNP存在，利用DNA测序方法证实该SNP的存在以及存在的位置。其中PCR扩增的引物序列如序列表SEQ ID 111。

一种分离核酸，具有序列表SEQ ID 111所示的碱基序列，在第+30376位为G/T复等位基因的SNP标记(SEQ ID 111用  表示)。命名方法为：将SMAD基因翻译起始密码子ATG中，腺嘌呤A定义为1号位时，其下游序列中胸腺嘧啶T、鸟嘌呤G分别为2、3号位；同理，其上游序列依次为0、-1、-2......位，在中国COPD人群中，第+30376位为G/T多态性标记。SEQ ID 111所示的核苷酸序列为部分SMAD7基因外显子序列。此基因序列可以从Genbank中获得，原始基因组完整序列在Genbank中的编号为AC114684。

本领域的技术人员都清楚，有很多分析方法可以用于检测SMAD7基因外显子序列中是否存在单核酸多态性。这些技术包括：DNA测序、PCR-SSCP、PCR-HPLC等。

本发明特别地提供了一种使用方便、灵敏度高的检测上述SNP的检测试剂盒，它含有上面所述的PCR特异扩增引物和用于PCR扩增检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟知这些常规组件和检测方法。检测扩增产物与正常SMAD7基因序列是否存在突变的比对时，还需要HPLC所需要的一些常规试剂等。

具体来说，本发明提供了一种检测与慢性阻塞性肺部疾病相关的SNP的PCR试剂盒，其特征是由分离包装的引物smad7PA、引物smad7PB、无MgCl₂的缓冲液、DNA聚合酶、MgCl₂、脱氧核苷酸单位DNTP和水组成，其中，引物smad7PA、smad7PB的序列为：

    smad7PA  5-gtgtcttcat tctaggagtc-3

    smad7PB  5-cacccacacaccatccacct-3

各组份的用量比为：浓度为50μM的引物smad7PA和浓度为50μM的引物smad7PB各0.5μl；无MgCl₂的缓冲液2.5μl；浓度为5u/μl的DNA聚合酶0.25μl；浓度为2.5mM的脱氧核苷酸单位DNTP 2μl；水17.75μl。

由于利用本发明试剂盒所检测出的SNP与COPD具有非常高的关联性，因此不仅可以较为准确地诊断和治疗COPD疾病，而且可以使易感COPD疾病者在未发病之前就采取合理的预防措施(如适当改变生活环境、生活习惯等)，从而提高COPD易感者的生存期和生活质量，因此具有极其重大的应用价值和社会效益。

本发明的内容结合以下实施例作更进一步的说明，但本发明的内容不仅限于实施例中所涉及的内容。

附图说明

图1是SMAD基因的简单基因定位图以及结构图。

具体实施方式

本实施例中的试剂盒是针对一次PCR扩增制作的。

该试剂盒是由分离包装的引物smad7PA、引物smad7PB、无MgCl₂的缓冲液、DNA聚合酶、MgCl₂、脱氧核苷酸单位DNTP和水组成，其中，引物smad7PA、smad7PB的序列为：

     smad7PA  5-gtgtcttcat tctaggagtc-3

     smad7PB  5-cacccacacaccatccacct-3

各组份的用量为：浓度为50μM的引物smad7PA和浓度为50μM的引物smad7PB各0.5μl；无MgCl₂的缓冲液2.5μl；浓度为5u/μl的DNA聚合酶0.25μl；浓度为2.5mM的脱氧核苷酸单位DNTP 2μl；水17.75μl；DNA样本1.5μl。

为了进一步说明本实施例中所制作试剂盒的使用方法和使用效果，下面继续说明将上述试剂盒用于检测与慢性阻塞性肺部疾病相关的SNP时的具体过程及使用效果。

实验步骤：

1.DNA提取：按照常规的DNA提取方法进行DNA提取。

2.目的基因的PCR扩增(扩增体系为一个样本)：

采用上述试剂盒对目的基因进行PCR扩增。PCR扩增条件：

预变性：94℃  2min

变性    94℃  1min

退火    55℃  30s

延伸    72℃  50s

循环    35次

3.电泳检测扩增产物的有无。

利用普通的1.5％琼脂糖电泳检测PCR产物的有无以及扩增效率的高低，从而为下一步的HPLC检测SNP作准备。

4.采用HPLC技术检测COPD与正常人群样本

根据PCR扩增产物的量.使用恒温自动取样器将3μl～10μl的PCR产物打入柱内。用HP1100双体汞把0.1M ETAA、0.1mM EDTA和45％的乙腈(缓冲液B)泵入柱中，梯度增加缓冲液B的浓度(2％/分钟，大于5分钟)，使PCR片段从柱中洗脱出来，初始梯度条件根据片段的长度及组成成分而定，洗脱的DNA片段即可通过HP1100二极管阵列探测仪的紫外光吸收(260nm)作用探测到DHPLC实验结果的判断标准：完全匹配的同源双链除溶剂峰、引物峰和杂质峰外，在目标产物处应出现一个单峰，且峰的对称参数应接近于1.如峰数超过一个，或出现肩峰及不对称峰，则表明存在匹配的异源双链.异源双链将被测序以识别可能的多态性位点，即单核苷酸多态性(SNPs)。

5.利用测序进行SNP的证实

将HPLC中检测到的可能存在SNP的片段进行测序分析，结果我们发现了在SMAD6基因上的+30376G/T这个SNP，且经过统计学的计算此SNP与COPD息息相关。

在上述过程中，采用了市售的HPLC检测试剂盒进行检测，该检测试剂盒含有1M的TEAA(Triethylammonium acetate)缓冲液，用前于每500ml中加150mgEDTA及乙腈、超纯水(电阻为18.2MΩ)等，试剂均为色谱纯。

还需说明的是：我们采用上述试剂盒，首次通过PCR-HPLC技术，在中国人群200名COPD患者和200名年龄、性别匹配正常对照人群中发现在SMAD7第4外显子+30716区域存在G/T多态性SNP标记位点。通过DNA测序，证实了突变点的存在。

本发明所涉及的基因组序列表：

<210>1

<211>480

<212>DNA

<213>细菌(Mycobacterium sapiens)

<220>

<221>PCR Production_region

<222>(196)...(273)

<400>1

TGCACTGATC ACTGTTCCTG TACTTCTGTC TTACCGCCCC ATTACCCATC CATAGATCTG

ACTCTGGAAA CACCGATG

GCGCAGATTT GGAAACCATG AACACATGTG GCAGCCTTTC CCATAGCGGG GCCTGAGAGA  60

AGGGGTTTGG TGGTTGAATG AGTGTGGAAA GCCTGTATTG TGGCCTCTCC TCCAGCCCCC  120

ACTCAGGAGG GACTCACATG GCCACGCTCT GAGGAGCCTG CAGAAGGAGG CCTGTCTGAC  180

CCAGCCTTCC TCCCATGCAC TGATCACTGT TCCTGTACTT CTGTCTTACC GCCCCATTAC  240

CCATCCATAG ATCTGACTCT GGAAACACCG ATGAAGTTTG GCTGAAGTCA TGCCAGTGGA  300

TGGATTTAGT GGAGAGGCCG ACCCAGCTCA AGATGGAAAG ACAGCCAGAG ATGCGCTCGG  360

GTGGTGGGGG TTCCTTGGAG AAGGCTGAGG TCAGGGGGAT GATGGGGTCA CAGCAGCTCA  420

GAGGGGAGGC AAGCCCTGAA GGACAGTGGC TACAAGCGGG CCCTGCAGAG ATGCAAAATG  480