在三酰基甘油分子中具有改进的脂肪酸分布的向日葵油、种子和植物

摘要

本发明涉及一种由相对于总的脂肪酸含量，具有至少12％的硬脂酸的向日葵种子直接获得的向日葵油，其特征在于饱和脂肪酸在位置sn－1与sn－3之间的分布系数α为至少0.38；和一种由相对于总的脂肪酸含量，具有至少12％的硬脂酸的向日葵种子直接获得的向日葵油，其特征在于当油中油酸含量高于亚油酸含量时，饱和脂肪酸在位置sn－1与sn－3之间的分布系数α为至少0.28。本发明还涉及用于生产所述油的植物和种子以及所述油的用途。

说明书

发明目的

本发明的目的是由相对于总的脂肪酸含量，具有至少12％的硬脂酸的向日葵种子直接获得的向日葵油，并且与由野生型向日葵种子获得的油相比，所述向日葵油在三酰基甘油(TAG)分子的位置sn-1与sn-3之间具有改进的脂肪酸分布。本发明还涉及含有具有所述特征的内生油的向日葵植物和种子。本发明的另一个目的是提供一种生产所述向日葵植物的方法和所述向日葵油的用途。

背景技术

油和脂肪主要由甘油三酯形成，甘油三酯是由甘油骨架和与甘油的三个羟基酯化的三个脂肪酸形成的分子(Gunstone等，1994)。油的化学和物理以及营养特征由油的脂肪酸组成和所述脂肪酸在不同甘油三酯类物质中的分布决定。脂肪酸的三个立体化学位置命名为sn-1、sn-2和sn-3。油在特定的温度下为固体或者具有良好稳定性的事实与脂肪酸中双键的减少量有关。含油种子中发现的主要脂肪酸是具有18个碳原子和2个双键的亚油酸(18:2)和仅具有1个双键的油酸(18:1)，其使得这些油在室温下为液态。一些油，例如得自大豆和低芥酸菜子的油，还含有具有18个碳原子和3个双键的亚麻酸(18:3)。上述脂肪酸由于它们含有一个或多个双键因而是不饱和的。植物油还含有少量的不具有任何双键的饱和脂肪酸，例如具有16个碳的棕榈酸(16:0)、具有18个碳的硬脂酸(18:0)、具有20个碳的花生酸(20:0)和具有22个碳的山俞酸(22:0)。

依赖于甘油三酯分子中的脂肪酸和其位置，不饱和脂肪酸有益于健康并且饱和脂肪酸是无影响或有害健康的。另一方面，一些热带植物的油和动物脂肪含有短的和中等链长的饱和脂肪酸，例如具有12个碳的月桂酸(12:0)和肉豆蔻酸，后者是具有14个碳的饱和脂肪酸(14:0)并且对健康最为有害。棕榈酸和硬脂酸是温带植物油中发现的常见饱和脂肪酸(表1)。棕榈酸被认为对健康稍微有害，并且硬脂酸被认为是没有影响的。

但是，非常重要的是考虑取决于甘油三酯分子中的脂肪酸位置的第二种特征。饱和长链脂肪酸如果未键接到甘油的中间位置(sn-2)上则是较不有害的。在脂肪消化过程中，胰脂肪酶使在甘油的sn-1和sn-3位置上发现的脂肪酸水解。在中间位置上的脂肪酸在保持与甘油键接并形成具有净化(detergent)特征且被完全同化的单酸甘油酯的同时，从位置sn-1和sn-3释出的脂肪酸与钙或镁反应并产生含有所述金属的不溶性盐，使得肠内吸收非常困难。因此，将它们排泄出来。如表1中所示，除棕榈油以外，植物油的所有饱和脂肪酸均未位于位置sn-2上，因此它们并未不利地影响胆固醇含量，即使它们具有高的棕榈酸含量(例如，可可脂)或中等棕榈酸含量(例如，橄榄油)。

                        表1

               可食用脂肪和油的脂肪酸组成等1997；Chow 1992；Gunstone等1994)

  脂肪或油                                             脂肪酸组成(％)  ≤  12:0  14:0  16:0  16:1  18:0  18:1  18:2  反式  sn-2上，  饱和的  猪油  2  25  3  12  45  10  1  79  牛油  12  10  26  2  12  28  3  3  84  棕榈油  1  45  5  39  9  18  橄榄油  14  1  3  71  10  2  可可脂  26  35  35  3  4  向日葵油  7  5  30  57  1  向日葵  油，高油  酸  5  4  88  2  1

对于许多食品制剂而言，食品工业需要具有良好稳定性的软化或固体脂肪(例如，动物脂肪)。当然，面包、糕点、人造奶油和涂抹料(spread)需要固体脂肪，而油炸工业需要耐热氧化的液态油。在80年代，按照营养学专家的推荐和消费者的需求，食品工业从动物脂肪转向植物油。这些植物油并不具有用于所述食品制剂的适当特征；它们必须通过部分氢化和/或酯交换反应进行化学改性。氢化采用氢气和作为催化剂的重金属使不饱和脂肪酸的双键还原。在该方法的过程中，饱和脂肪酸增加，但同时人造脂肪酸顺式和反式异构体的数目也增加。尽管反式异构体是不饱和脂肪酸，但它们具有类似于饱和脂肪酸的物理特征。这些反式脂肪酸的主要问题在于：就胆固醇含量而言它们甚至比动物的饱和脂肪酸更差，并且它们包括一些主要的脂肪酸缺点或者与某些癌症，例如妇女乳腺癌有关。

化学酯交换导致甘油三酯分子内的所有脂肪酸重新分布；随后通过分馏可获得富含饱和甘油三酯的部分。通过该方法，使健康的植物油转化为在位置sn-2上具有许多饱和脂肪酸的不健康脂肪，例如猪油。这种油将增加低密度(差的)胆固醇。总之，用于使植物油化学改性的方法并不特别健康，其以使新的油较不健康的方式改变了所述油的特征。考虑到技术和营养数据，最佳的油应该是具有增加含量的硬脂酸作为饱和脂肪酸(优选通过sn-1和sn-3位置键接到甘油骨架上)和油酸或亚油酸作为不饱和脂肪酸(键接到三个sn位置上)的天然植物油。

在突变发生步骤之后，选择和确定多个向日葵脂肪酸突变系(Osorio等，1995)。一些上述突变株在种子油中具有高含量的饱和脂肪酸：具有至少26％的硬脂酸的CAS-3；具有至少中等含量的硬脂酸(12-16％)的CAS-4和CAS-8。对生化研究和进一步重组之后选择的上述材料和其它材料例如CAS-29、30和31进行广泛的种质采集(表2)。

                                   表2

选自Sunflower Collection of Instituto de la Grasa，CSIC，Seville，Spain的向日葵材料的脂肪酸组成

  油类型  系                            脂肪酸组成(％)  16:0  18:0  18:1  18:2  20:0  22:0  中18:0  CAS-4  5.9  11.9  27.8  53  0.6  0.7  高18:0  CAS-3  5.4  26.1  14.2  51.3  1.4  1.3  高18:0  CAS-14  8.4  37.3  12.4  37.9  2.2  1.8  高18:0  CAS-30  5.8  32.1  9.4  49.3  1.9  1.5  高18:0  CAS-29  6.7  31.9  21.2  36.2  1.8  2.2  高18:0  CAS-31  7.2  31.7  14.7  43.3  1.4  1.7  高18:0  CAS-15  5.2  26.3  57.8  7.2  1.2  1.9  高18:0  CAS-26  10.1  23.3  59.1  4.5  1.2  1.8  高18:0  CAS-24  7.2  24.5  60.6  4.4  1.4  1.9

突变株的遗传特征表明，改变的脂肪酸水平的遗传是配子体性的，并且通过在降低数量的位点上的等位基因来控制，这使得其易于以很少的回交循环到达目标近交系。所述突变性状的时间和空间表现的研究表明，仅在种子形成过程中表现出突变性状，所述性状很少受到生长温度的影响并且不在植物组织中表现。这些向日葵突变系不具有旁系负面影响，例如拟南芥属和低芥酸菜子高硬脂酸突变株中发现的影响。

植物甘油三酯通过甘油-3-P途径(Kennedy途径)生产。开始(图1)，发生sn-1和sn-2位置上的甘油3-磷酸酯与酰基辅酶A酯的酰化，分别用酶、甘油3-磷酸酯酰基转移酶(GPAT)和溶血磷脂酸(lysophosphatidate)酰基转移酶(LPAAT)生产磷脂酸酯(phosphatidate)。然后将磷脂酸酯用磷脂酸酯磷酸水解酶水解为甘油二酯，随后可用酰基辅酶A将甘油二酯进一步酰化以产生甘油三酯(用甘油二酯酰基转移酶催化的反应，DAGAT)。最后一种酶专门用于甘油三酯生物合成。所述酰基转移酶调节脂肪酸的立体化学分布。

在分析向日葵突变株甘油三酯组成的过程中，发现38种不同的分子类物质(Fernández-Moya等，2000)。但出乎意料的是，用高硬脂酸系列合成的甘油三酯在位置sn-1和sn-3上不具有如根据推测满足所有油的Vander Wal(1960)理论所预期的无规分布。造成上述不寻常分布的酶是酰基转移酶，所述酰基转移酶由酰基辅酶A集合(pool)和甘油-3-P合成甘油三酯。考虑到在植物体系中甘油三酯合成意味着没有饱和脂肪酸键接到甘油的sn-2位置上等，1997)，造成上述效果的特定酶应该是甘油-3P酰基转移酶和/或甘油二酯酰基转移酶。

在产生本发明的研究中，已开发出计算饱和脂肪酸在TAG sn-1和sn-3位置上的相对分布的数学系数，alpha S(αS)。αS的值为0(意思是其中一个位置上不存在任何饱和脂肪酸)-0.5(两个位置具有相同的饱和脂肪酸含量)。如果根据Vander Wal理论产生甘油三酯分布，则α＝0.5，并且不同的脂肪酸在甘油三酯中均匀分布。这在饱和脂肪酸分布在位置sn-1与sn-3之间的情况下是很重要的，因为如果在这些位置之一上存在较多的饱和脂肪酸，则α小于0.5，并且双饱和甘油三酯的量小于理论上所预期的。这恰好是本发明人在向日葵油，主要是硬脂酸高于12％的向日葵油中所发现的。当α＝0.5时，可获得有利于制备用于涂抹料、人造奶油、起酥油(shortening)、面包、糕点等的软化脂肪的双饱和甘油三酯的最大量，在甘油三酯分子的位置sn-1和sn-3上的饱和脂肪酸分布中所述α值越小，对于上述特定食品用途而言所述油越差。因此，对于特定用途而言，在TAG sn-1和sn-3位置上具有有利的饱和脂肪酸相对分布的突变向日葵可基于值α的计算进行选择。

在知道甘油三酯的总的饱和脂肪酸组成(S)、sn-2中的饱和脂肪酸组成(S₂)(所述两者可根据等(1997)计算)和甘油三酯分子类物质组成(其可根据Fernández-Moya等(2000)计算)的情况下可计算所述系数。

                          表3

在每个TAG位置上的饱和与不饱和脂肪酸的百分率

(S₁、S₂和S₃)与S、S₂和α的关系

S：总的饱和脂肪酸含量；S₂：sn-2饱和脂肪酸含量；α：sn-1与sn-3位置之间饱和脂肪酸的分布系数。

 饱和的(S) 不饱和的 (U)                            TAG位置  1  (3S-S₂)α    (S₁)  100-[(3S-S₂)α]  (U₁)  2  S₂  100-S₂  (U₂)  3  (3S-S₂)(1-α)  (S₃)  100-[(3S-S₂)(1-α)]  (U₃)

不同TAG亚类的百分率(三饱和的，SSS；双饱和的，SUS；单饱和的，SUU；和三不饱和的，UUU)通常使用下式计算：

SSS(％)＝S₁S₂S₃/10000                       (i)

SUS(％)＝(U₁S₂S₃+S₁U₂S₃+S₁S₂U₃)/10000       (ii)

SUU(％)＝(S₁U₂U₃+U₁S₂U₃+U₁U₂S₃)/1000        (iii)

UUU(％)＝U₁U₂U₃/10000                       (iv)

使用表3中针对S₁、S₂、S₃、U₁、U₂和U₃所给出的值，我们可通过以下推理计算不同TAG中的分布系数α的值：

a)根据三饱和TAG类物质(SSS)：

SSS(％)＝S₁S₂S₃/10000       (i)

将表3的S₁、S₂和S₃的值代入，我们得到：

S₁S₂S₃＝[(3S-S₂)α]×S₂×[(3S-S₂)(1-α)]＝

(3Sα-S₂α)×S₂×(3S-3Sα-S₂-S₂α)＝

(3SS₂α-S₂²α)×(3S-3Sα-S₂-S₂α)＝

9S²S₂α-9S²S₂α²-3SS₂²α+3SS₂²α²-3SS₂²α+3SS₂²α²+S₂³α-S₂³α²＝

(-9S²S₂+6SS₂²-S₂³)α²+(9S²S₂-6SS₂²+S³)α       (v)

在(i)内重排，

S₁S₂S₃-10000SSS(％)＝0

将等式(v)的S₁S₂S₃值代入，

(-9S²S₂+6SS₂²-S₂³)α²+(9S²S₂-6SS₂²+S₂³)α-10000SSS(％)＝0，

α值作为二次方程(ax²+bx+c＝0)计算，由于a＝-b，所述方程可进行简化，

$>>\alpha >=>>>->b>\pm >>>b>2>>->4>ac>>>>2>a>\; >=>>>->b>>>2>a>\; >\pm >>>>b>2>>->4>ac>>>2>a>\; >=>0.5>\pm >>>>a>2>>->4>ac>>>2>a>\; >$>

其中a＝-9S²S₂+6SS₂²-S₂³，b＝9S²S₂-6SS₂²+S₂³且c＝10000SSS(％)，SSS(％)为种子/油中的三饱和TAG的总量。

b)根据双饱和TAG类物质(SUS)：

SUS(％)＝(U₁S₂S₃+S₁U₂S₃+S₁S₂U₃)/10000    (ii)

将表3的S₁、S₂、S₃、U₁、U₂和U₃的值代入，我们得到：

U₁S₂S₃＝[100-(3S-S₂)α]×S₂×[(3S-S₂)(1-α)]＝

300SS₂-300SS₂α-100S₂²+100S₂²α-9S²S₂α+9S²S₂α²+3SS₂²α-

3SS₂²α²+3SS₂²α-3SS₂²α²-S₂³α+S₂³α²    (vi)

S₁U₂S₃＝(3S-S₂)α×(100-S₂)×[(3S-S₂)(1-α)]＝

900S²α-300SS₂α-9S²S₂α+3SS₂²α-900S²α²+300SS₂α²+9S²S₂α²-

3SS₂²α²-300SS₂α+100S₂²α+3SS₂²α-S₂³α+300SS₂α²-100S₂²α²-

3SS₂²α²+S₂³α²     (vii)

S₁S₂U₃＝[(3S-S₂)α]×S₂×[100-(3S-S₂)(1-α)]＝

300SS₂α-9S²S₂α+9S²S₂α²+3SS₂²α-3SS₂²α²-100S₂²α+

3SS₂²α-3SS₂²α²-S₂³α+S₂³α²   (viii)

在(ii)内重排，

(U₁S₂S₃+S₁U₂S₃+S₁S₂U₃)-10000SUS(％)＝0

分别将等式(vi)、(vii)和(viii)的U₁S₂S₃、S₁U₂S₃和S₁S₂U₃值代入，并且以α为函数分组：

(600SS₂-18SS₂²+27S²S₂-900S²-100S₂²+3S₂³)α²+(-600SS₂+

18SS₂²-27S²S₂+900S²+100S₂²-3S₂³)α+300SS₂-100S₂²-

              10000SUS(％)＝0

α值作为二次方程计算，由于a＝-b，所述方程可进行简化，

$>>\alpha >=>>>->b>\pm >>>b>2>>->4>ac>>>>2>a>\; >=>>>->b>>>2>a>\; >\pm >>>>b>2>>->4>ac>>>2>a>\; >=>0.5>\pm >>>>a>2>>->4>ac>>>2>a>\; >$>

其中a＝600SS₂-18SS₂²+27S²S₂-900S²-100S₂²+3S₂³且c＝300SS₂-100S₂²-10000SUS(％)，SUS(％)为种子/油中的双饱和TAG的总量。

c)根据单饱和TAG类物质(SUU)：

SUU(％)＝(S₁U₂U₃+U₁S₂U₃+U₁U₂S₃)/10000       (iii)

将表3的S₁、S₂、S₃、U₁、U₂和U₃的值代入，我们得到：

S₁U₂U₃＝30000Sα-900S²α+900S²α²+300SS₂α-300SS₂α²-

10000S₂α+300SS₂α-300SS₂α²-100S₂²α+100S₂²α²-300SS₂α+

9S²S₂α-9S²S₂α²-3SS₂²α+3SS₂²α2+100S₂²α-3SS₂²α+3SS₂²α²

         +S₂³α-S₂³α²     (ix)

U₁S₂U₃＝10000S₂-300SS₂+300SS₂α+100S₂²-100S₂²α-300SS₂α+

9S²S₂α-9S²S₂α²-3SS₂²α+3SS₂²α²+100S₂²α-3SS₂²α+3SS₂²α²+S₂³α

-S₂³α²      (x)

U₁U₂S₃＝30000S-10000S₂-30000Sα+10000S₂α-

300SS₂+100S₂²+300SS₂α-100S₂²α-900S₂α+300SS₂α+

900S²α²-300SS₂α²+9S²S₂α-3SS₂²α-9S²S₂α²+3SS₂²α²+

300SS₂α-100S₂²α-300SS₂α²+100S₂²α²-3SS₂²α+S₂³α+

3SS₂²α²-S₂³α²            (xi)

在(iii)内重排，

(S₁U₂U₃+U₁S₂U₃+U₁U₂S₃)-10000SUU(％)＝0

分别将等式(ix)、(x)和(xi)的S₁U₂U₃、U₁S₂U₃和U₁U₂S₃值代入，并且以α为函数分组：

(-1200SS₂+18SS₂²-27S²S₂+1800S²+200S₂²-3S₂³)α²+

(1200SS₂-18SS₂²+27S²S₂-1800S²-200S₂²+3S₂³)α-

     600SS₂+200S₂²+30000S-10000SUU(％)＝0

α值作为二次方程计算，由于a＝-b，所述方程可进行简化，

$>>\alpha >=>>>->b>\pm >>>b>2>>->4>ac>>>>2>a>\; >=>>>->b>>>2>a>\; >\pm >>>>b>2>>->4>ac>>>2>a>\; >=>0.5>\pm >>>>a>2>>->4>ac>>>2>a>\; >$>

其中a＝-1200SS₂+18SS₂²-27S²S₂+1800S²+200S₂²-3S₂³且

c＝-600SS₂+200S₂²+30000S-10000SUU(％)，SUU(％)为种子/油中的单饱和TAG的总量。

d)根据三不饱和TAG类物质(UUU)：

UUU(％)＝U₁U₂U₃/10000   (iv)

将表3的U₁、U₂和U₃的值代入，我们得到：

U₁U₂U₃＝(600SS₂-6SS₂²+9S²S₂-900S²-100S₂²+S₂³)α²+

(-600SS₂+6SS₂²-9S²S₂+900S²+100S₂²-S₂³)α

+300SS₂-100S₂²-30000S+1000000   (xii)

在(iv)内重排，

          U₁U₂U₃-10000UUU(％)＝0

将等式(xii)的U₁U₂U₃值代入，并且以α为函数分组：

(600SS₂-6SS₂²+9S²S₂-900S²-100S₂²+S₂³)α²+(-600SS₂+

6SS₂²-9S²S₂+900S²+100S₂²-S₂³)α+300SS₂-100S₂²-

      30000S+1000000-10000UUU(％)＝0

α值作为二次方程计算，由于a＝-b，所述方程可进行简化，

$>>\alpha >=>>>->b>\pm >>>b>2>>->4>ac>>>>2>a>\; >=>>>->b>>>2>a>\; >\pm >>>>b>2>>->4>ac>>>2>a>\; >=>0.5>\pm >>>>a>2>>->4>ac>>>2>a>\; >$>

其中a＝600SS₂-6SS₂²+9S²S₂-900S²-100S₂²+S₂³，且c＝

300SS₂-100S₂²-30000S+1000000-10000UUU(％)，UUU(％)为种子/油中的三不饱和TAG的总量。

在TAG类物质通过GLC的测定中为了避免由实验误差产生的偏离，我们将αS定义为由SSS计算的α值(αSSS)、由SUS计算的α值(αSUS)、由SUU计算的α值(αSUU)和由UUU计算的α值(αUUU)的加权平均值。

$>>\alpha S>=>>>>(>\alpha SSS>\times >SSS>>(>\%>)>>+>>(>\alpha SUS>\times >SUS>>(>\%>)>>)>>)>>+>>(>\alpha SUU>\times >SUU>>(>\%>)>>)>>+>>(>\alpha UUU>\times >UUU>>(>\%>)>>)>>>>(>SSS>>(>\%>)>>+>SUS>>(>\%>)>>+>SUU>>(>\%>)>>+>UUU>>(>\%>)>>)>\; >$>

在饱和脂肪酸在甘油三酯分子的位置sn-1与sn-3之间的无规分布中，每种饱和脂肪酸的50％应该在每个位置上，最佳的是具有最多的SUS甘油三酯分子，分别地，S是饱和脂肪酸且U为不饱和脂肪酸。图2表示如果sn-1与sn-3之间发生无规分布，则随着饱和脂肪酸含量的提高，向日葵油中不同TAG类物质的比例。使用sn-2位置上的向日葵饱和脂肪酸的含量等，1997)并且提高公式(i)、(ii)、(iii)和(iv)中总的饱和脂肪酸含量的值，将0.5代入α产生所述曲线。

油的α系数还可通过化学分析TAG分子的三个sn位置上的脂肪酸组成来计算。所述分析可根据Laakso和Christie(1990)或Takagi和Ando(1991)提议的方法进行。这些方法使得可以知晓三个sn位置上的脂肪酸含量，但是需要大尺寸的样品而不适用于小样品，例如我们方法中的半个种子。在这种情况下公式如下，αS为所述两个值中的最小值，除了当两者均为0.5时。在这种情况下，α＝0.5。

本发明人已研究了在实际的向日葵油中在TAG中的这种分布。如所预期的，数据显示在标准(normal)和高饱和的向日葵油中饱和脂肪酸(S)主要位于甘油分子的位置sn-1和sn-3上并且很少量位于sn-2上。如所预期的和根据等的数据(1997)，在该位置上的主要脂肪酸是油酸和亚油酸。但是，酰基并未根据1，3-无规、2-无规的理论(Vander Wal，1960)分布。饱和脂肪酸(棕榈酸和硬脂酸)并未均匀分布。这些结果与前述数据(Reske等，1997)相一致，所述数据显示主要在相对于具有4.8％硬脂酸的商品向日葵而言硬脂酸含量提高(11％)时，饱和脂肪酸的位置sn-3优先于位置sn-1。硬脂酸含量和油酸/亚油酸比率(从高油酸至高亚油酸)不同的向日葵油的TAG分布列于图3。已发现，基于应用1，3-无规、2-无规理论所观察的位置sn-2上的组成和总的脂肪酸含量，对于不同饱和脂肪酸含量而言所预期的向日葵TAG类物质组(SSS、SUS、SUU和UUU)的理论值不同于被分析的种子中所发现的TAG组成。TAG组成已通过GLC和通过不饱和度分组的所述TAG类物质的数据(Fernández-Moya等，2000)测定。

如图3所示，向日葵饱和脂肪酸在TAG中呈不对称分布，获得的SUU的值总是高于所预期的值，并且SUS和UUU的值低于由位置sn-1和sn-3上的非特定分布所预期的值。

这些结果也与前述在含有两分子亚油酸和一个饱和脂肪酸的高硬脂酸向日葵突变TAG类物质的情况下的结果一致，所述突变TAG类物质比由1，3-无规2-无规理论(Fernández-Moya等，2000)所预期的更丰富。SUU的增加和UUU TAG类物质的减少与油中总的硬脂酸含量直接相关。

已计算了在对照和高硬脂酸突变系中的位置sn-1与sn-3之间饱和脂肪酸的分布系数(α)(表4)。该系数在亚油酸含量高于油酸含量时总是在0.19-0.37之间，并且在油酸含量高于亚油酸含量时总是在0.15-0.27之间。

                        表4

列出了硬脂酸含量(18:0)、总的饱和脂肪酸含量(S)、不同的TAG组(SUS、SUU和UUU)和在多个向日葵的标准和突变系中分布系数α的值。RHA-274购自USDA-ARS，Northerm Crop Science Lab，Fargo，ND。其它系购自Sunflower Collection of Instituto de la Grasa，CSIC，Seville，Spain。各系中不同脂肪酸的含量表示为：HS，高硬脂酸含量；MS，中硬脂酸含量；HL，高亚油酸含量；和HO，高油酸含量。

  系  类型  18:0  S  SUS  SUU  UUU  α  RHA-274  标准  5  11.7  2.9  29.5  67.7  0.31  CAS-3  HSHL  25.6  37  28.6  48.9  21.6  0.33  CAS-29  HSHL  33.2  42  28.9  55.8  14.7  0.37  CAS-4  MSHL  12.9  20.3  8.3  44.5  47.3  0.29  G-8  HO  4.9  9.4  1.1  22.7  76.2  0.19  CAS-15  HSHO  23.4  33.5  19.3  61.9  18.8  0.23  DG-9  MSHO  19.1  29.8  16.8  55.6  27.5  0.27

因此仍存在对具有高于0.38的分布系数的向日葵油的需要。

发明概述

本发明的目的是提供由相对于总的脂肪酸含量，具有至少12％，优选至少20％的硬脂酸的向日葵种子直接获得的向日葵油，并且在所述油中饱和脂肪酸在TAG分子的位置sn-1与sn-3之间的分布系数α为至少0.38，优选至少0.42，且最优选0.46。

当在油中油酸含量高于亚油酸含量且相对于总的脂肪酸含量，硬脂酸含量为至少12％，优选至少20％时，饱和脂肪酸在TAG分子的位置sn-1与sn-3之间的分布系数α为至少0.28，优选0.32，最优选0.36。

本发明另外涉及向日葵植物和由所述向日葵植物生产的向日葵种子，所述向日葵植物形成了含有由所述向日葵种子获得的具有上述特征的内生油的种子。

本发明的另一个目的是提供一种生产植物的方法，所述植物形成种子，所述种子含有相对于总的脂肪酸含量，具有至少12％的硬脂酸并且其中当油酸含量高于亚油酸含量时，饱和脂肪酸在位置sn-1与sn-3之间的分布系数α为至少0.38或0.28的内生油。

本发明的另一个目的是提供杂种植物及其后代，所述杂种植物及其后代在位置sn-1与sn-3之间具有上述饱和脂肪酸分布和其它所需特征。

发明详述

因此，本发明涉及一种由相对于总的脂肪酸含量，具有至少12％的硬脂酸的向日葵种子直接获得的向日葵油，其特征在于饱和脂肪酸在位置sn-1与sn-3之间的分布系数α为至少0.38，所述种子可通过包括如下步骤的方法获得：

a)提供含有相对于油中总的脂肪酸含量，硬脂酸含量为至少12％的油的种子；

b)提供含有分布系数α高于0.38的油的种子；

c)将得自步骤a)和b)中提供的种子的植物杂交；

d)收获F1种子后代；

e)种植F1后代种子以培育植物；

f)使如此培育的植物自体受粉以生产F2种子；

g)测试出存在硬脂酸含量为至少12％且分布系数α为至少0.38的种子；

h)种植具有所需水平的硬脂酸含量和分布系数α的种子以培育植物；

i)使如此培育的植物自体受粉以生产F3种子；和

j)非必要地重复步骤g)、h)和i)直至所需水平的硬脂酸含量和分布系数α被固定。

饱和脂肪酸在位置sn-1与sn-3之间的分布系数α优选为至少0.42，更优选至少0.46。

本发明另外涉及一种由相对于总的脂肪酸含量，具有至少12％的硬脂酸的向日葵种子直接获得的向日葵油，其特征在于当油中油酸含量高于亚油酸含量时，饱和脂肪酸在位置sn-1与sn-3之间的分布系数α为至少0.28，所述种子可通过包括如下步骤的方法获得：

a)提供种子，所述种子含有相对于油中总的脂肪酸含量，硬脂酸含量为至少12％并且其中油酸含量高于亚油酸含量的油；

b)提供含有在油中分布系数α高于0.38的油的种子；

c)培育得自步骤a)和b)中提供的种子的植物并将它们杂交；

d)收获F1种子后代；

e)种植F1后代种子以培育植物；

f)使如此培育的植物自体受粉以生产F2种子；

g)测试出存在硬脂酸含量为至少12％、油酸含量高于亚油酸含量且分布系数α为至少0.28的种子；

h)种植具有所需水平的硬脂酸、油酸和亚油酸含量和分布系数α的种子以培育植物；

i)使如此培育的植物自体受粉以生产F3种子；和

j)非必要地重复步骤g)、h)和i)直至所需水平的硬脂酸、油酸和亚油酸含量和分布系数α被固定。

优选饱和脂肪酸在位置sn-1与sn-3之间的分布系数α为至少0.32，更优选至少0.36。

本发明还涉及向日葵植物和由所述植物生产的种子，所述向日葵植物形成含有如上定义的内生油的种子。

另外，本发明涉及一种生产植物的方法，所述植物形成种子，所述种子含有相对于总的脂肪酸含量，具有至少12％的硬脂酸并且其中饱和脂肪酸在位置sn-1与sn-3之间的分布系数α为至少0.38的内生油，该方法包括：

a)提供含有相对于油中总的脂肪酸含量，硬脂酸含量为至少12％的油的种子；

b)提供含有分布系数α高于0.38的油的种子；

c)培育得自步骤a)和b)中提供的种子的植物并将它们杂交；

d)收获F1种子后代；

e)种植F1后代种子以培育植物；

f)使如此培育的植物自体受粉以生产F2种子；

g)测试出存在硬脂酸含量为至少12％且分布系数α为至少0.38的种子；

h)种植具有所需水平的硬脂酸含量和分布系数α的种子以培育植物；

i)使如此培育的植物自体受粉以生产F3种子；和

j)非必要地重复步骤g)、h)和i)直至所需水平的硬脂酸含量和分布系数α被固定。

含有具有至少12％的硬脂酸的油的种子通过如下步骤提供：

a)采用诱变剂，特别是叠氮化钠或烷基化剂，更特别是甲磺酸乙酯处理硬脂酸含量少于12％的向日葵种子；

b)由此生产植物，使所述植物授粉以生产种子；

c)测试出具有所需硬脂酸含量的种子；

d)非必要地重复步骤b)和c)。

含有其中饱和脂肪酸在位置sn-1与sn-3之间的分布系数α为至少0.38的油的种子通过如下步骤提供：

a)采用诱变剂，特别是叠氮化钠或烷基化剂，更特别是甲磺酸乙酯处理分布系数α值小于0.38的向日葵种子；

b)由此生产植物，使所述植物授粉以生产种子；

c)测试出具有所需分布系数α值的种子；

d)非必要地重复步骤b)和c)。

在一个可选的实施方案中，本发明涉及一种生产植物的方法，所述植物形成种子，所述种子含有相对于总的脂肪酸含量，具有至少12％的硬脂酸和其中油酸含量高于亚油酸含量并且其中饱和脂肪酸在位置sn-1与sn-3之间的分布系数α为至少0.28的内生油，该方法包括：

a)提供种子，所述种子含有相对于油中总的脂肪酸含量，硬脂酸含量为至少12％并且其中油酸含量高于亚油酸含量的油；

b)提供含有在油中分布系数α高于0.28的油的种子；

c)将得自步骤a)和b)中提供的种子的植物杂交；

d)收获F1种子后代；

e)种植F1后代种子以培育植物；

f)使如此培育的植物自体受粉以生产F2种子；

g)测试出存在硬脂酸含量为至少12％、油酸含量高于亚油酸含量且分布系数α为至少0.28的种子；

h)种植具有所需水平的硬脂酸、油酸和亚油酸含量和分布系数α的种子以培育植物；

i)使如此培育的植物自体受粉以生产F3种子；和

j)非必要地重复步骤g)、h)和i)直至所需水平的硬脂酸、油酸和亚油酸含量和分布系数α被固定。

含有具有至少12％的硬脂酸的油的种子通过如下步骤提供：

a)采用诱变剂，特别是叠氮化钠或烷基化剂，更特别是甲磺酸乙酯处理硬脂酸含量少于12％的向日葵种子；

b)由此生产植物，使所述植物授粉以生产种子；

c)测试出具有所需硬脂酸含量的种子；

d)提供含有其中油酸含量高于亚油酸含量的油的种子；

e)使得自步骤c)中测试的种子和得自步骤d)中提供的种子的植物杂交；

f)收获F1种子后代；

g)使如此培育的植物自体受粉以生产F2种子；

h)测试出存在硬脂酸含量为至少12％和油酸含量高于亚油酸含量的种子；

i)种植具有所需水平的硬脂酸、油酸和亚油酸含量的种子；

j)使如此培育的植物自体受粉以生产F3种子；和

k)非必要地重复步骤h)、i)和j)直至所需要水平的硬脂酸、油酸和亚油酸含量被固定。

含有其中饱和脂肪酸在位置sn-1与sn-3之间的分布系数α为至少0.38的油的种子通过如下步骤提供：

a)采用诱变剂，特别是叠氮化钠或烷基化剂，更特别是甲磺酸乙酯处理分布系数α值小于0.38的向日葵种子；

b)由此生产植物，使所述植物授粉以生产种子；

c)测试出具有所需分布系数α值的种子；

d)非必要地重复步骤b)和c)。

本发明另外涉及杂种植物和杂种植物的后代，所述杂种植物可通过将由上述方法获得的第一亲本植物和具有所需特征的第二亲本植物杂交获得。该第二亲本植物还可以是由上述方法获得的植物。

本发明还涉及所述油在生产食品中的用途和采用所述油制备或含有所述油的食品。

更具体地说，本发明涉及一种新型向日葵突变株，所述向日葵突变株具有比先前的向日葵系更好的α分布。因此，对于生产人造奶油、涂抹料等而言所述突变株具有比目前可获得的系更好的特性(图3)。人造奶油用最好的甘油三酯是饱和-不饱和-饱和类型(SUS)，优选饱和-油酸-饱和(SOS)类型的甘油三酯。

通过技术方法获得的上述新型突变系(称作CAS-36)已保藏在ATCC并且已给出保藏登记号为PTA-5041。根据无规理论，所述突变株具有最佳的TAG分布。得自一些CAS-36植物种子的样品的油的数据列于表5中。

                            表5

列出了一些CAS-36突变株植物中的硬脂酸含量、总的饱和脂肪酸含量(S)、油酸/亚油酸比率(O/L)、不同的TAG组和分布系数α的值。

  植物  18:0  S  O/L               TAG组  α  SUS  SUU  UUU  CAS-36-A  28.5  37.7  0.95  32.4  41.8  23.7  0.5  CAS-36-B  28.4  38.8  0.15  35.1  46.2  18.7  0.5  CAS-36-D  31.2  39.7  0.93  35.8  44.8  18.4  0.5  CAS-36-E  38.2  47.7  0.06  49.3  44.7  6.1  0.45

在US专利6,475,548中，存在对采用WO 95/20313的未处理油制备的对比涂抹料产品和采用WO 95/20313的油的硬脂精馏分制备的人造奶油的比较。采用硬脂精馏分制备的涂抹料在接近冰箱温度的温度下明显产生良好的可涂抹性、在嘴中适当的熔融性和稳定性。所述混合脂油的性能明显产生与已知高品质脂肪组合物类似的性能，而不存在非天然组分，例如氢化脂。

众所周知脂肪的硬脂精馏分可用在涂抹料的脂肪相中以解决制备涂抹料中的问题。例如在US专利4,438,149中，涂抹料采用含有少于70％的牛乳脂的脂肪相制备。所述产品在稠度方面太软。但是当使用脂肪的硬脂精馏分时，可制备较便宜且更宜涂抹的产品。US专利6,475,548教导了一种制备适于构成液态植物油或涂抹料的甘油三酯脂肪的方法。甘油三酯脂肪的制备方法采用具有至少12wt％的硬脂酸残余物和至少40wt％的油酸残余物的高硬脂酸高油酸向日葵油(HSHOSF)，上述向日葵油进行湿式分馏或干式分馏并收集硬脂精馏分。另外上述专利教导了通过将起始的HSHOSF油暴露于标准分馏(湿式或干式分馏)条件下可获得混合脂油的硬脂精馏分。应该收集含有＞30wt％的SUS和＜40wt％的SUU甘油三酯的馏分并且当最初25wt％的固体脂肪结晶时停止分馏。

在采用高硬脂酸高油酸向日葵油(HSHOSF)通过湿式分馏或干式分馏，然后收集硬脂精馏分来制备甘油三酯脂肪的方法中也可采用本发明。更具体地说，采用相对于总的脂肪酸含量，具有至少12％的硬脂酸的高硬脂酸高油酸向日葵油(HSHOSF)进行湿式分馏或干式分馏，然后收集硬脂精馏分来制备甘油三酯脂肪，所述向日葵油的特征在于饱和脂肪酸在位置sn-1与sn-3之间的分布系数α为至少0.28。

附图简述

图1表示甘油三酯的生物合成途径。

图2表示当α系数值为0.5时，就提高饱和脂肪酸含量而言的向日葵TAG类物质分布的理论分布。参见对于TAG命名的图例。

图3表示对于高油酸和高硬脂酸特征而言分离的种子中甘油三酯(TAG)相对饱和脂肪酸含量的分布。理论分布(作为对照)表示为线，而不同的油样品的分布表示为符号，参见对于TAG命名的图例。

本发明将在实施例中进一步解释说明，所述实施例描述如下并且并不意指限制本发明。

实施例

介绍

本发明涉及一种制备向日葵种子的方法，与野生型种子相比，所述向日葵种子在不同的甘油三酯分子类物质中具有更好的饱和脂肪酸分布。所述方法包括如下步骤：在一定的时间过程中和在足以在甘油三酯生物合成中所涉及的基因性状中诱导一种或多种突变的浓度下采用诱变剂处理亲本种子。这导致增加了SUS类型的甘油三酯类物质的产量并且降低了SUU的含量。所述诱变剂包括诸如叠氮化钠或烷基化剂的试剂，例如甲磺酸乙酯，但也可以使用具有相同或类似作用的任何其它诱变剂。经处理的种子将含有可遗传的基因变化。

然后使这些变异的种子发芽并由此研发出后代植物。为了改进所述系的性状，可将后代杂交或自花授精。收集并分析后代种子。然后将具有接近无规或无规甘油三酯性状的种子与任何其它系杂交，而且性状传递。非必要地，可存在另外的发芽、栽培和自花授精周期(以固定各系中性状的纯合性)和种子的杂交和收集周期。

在实施例1中使用甲磺酸乙酯作为诱变剂。已获得α值高于0.4的向日葵系。被诱变的最初向日葵亲本系是CAS-10(SunflowerCollection of Instituto de la Grasa，CSIC，Seville，Spain)。所述系的油具有的α值小于0.38。本文所使用的高油酸材料衍生自俄国人研究的油酸系(Soldatov，1976)，所述高油酸材料具有的α值为0.15-0.27。

所用的高油酸高硬脂酸材料衍生自高油酸系与以ATCC保藏登记号75968保藏的突变株CAS-3的杂交种，并且选作如WO-0074470“高油酸高硬脂酸植物、种子和油”中所述的高油酸高硬脂酸种子。在以下实施例中已描述了亚油酸多于油酸和油酸多于亚油酸的高α值植物的制备方法。

实施例1

采用70mM的甲磺酸乙酯(EMS)在水中的溶液使种子诱变。该处理在振荡(60rpm)的同时在室温下进行2小时。诱变之后，将EMS溶液废弃并且将种子在自来水下洗涤16小时。

使经处理的种子在田里发芽并使植物自体受粉。使用从这些植物收集的种子来选择甘油三酯分布改进的新型向日葵系。种子脂肪酸组成通过使用Garcés，R.和Mancha，M.的方法(1993)和甘油三酯组成通过使用Fernández-Moya等的方法(2000)通过气液色谱法测定。

选择具有α值为0.42的第一植物。栽培五代后代，其中α值提高并且新的遗传性状稳定地固定在种子的遗传物质中。该系称作CAS-36，并且其具有高于油酸含量的亚油酸含量。该系的最小和最大α值分别为0.38和0.5。

表6表示来自多种CAS-36植物的种子的一些分析数据和根据建议的公式计算α值的必要数据。

                         表6

对于一些CAS-36油而言，TAG的脂肪酸、总的饱和脂肪酸(S)和sn-2位置上的饱和脂肪酸(S2)组成和TAG组成和根据公式计算的α饱和。

  CAS-36  植物                                 脂肪酸(mol％)                 TAG(mol％)  系  16:0  18:0  18:1  18:2  20:0  22:0  S  S₂  SSS  SUS  SUU  UUU  α饱和  BU-59  8.32  28.49  30.42  31.9  0.88  0  37.69  4.16  2.17  32.38  41.79  23.66  0.5  CB-71  6.09  28.94  28.14  34.57  1.3  0.96  37.29  4.12  0.85  32.61  44.1  22.44  0.5  CB-88  6.3  25.03  41.5  25.73  0.9  0.54  32.77  3.65  0  24.41  49.47  26.12  0.45  CB-79  7.63  23.88  32.15  34.02  1.3  1.01  33.83  3.76  0  26.1  49.28  24.62  0.46

实施例2

由高油酸高硬脂酸系(例如，表2中所示系)的向日葵种子培育向日葵植物。还由CAS-36的向日葵种子培育向日葵植物。使两系杂交。使植物借助于人工授粉以便确保存在充足的种子产量。在高油酸高硬脂酸系上生产F1种子，或反之亦然，并且进行收获。选择α值大于0.28、高硬脂酸和油酸多于亚油酸的F2种子。尽管这样产生了本发明的油，但限制了生产量。因此，需要表现出具有上述α值的种子的固定近交系。

然后可将这些纯合的固定近交的高油酸高硬脂酸系杂交以形成杂种种子，所述杂种种子将生产出表现出本发明所需油的性状的F2种子。为此目的，种植F1种子，并且在隔离的条件下使生产的植物自花授精并且生产F2种子。测定F2种子的α值。将表现出所需性状的种子的残余部分用于培育植物以形成F3种子。重复自花授精、筛选和选择过程以研发α值高于0.28的固定纯合系，所有的固定纯合系具有的α值为0.5或接近0.5。

一旦固定了性状，可将类似的高油酸系杂交以形成具有如表7中所示性状的杂种种子。根据本发明，通过生物工艺方法已获得从中可提取所述油的向日葵植物和种子。α值含量是可遗传的性状并且与培育条件完全无关。

                        表7

列出了在衍生自CAS-36突变系和CAS-15或CAS-24(表2)高硬脂酸系的杂交种的系中硬脂酸(18:0)、总的饱和脂肪酸含量(S)、油酸/亚油酸比率(O/L)、不同的TAG组和分布系数α的值。油酸与亚油酸含量的比率表示为O/L，在所选择的系中，由于油酸含量高于亚油酸含量，所以其＞1。

  向日葵系  18:0  S  O/L  SUS  SUU  UUU  α饱和  HO1  33.5  45.8  2.48  47.5  42.3  10.2  0.49  HO2  25.4  35  1.45  28.5  47.8  23.6  0.5  HO3  22.8  33.8  1.05  26.7  47.8  25.5  0.5  HO4  20.2  28.2  10.91  18.8  47  34.2  0.5  HO5  29.8  38.9  1.48  36.4  44  19.6  0.5  HO6  40.8  51  1.7  54.3  38.6  5.1  0.47  HO7  31  42.3  6.19  37.8  51.3  10.9  0.41  HO8  28.6  36.6  1.8  27.8  54.2  18  0.35

实施例3

由高亚油酸高硬脂酸系(例如，表2中所示的CAS-3、CAS-30或任何其它高亚油酸高硬脂酸系)的向日葵种子培育向日葵植物。还由CAS-36的向日葵种子培育向日葵植物。使两系杂交。使植物借助于人工授粉以便确保存在充足的种子产量。在高亚油酸高硬脂酸系上生产F1种子，或反之亦然，并且进行收获。选择α值大于0.38、高硬脂酸含量和亚油酸多于油酸的F2种子。

尽管这样产生了本发明的油，但限制了生产量。因此，需要表现出具有上述α值的种子的固定近交系。然后可将这些纯合的固定近交的高亚油酸高硬脂酸系杂交以形成杂种种子，所述杂种种子将生产出表现出本发明所需油的性状的F2种子。为此目的，种植F1种子，并且在隔离的条件下使生产的植物自花授精并且生产F2种子。测定F2种子的α值。

将表现出所需性状的种子的残余部分用于培育植物以形成F3种子。重复自花授精、筛选和选择过程以研发具有高亚油酸高硬脂酸含量和α值高于0.38的固定纯合系，所有的固定纯合系具有的α值为0.5或接近0.5。一旦固定了性状，可将类似的高亚油酸高硬脂酸系杂交以形成具有如表8中所示性状的杂种种子。根据本发明，通过生物工艺方法已获得从中可提取所述油的向日葵植物和种子。α值含量是可遗传的性状并且与培育条件完全无关。

                        表8

列出了在衍生自CAS-36突变系和表2中所示任一种高亚油酸高硬脂酸系(例如CAS-3或CAS-30(表2))的杂交种的系中硬脂酸(18:0)、总的饱和脂肪酸含量(S)、油酸/亚油酸比率(O/L)、不同的TAG组和分布系数α的值。油酸与亚油酸含量的比率表示为O/L，在所选择的系中由于油酸含量低于亚油酸含量，所以其＜1。

  向日葵系  18:0  S  O/L  SUS  SUU  UUU  α饱和  HL1  31.1  36.7  0.75  31.7  46.6  21.7  0.5  HL2  31.1  39  0.42  34.8  47.5  17.8  0.49  HL3  21.1  25  0.35  15.5  43.9  40.5  0.5  HL4  14.3  23.6  0.15  13.3  44.1  42.6  0.5  HL5  30.3  43.5  0.05  41.4  45.7  12.2  0.47  HL6  32.4  44.5  0.09  41.7  47.9  9.7  0.44  HL7  36.9  47.9  0.28  47.8  43.4  7.2  0.46  HL8  31.2  40.9  0.12  36.4  49.7  13.8  0.43  HL9  30.4  42  0.29  38.2  49.6  12.2  0.43

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