检测鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸及其制备方法

摘要

本发明公开了一种检测鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸及其制备方法，该试纸包括依次紧密串联的样品垫、含有金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针或抗鸡IgG标记胶体金探针的金标垫、纤维膜和吸水垫；所述纤维膜包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线为鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白，所述质控线为可与金黄色葡萄球菌蛋白A结合的抗体或可与抗鸡IgG结合的抗体；当所述金标垫含有金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针时，所述质控线为可与金黄色葡萄球菌蛋白A结合的抗体；当所述金标垫含有抗鸡IgG标记胶体金探针时，所述质控线为可与抗鸡IgG结合的抗体。该免疫层析试纸特异性强、敏感、简便、快速，与IHA方法相比，更适合于临床、突发事件以及基层的鹦鹉热衣原体病诊断。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸及其制备方法。

背景技术

鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci，Cps)能感染各种鸟类、家禽和家畜，引起多种疾病。该病不仅造成畜牧业和家禽业的经济损失，而且还严重威胁着人类健康。Cps的主要宿主是鸟和禽类，哺乳动物和人类密切接触后也可感染。澳大利亚和新西兰等农牧业国家将Cps列为必须控制的最重要的病原微生物之一。由于Cps具有较强的致死性和失能性，因此是经典的生物战剂。

Cps可引起人群的鹦鹉热、发热、头痛、咳嗽、间质性肺炎及心肌炎等；可引起人的关节炎、尿道炎、结膜炎综合症；200种动物可感染发病，引起动物的肺炎、大脑炎、结膜炎、肠炎、关节炎、尿道炎、阴道炎、付睾炎、宫颈炎、胎盘炎，导致孕畜流产、死胎、不孕等。Cps除引起禽类和某些哺乳动物、尤其是反刍动物严重疾病外，还可在人密切接触患病动物后感染，因此Cps是人兽共患病原菌，另外，由于Cps的严重致病性和易传染性，一直被国际社会公认为重要的细菌性生物战剂之一。

Cps检测和防疫工作一直受到各国重视，我国已将Cps列为进出口产品检疫清单的新法规之中。我国禽、畜类衣原体感染也十分严重，Cps是比较常见的导致牛、羊和其它哺乳动物流产的病原体，调查表明，引种频繁的大、中型集约化饲养场感染率在8～50％之间；发生过感染的禽、畜场中，动物群的流产率和死胎率远高于安全场。养鸡场鸡的发病日龄一般在15日龄，死亡集中在32～49日龄，病程多在14～20天，发病率平均为20％，死亡率为10～30％。

经典的Cps检测方法是鸡胚致死及中和试验等，但由于其操作较烦琐、耗时较长，不适合在临床和现场使用。目前使用的鹦鹉热衣原体血清检测方法有ELISA方法，使用的鹦鹉热衣原体血清检测试剂有鹦鹉热衣原体间接血凝(IHA)诊断试剂盒。所需时间均比免疫层析试纸检测方法长并且不易在现场使用。因此，研究衣原体敏感、特异、快速、简便的检测方法和试剂非常必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸(Immuno-Chromatographic Assay，ICA)。

本发明所提供的检测鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸，包括依次紧密串联的样品垫、含有金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)标记胶体金探针或抗鸡IgG标记胶体金探针的金标垫、纤维膜和吸水垫；所述纤维膜包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线为鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白(MOMP)，所述质控线为可与金黄色葡萄球菌蛋白A结合的抗体或可与抗鸡IgG结合的抗体；当所述金标垫含有金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针时，所述质控线为可与金黄色葡萄球菌蛋白A结合的抗体；当所述金标垫含有抗鸡IgG标记胶体金探针时，所述质控线为可与抗鸡IgG结合的抗体。

当所述金标垫含有金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针，所述质控线为可与金黄色葡萄球菌蛋白A结合的抗体时，所述免疫层析试纸用于检测哺乳动物鹦鹉热衣原体感染；当所述金标垫含有抗鸡IgG标记胶体金探针，所述质控线为可与抗鸡IgG结合的抗体时，所述免疫层析试纸用于检测鸡鹦鹉热衣原体感染。

所述抗鸡IgG优选为鼠抗鸡IgG。

所述可与金黄色葡萄球菌蛋白A结合的抗体可为抗人IgG、抗羊IgG、抗兔IgG、抗豚鼠IgG、抗猪IgG、抗小鼠IgG、抗猴IgG等。

所述可与金黄色葡萄球菌蛋白A结合的抗体优选为羊抗人IgG；

所述纤维膜可为硝酸纤维膜或醋酸纤维膜。

为了使用更加方便，所述吸水垫的下面还紧密连接有背板。背板的材料可以是多种多样的，如塑料、树脂、PVC板等。

所述样品垫、吸水垫、金标垫均由吸水材料制成，如由玻璃纤维膜、吸水纸、树脂等制成。

本发明的第二个目的是提供上述检测鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸的制备方法。

本发明所提供的检测鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸的制备方法，包括以下步骤：

1)将鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白喷到纤维膜上，包被纤维膜的一个区域，得到检测线；将可与金黄色葡萄球菌蛋白A结合的抗体溶液或可与抗鸡IgG结合的抗体溶液喷到纤维膜上，包被纤维膜的另一区域，得到质控线；37℃干燥0.5～1.0小时，然后将其距质控线较近的一端粘贴在吸水垫上；

2)制备金黄色葡萄球菌蛋白A或抗鸡IgG标记胶体金探针；将金黄色葡萄球菌蛋白A或抗鸡IgG标记胶体金探针溶于质量百分比浓度为0.25-0.4％的四硼酸钠溶液中，使其终质量百分比浓度为5-10％，然后将玻璃纤维膜、树脂分别浸入上述探针溶液中，得到金标垫，在-20℃～-50℃冰冻5～8小时后，冷冻抽干后，分别将其粘贴在步骤1)得到的纤维膜的距质控线较远的一端；

3)在步骤2)中的金标垫的另一端再粘贴样品垫，得到检测鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸。

所述可与金黄色葡萄球菌蛋白A结合的抗体可为抗人IgG、抗羊IgG、抗兔IgG、抗豚鼠IgG、抗猪IgG、抗小鼠IgG、抗猴IgG等。

所述可与抗鸡IgG结合的抗体为抗鼠IgG。

所述可与金黄色葡萄球菌蛋白A结合的抗体优选为羊抗人IgG；所述可与抗鸡IgG结合的抗体优选为羊抗鼠IgG。

为了使用更加方便，所述吸水垫的下面还粘贴有背板。

所述方法中，所述纤维膜可为硝酸纤维膜、醋酸纤维膜；

所述方法中，所述金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)或抗鸡IgG抗体标记胶体金探针，可按下述方法制备：用水溶解氯金酸使其终浓度为0.01％，煮沸后每100ml氯金酸溶液进行以下操作：加入1％的柠檬酸三钠水溶液1.6-1.8ml，继续煮沸10-15分钟，用纯水恢复至100ml，冷却至室温后用K₂CO₃调pH至6-7，搅拌加入0.7mg金黄色葡萄球菌蛋白A或0.8mg鼠抗鸡IgG，20min-30min后加入2ml 10％的聚乙二醇(20000)，继续搅拌20min-30min，9000rpm-12000rpm离心25min-35min，弃上清，沉淀即为金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针或鼠抗鸡IgG标记胶体金探针；所述百分比浓度为质量百分比浓度。

所述抗鸡IgG优选为鼠抗鸡IgG。

其中，调节pH值的K₂CO₃的浓度可为0.1mol/L-0.3mol/L，优选为0.2mol/L。

在实际应用中，所述纤维膜的厚度可为2.5-3mm；所述金标垫的厚度可为30-70mm；所述样品垫的厚度可为0.1-0.2mm。

本发明的检测鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸原理：检测鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸是将鹦鹉热衣原体MOMP蛋白包被在NC膜上，用于捕捉血清中鹦鹉热衣原体抗体，然后用标记了SPA的免疫胶体金探针(用于哺乳动物)或鼠抗鸡IgG抗体(用于鸡)标记胶体金探针检测；阳性血清样品鹦鹉热衣原体抗体(IgG和IgM)的Fc端与金颗粒上的SPA结合，Fab端与纤维膜上的鹦鹉热衣原体MOMP蛋白结合，层析2分钟后出现肉眼可见的沉淀线。

本发明的检测鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸简单、易操作，非专用人员参照说明书即可利用该试纸检测鹦鹉热衣原体感染。并且，本发明的试纸比ELISA和IHA方法等常用的检测方法具有更好的稳定性。实验证明本发明的检测鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸特异性强、敏感、简便、快速，2分钟即可出结果，与IHA方法相比，更适合于现场诊断，如临床、突发事件以及基层的鹦鹉热衣原体病诊断。

附图说明

图1为检测鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸的结构示意图

具体实施方式

材料

氯金酸(HAuCl₄.4H₂O)，分析纯，上海试剂一厂；

柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇.2H₂O)，分析纯，北京化工厂；

碳酸钾(K₂CO₃)，分析纯，北京化工厂；

金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)，购于Amersham Pharmacia Biotech公司；

羊抗人IgG(提取人的IgG免疫羊获得，具体方法见《免疫化学研究进展》，李成文著，中国科学技术出版社，1993年)；

鹦鹉热衣原体(鸡)阳性血清购自由北京市兽药生物药品厂。

下述实施例所述的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、两种检测鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸的制备

如图1所示，检测鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸由依次紧密串联的吸水垫4、硝酸纤维膜(NC膜)3、金标垫2和玻璃纤维膜样品垫1四部分组成；硝酸纤维膜3上包被有检测线5和质控线6。

1、鹦鹉热衣原体MOMP抗原的制备

鹦鹉热衣原体MOMP抗原是具有专利号为02146790.0的发明专利的序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质。具体可按如下方法制备：

设计引物，扩增具有专利号为02146790.0的发明专利的序列表中序列1的核苷酸序列片段(鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白的编码基因)，其中引物上带有Nco I和Hind III酶识别位点。然后，将扩增片段用Nco I和Hind III双酶切，将其插入到载体pET32a(+)(购自NOVAGEN公司)的Nco I和Hind III酶识别位点之间得到含有鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白的编码基因的重组载体，将该重组载体转入受体菌BL21(DE3)(购自NOVAGEN公司)，筛选得到表达具有专利号为02146790.0的发明专利的序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质的工程菌。

将上述得到的工程菌接种在LB平板(含氨苄青霉素90～100μg/ml)，37℃培养20～24小时，挑取单个典型菌落接种10ml LB肉汤，37℃摇床震荡(250～300rpm)培养10～12小时，采取1∶10扩大培养法(如10ml菌液接种100ml LB肉汤)直至进入发酵反应器。发酵培养基为2×YT培养基，发酵时以1∶50的体积比接种。发酵中控制温度37℃，搅拌转数350～500rpm，通气量1L培养基1L/min空气，发酵反应器以1mol/L NaOH和30％NaH₂PO₄调节发酵液pH7.0；记录发酵液吸光度(550nm处A值)，当发酵液A值达到0.8时加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为0.02mmol/L，并下调温度至26℃，搅拌转数和通气量不变。诱导3-4小时后，全部发酵结束。

MOMP抗原的提取和纯化：发酵菌液以8000g-9000g离心10-15分钟收集菌体沉淀，按每g湿重菌体加1ml纯水，放入匀浆机中，使菌体在低渗环境下匀浆(12±1kpa/cm²)破碎。收集匀浆液即为粗制MOMP抗原。取粗制MOMP抗原100μl按常规法进行SDS-PAGE分析，结果在51Kd处有一条明显的蛋白带，蛋白含量约占总蛋白量50％以上。

取粗制MOMP抗原4℃ 8000g-9000g离心10-15分钟，弃沉淀，收集上清，上清于4℃ 10000g-12000g离心10-15分钟，弃上清，收集沉淀包含体，包含体再用PBS(0.01M，pH7.0)洗3次，4℃ 10000g-12000g离心10-15分钟收集沉淀包含体，按每g湿重包含体加入含8mol/L尿素PBS(0.01mol/L，pH7.0)30ml，37℃吹打至包含体溶解并蛋白变性，收集变性MOMP于透析袋中，分别用递减尿素含量(6mol/L、3mol/L、1.5mol/L、0.75mol/L)的PBS(0.01M，pH7.0)透析液1000ml透析，不同透析液各透析4小时进行蛋白复性，收集复性后蛋白液，4℃ 10000g-12000g离心10-15分钟，弃沉淀，收集上清即为纯化后的MOMP抗原。

2、金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)或鼠抗鸡IgG抗体标记胶体金探针的制备

1)制备胶体金溶液：用水溶解氯金酸使其终浓度为0.01％，煮沸后每100ml氯金酸溶液进行以下操作：加入1％的柠檬酸三钠水溶液1.6-1.8ml，继续煮沸10-15分钟，用纯水恢复至100ml，冷却至室温后用0.2M的K₂CO₃调pH至6-7，搅拌加入SPA0.7mg或鼠抗鸡IgG 0.8mg，20min-30min后加入10％的聚乙二醇(20000)2ml，继续搅拌20min-30min，9000g-12000g离心25min-35min，弃上清，沉淀即为SPA标记胶体金探针或鼠抗鸡IgG抗体标记胶体金探针；用0.25％四硼酸钠保存液恢复至原体积的十分之一，即10ml，4C冰箱保存。

2)金标垫2的制备：取SPA标记胶体金探针(检测哺乳动物)或鼠抗鸡IgG抗体标记胶体金探针(检测鸡)5ml加入0.5g蔗糖，充分溶解均匀加在玻璃纤维膜上，-20℃～-50℃放置10小时，冻干机抽干，得到含有SPA标记胶体金探针的金标垫或含有鼠抗鸡IgG抗体标记胶体金探针的金标垫。

3、NC膜3的包被：

分别用0.01M pH 7.2磷酸缓冲液(NaH₂PO₄.2H₂O 0.39g，Na₂HPO₄ 1.07g，去离子水1000ml)稀释步骤1中制备的鹦鹉热衣原体MOMP抗原至2～3mg/ml用于包被检测线。用0.01M pH 7.2的PBS(NaH₂PO₄.2H₂O 0.39g，Na₂HPO₄ 1.07g，NaCl 8.5g，去离子水1000ml)分别稀释羊抗人IgG 2.5mg/ml(检测哺乳动物)或羊抗鼠IgG2-3mg/ml(检测鸡)分别用于包被质控线。用BIODOT公司XYZ3000喷膜机分别喷于2.5mm厚硝酸纤维素膜上，形成相互分离的检测线和质控线，37℃干燥2.5h，制成质控线分别为羊抗人IgG或羊抗鼠IgG的两种NC膜。

4、检测鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸的制备

1)检测鸡鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸的制备

将吸水垫(玻璃纤维膜)4用双面胶粘贴在具有检测线和质控线的NC膜3的离质控线较近的一端，将质控线为羊抗鼠IgG的NC膜3的离质控线较远端用双面胶粘贴在步骤2中制备的含有鼠抗鸡IgG抗体标记胶体金探针金标垫2的一端；在金标垫2的另一端用双面胶粘贴0.15mm厚的玻璃纤维膜样品垫1；再最后将它们用双面胶粘贴在塑料背板上，按所需大小切割，即为检测鸡鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸，加干燥剂后密封保存。

2)检测哺乳动物鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸的制备

将吸水垫(玻璃纤维膜)4用双面胶粘贴在具有检测线和质控线的NC膜3的离质控线较近的一端，将质控线为羊抗人IgG的NC膜3的离质控线较远端用双面胶粘贴在步骤2中制备的含有SPA标记胶体金探针的金标垫2的一端；在金标垫2的另一端用双面胶粘贴0.15mm厚的玻璃纤维膜样品垫1；再最后将它们用双面胶粘贴在塑料背板上，按所需大小切割，即为检测哺乳动物鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸，加干燥剂后密封保存。

4、检测鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸的原理

测定时将试纸条样品垫1浸入液体标本中，样品垫1即吸取液体向上端移动，流经金标垫2时使干片上的金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)标记胶体金探针或抗鸡IgG标记胶体金探针复溶，并带动其向硝酸纤维膜3渗移。若标本中有待测特异抗体，其可与金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)标记胶体金探针或抗鸡IgG标记胶体金探针结合，此复合物流至检测线5即被固相抗原所获，在膜上显出红色反应线条。过剩的金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)标记胶体金探针或抗鸡IgG标记胶体金探针继续前行，至质控线6与固相IgG结合，而显出红色质控线条。反之，阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。

5、检测鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸的使用方法

将鹦鹉热衣原体感染的哺乳动物或鸡血清样品用生理盐水按1∶40稀释，以正常的哺乳动物血清或鸡血清为对照，也用生理盐水按1∶40稀释，分别用步骤4制备的检测哺乳动物鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸或检测鸡鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸各1条，将免疫层析试纸的样品垫浸入经上述稀释的血清样品中，2min后开始观察结果，15min观察终止。以血清效价1∶40以上为阳性诊断标准，免疫层析试纸检测出现1条红色(质控线)沉淀线，为鹦鹉热衣原体血清学诊断阴性，即鹦鹉热无衣原体感染；免疫层析试纸检测出现2条红色(检测线和质控线)沉淀线，为鹦鹉热衣原体血清学诊断阳性，即有鹦鹉热衣原体感染，质控线和检测线处均无红色沉淀线，说明试纸失效。

实施例2、检测临床血清样品的效果实验

用实施例1制备的检测哺乳动物鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸检测93份鹦鹉热衣原体感染牛血清，检测鸡鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸检测250份鹦鹉热衣原体感染鸡血清，将鹦鹉热衣原体感染的牛或鸡血清样品用生理盐水按1∶40稀释，以正常的牛血清或鸡血清为对照，也用生理盐水按1∶40稀释，以血清效价1∶40以上为阳性诊断标准。

检测鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸检测牛血清样品结果表明：在93份衣原体感染的牛血清中，69份为阳性，24份为阴性。50份正常牛(对照)经免疫层析试纸检测全部为阴性。与鸡胚致死及中和试验检测结果一致。

检测鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸检测鸡血清结果表明：在250份衣原体感染的鸡血清中，82份为阳性，168份为阴性。50份正常鸡ICA检测全部为阴性。与鸡胚致死及中和试验检测结果一致。

实施例3、与ELISA方法、IHA方法比较检测效果

用实施例1制备的检测哺乳动物的鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸检测(ICA检测)22份牛血清，用检测鸡鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸检测(ICA检测)22份鸡血清。同时用实施例1制备的鹦鹉热衣原体MOMP抗原通过ELISA方法进行检测。这些血清来自同一地区的鹦鹉热衣原体病患病牛(或患病鸡)和正常牛(或正常鸡)，用于检测鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸的特异性评价，具有良好的可比性。

检测结果表明22份牛血清(经ELISA和IHA方法检验为鹦鹉热衣原体阳性)，用ICA试剂盒检验19份阳性，经进一步验证，该22份牛血清中只有19份阳性，且与本发明的ICA试剂盒的各样品检测结果一致，证明本发明的ICA试剂盒准确；7份牛血清来自与上述鹦鹉热衣原体患病同一地区的正常牛血清，在ELISA和ICA中全部为阴性；25份鸡血清(经ELISA和IHA方法检验为鹦鹉热衣原体阳性)，用ICA试剂盒检验23份阳性，经进一步验证，该25份鸡血清中只有23份阳性，且与本发明的ICA试剂盒的各样品检测结果一致，证明本发明的ICA试剂盒准确；5份鸡血清来自与上述鹦鹉热衣原体患病鸡同一地区的正常鸡，在ELISA和ICA中全部为阴性。结果说明实施例1中制备的检测鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸(ICA)与ELIS和IHA方法比较，在检测牛血清样品或鸡血清样品中都具有较好的一致性和准确性。