编码重组人尿钠素的基因及利用该基因生产重组人尿钠素的方法

摘要

本发明公开了一种编码重组人尿钠素的基因及利用该基因生产重组人尿钠素的方法。该基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所述。该方法将含有SEQ ID No.6和SEQ IDNo.1的双链DNA与含有硫氧还蛋白和组氨酸标签编码基因的表达载体连接，形成硫氧还蛋白－尿钠素融合蛋白表达载体，用该表达载体转化大肠杆菌，诱导表达产生硫氧还蛋白－尿钠素融合蛋白，用肠激酶裂解硫氧还蛋白－尿钠素融合蛋白，裂解产物用Zn－Sepharose亲和柱进行纯化，重组人尿钠素留存于样品穿过液中，收集，纯化，鉴定即可。该序列可在大肠杆菌系统高效表达，该方法成本低、效果好，适合产业化应用。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种编码重组人尿钠素的基因，本发明还涉及利用该基因生产重组人尿钠素的方法。

背景技术

尿钠素(Urodilatin，UNP)是1988年德国学者Forssmann从人的尿液中纯化获得的一种多肽激素^[1]。人的尿钠素(hUNP)是由32个氨基酸组成的多肽，它的分子量为3507Da。尿钠素具有降低平均动脉血压、利尿以及促进尿钠排泄的功能，能够抑制血浆中血管紧张肽原酶的活性以及醛固酮和内皮素的分泌^[2]，促进肾小球的滤过速率，松弛血管平滑肌，降低血管的系统阻抗。

尿钠素和心钠素(Atrial natriuretic peptide，ANP)是由126个氨基酸组成的心扩张激素原(Cardiodilatin prohormone)分别经过不同的翻译后加工而形成的激素^[3]。尿钠素主要在肾脏组织产生，由心扩张激素原的Thr⁹⁵-Tyr¹²⁶肽段组成，心钠素主要在心房组织合成加工，由心扩张激素原的Ser⁹⁹-Tyr¹²⁶肽段组成。尿钠素和心钠素在体内可被磷酸化而导致生物活性的下降^[4]。尿钠素对中性内肽酶(neutral endopeptidase，E.C.3.4.24.11)有一定的耐受性，而心钠素则易被中性内肽酶水解而导致生物活性的下降丧失^[5]。实验表明，在相同的使用剂量时，尿钠素产生的促尿钠排泄及利尿作用显著强于心钠素^[6，7]。

临床研究结果表明，rhUNP是治疗充血型心衰竭的一种安全有效的药物^[8]。与目前用于治疗心衰竭的多肽药物ANP相比，rhUNP具有疗效快，使用剂量低，副作用小等优点。此外，rhUNP对支气管孝喘以及急性肾衰也具有治疗作用^[9，10]。

用基因工程制备低分子量多肽，目前一般采用两种方法：一是通过融合蛋白表达，二是通过多肽基因串联表达。两种方法均能克服单独表达低分子量多肽时出现的翻译效率低、表达产物易受蛋白水解酶降解的缺陷^[11]，并且均可以通过插入某些特定序列(如His-tag)从而简化表达产物的纯化方法。此外，某些载体蛋白具有提高目标多肽的可溶性，促进其折叠形成活性构象的功能。采用上述方法制备多肽，均必须通过酶学或化学裂解途径以获得目标多肽。由于化学裂解反应条件较难控制，往往存在化学修饰副反应，产物的均一性和活性较低。截至目前为止，我们尚未发现涉及与重组人尿钠素的表达、纯化与活性鉴定相关的文献。

发明内容

本发明的目的是提供一种可在大肠杆菌系统中高效表达的编码重组人尿钠素的基因。

本发明另一个目的是提供一种成本低、效果好的制备重组人尿钠素(rhUNP)的方法。

本发明的目的是通过下列技术措施实现的：

编码重组人尿钠素的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所述，该序列含有大肠杆菌偏爱密码子，适合用大肠杆菌进行表达制备重组人尿钠素。

利用SEQ ID NO.1生产重组人尿钠素的方法，包括下列步骤：

a.在DNA水平，将含有SEQ ID NO.6及SEQ ID NO.1的双链DNA与含有硫氧还蛋白和组氨酸标签编码基因的表达载体连接，形成硫氧还蛋白-尿钠素融合蛋白表达载体，用该表达载体转化大肠杆菌，经诱导，该大肠杆菌表达产生硫氧还蛋白-尿钠素融合蛋白，硫氧还蛋白-尿钠素融合蛋白中的尿钠素为重组人尿钠素；

b.用肠激酶裂解硫氧还蛋白-尿钠素融合蛋白，裂解产物用Zn-Sepharose亲和柱进行纯化，裂解产物中的硫氧还蛋白以及少量未被酶解的硫氧还蛋白-尿钠素融合蛋白被吸附到Zn-Sepharose亲和柱上，重组人尿钠素留存于样品穿过液中，收集，纯化，鉴定即可。

Zn-Sepharose亲和柱也可以用吸附了过渡金属的Sepharose亲和柱，如Ni-Sepharose亲和柱、Co-Sepharose亲和柱替代。

所述的生产重组人尿钠素的方法，其中有硫氧还蛋白和组氨酸标签编码基因的表达载体是pET32a。

所述的生产重组人尿钠素的方法，其中大肠杆菌是BL21；诱导剂是IPTG、色氨酸或阿拉伯糖。

所述的生产重组人尿钠素的方法，其中在所述硫氧还蛋白-尿钠素融合蛋白表达载体中，编码硫氧还蛋白、组氨酸标签以及人尿钠素的基因位于同一阅读框架。

所述的生产重组人尿钠素的方法，其中SEQ ID NO.6插入位置在SEQ ID NO.1上游。

SEQ ID NO.6经表达后的氨基酸序列为Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-(SEQ ID NO.7)，该氨基酸序列作为肠激酶识别位点，通过肠激酶的裂解作用，使重组人尿钠素从硫氧还蛋白-尿钠素融合蛋白中游离出来。

优选的利用大肠杆菌表达制备重组人尿钠素的方法是：

a.在DNA水平，将SEQ ID NO.3用限制性核酸内切酶KpnI和XhoI酶解，并与经KpnI和XhoI酶切消化的表达质粒pET32a连接，用连接产物转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，该大肠杆菌表达产生硫氧还蛋白-尿钠素融合蛋白，硫氧还蛋白-尿钠素融合蛋白中的尿钠素为重组人尿钠素；

b.用Zn-Sepharose亲和柱纯化大肠杆菌表达的硫氧还蛋白-尿钠素融合蛋白，纯化的融合蛋白经肠激酶裂解处理后再次上样至Zn-Sepharose亲和柱，裂解产物中的硫氧还蛋白以及少量未被酶解的硫氧还蛋白-尿钠素融合蛋白被吸附到Zn-Sepharose亲和柱上，从硫氧还蛋白-尿钠素融合蛋白中裂解产生的游离的重组人尿钠素不能与Zn-Sepharose柱结合，因此留存于上样穿过液中。

可以采用兔胸主动脉条的血管舒张效应测定上述重组人尿钠素的生物活性。

由于在硫氧还蛋白-尿钠素融合蛋白表达质粒中，编码硫氧还蛋白和组胺酸标签以及人尿钠素的基因位于同一阅读框架，故表达的融合蛋白中含组胺酸标签序列，故可方便地通过Zn-Sepharose亲和层析柱来纯化。

本发明的有益效果：

本发明解决了可供工业化生产rhUNP的工程菌的构建，建立了rhUNP的高效表达、纯化及鉴定工艺，制备出了具有和人尿钠素(hUNP)标准品相似比活性的rhUNP；同时，利用基因工程的方法制备hUNP比从组织中提取hUNP的生产成本更低，并可避免用化学方法合成hUNP造成的环境污染。

本发明还具有下列特点：

1、用融合蛋白表达的方式来制备rhUNP。

用基因工程制备低分子量多肽，一般采用两种方法，一是通过融合蛋白表达，二是通过多肽基因串联表达。两种方法均能克服单独表达低分子量多肽时出现的翻译效率低、表达产物易受蛋白水解酶降解的缺陷^[11]，并且均可以通过插入某些特定序列(如His-tag)从而简化表达产物的纯化方法。此外，某些载体蛋白具有增加目标多肽的溶解度，促进其折叠形成活性构象的功能。但采用上述方法制备多肽，都必须通过酶学或化学裂解途径以获得目标多肽。

通过基因串联途径表达制备的hUNP多聚体，在采用化学或酶学方法裂解时往往不能直接获得具有野生型氨基酸序列的rhUNP单体，此外，化学裂解反应条件较难控制，存在化学修饰副反应，产物的均一性和活性较低。因此我们选择用蛋白水解酶裂解融合蛋白的方式来制备rhUNP。

2、选用大肠杆菌表达系统来制备rhUNP。

由于hUNP只有32个氨基酸残基，仅有1对二硫键，无糖基化位点，且去磷酸化的hUNP具有更高的生物活性，适合用原核细胞表达，并且大肠杆菌表达系统成本低，产量高，效果好，因此选用大肠杆菌表达系统来制备rhUNP。

3、选择pET32a为融合蛋白表达载体。

最初曾使用大肠杆菌分泌型表达载体pET22b来制备thioredoxin-hUNP融合蛋白，但发现分泌至细菌周质腔的量不到总表达量的5％，且融合蛋白的纯化回收得率较低。因此选择pET32a为融合蛋白表达载体，该载体中有编码大肠杆菌thioredoxin以及His-tag的基因序列。当hUNP基因通过KpnI/XhoI位点插入pET32a后，编码thioredoxin、His-tag和hUNP的基因位于同一阅读框架，表达的融合蛋白可以方便地通过Zn-Sepharose亲和层析来纯化。

4、通过肠激酶的酶解使rhUNP解离出来。

本发明在hUNP基因的上游插入了GAC GAC GAT GAC AAA序列，该序列编码的氨基酸Asp-Asp-Asp-Asp-Lys为肠激酶的识别位点，可以通过肠激酶的酶解使rhUNP解离出来。

用肠激酶裂解thioredoxin-hUNP是因为肠激酶能够在广谱pH(4.5～9.5)和较宽温度(4～45℃)范围内特异性的水解底物^[12]，且thioredoxin-hUNP融合蛋白经肠激酶裂解获得的rhUNP具有和野生型完全一致的氨基酸序列。迄今为止，尚未见用肠激酶来制备rhUNP的报道。

5、肠激酶裂解产物中的rhUNP纯化。

经肠激酶裂解处理后，裂解产物中的thioredoxin载体蛋白以及少量未被裂解的thioredoxin-hUNP融合蛋白仍含有His-tag序列，可以被吸附到Zn-Sepharose亲和柱上，而rhUNP分子中已不含有His-tag，不能与Zn-Sepharose结合，因此留存于上样穿过液中。

6、核苷酸序列为适合大肠杆菌表达的序列，含有大肠杆菌偏爱的密码子。

7、本发明用大肠杆菌表达系统表达制备硫氧还蛋白-尿钠素融合蛋白的过程中，采用硫氧还蛋白作为融合伴侣，使得1L硫氧还蛋白-尿钠素融合蛋白的工程菌可表达124mg左右的硫氧还蛋白-尿钠素融合蛋白。并且，所制备的重组人尿钠素具有和人尿钠素标准品相似的比活性。

附图说明

图1为hUNP PCR产物与重组质粒pET32a/hUNP酶切产物琼脂糖电泳图谱。

图2为经Zn-Sepharose亲和层析纯化的硫氧还蛋白-重组人尿钠素融合蛋白SDS-PAGE电泳图。

图3为硫氧还蛋白-重组人尿钠素融合蛋白的肠激酶裂解产物SDS-PAGE电泳图谱。

图4为制备型C4反相HPLC纯化rhUNP色谱图。

图5用C18反相HPLC鉴定rhUNP的纯度。

图6为rhUNP质谱图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

本发明的材料：

1.菌株：大肠杆菌DH5α和BL21购自Novagen公司。

2.质粒pET32a购自Novagen公司(产品代码：69015-3)。

3.酶：肠激酶购自Novagen公司；T4 DNA连接酶和限制性内切酶购自TaKaRa公司(产品代码：D2011A)。

4.其它试剂：UNP标准品购自American Peptides公司；质粒提取和DNA片段回收试剂盒为Qiagen公司产品；Zn-Sepharose购自Pharmacia Biotech；半制备型C4反相HPLC色谱柱(300mm×30mm)为Waters公司产品；乙腈和三氟乙酸购自Fisher公司。

5.PCR模板和引物由Invitrogen公司合成。

引物的序列为：

上游：5’-GTT GGT ACC GAC GAC GAT GAC AAA ACC GCT CCG CGT TCT C-3’(SEQ ID NO.4)

下游5’-GGT GAG CTC TTA GTA ACG GAA GGA GTT ACA GCC CAG ACC AG-3’(SEQ ID NO.5)

hUNP模板的序列为：5’-GGT ACC GAC GAC GAT GAC AAA ACC GCT CCG CGTTCT CTG CGT CGC TCC AGC TGC TTC GGT GGC CGT ATG GAC CGT ATC GGT GCACAG TCT GGT CTG GGC TGT AAC TCC TTC CGT TAC TAA GAG CTC-3’(SEQ IDNO.3)

hUNP模板的序列中含有编码重组人hUNP的基因(SEQ ID NO.1)(即第22位～120位)和编码肠激酶识别位点基因(第7～21位)，其余为酶切位点。

名词术语的说明：

说明1：大肠杆菌DH5α为常用的克隆菌，BL21为常用的表达菌。(详见《生物化学与分子生物学实验常用数据手册》吴冠芸等主编，科学出版社：1998，p426)。

说明2：双链DNA(是由两条核苷酸链依靠彼此碱基之间形成的氢键作用而配对形成的双螺旋结构。详见《生物化学》第三版上册王镜岩朱圣庚徐长法主编，高等教育出版社：2002，p486-487)。

说明3：PCR扩增(PCR：聚合酶链式反应。详见《分子克隆实验指南》第三版上册J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著，科学出版社：2002，p611-612)。

说明4：质粒(质粒是染色体外的DNA分子，其大小范围在1Kb至200Kb以上不等。大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合的环状分子，以超螺旋形式存在。详见《分子克隆实验指南》第三版上册J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著，科学出版社：2002，p2-3)。

说明5：连接(连接是指在一定条件下，由DNA连接酶催化两个双链DNA片段相邻的5‘端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸二酯键的过程。详见《现代医学分子生物学》谷志远著，人民军医出版社：1998，p198)。

说明6：转化(转化是指重组DNA分子导入受体细胞的过程。详见《现代医学分子生物学》谷志远著，人民军医出版社：1998，p204-206)。

说明7：感受态细胞(感受态细胞是指处于容易接受外源DNA状态的细菌细胞。详见《现代医学分子生物学》谷志远著，人民军医出版社：1998，p204)。

说明8：质粒序列测定(质粒序列测定是指将基因和基因组转化为具有明确结构的化学物质的过程。详见《分子克隆实验指南》第三版下册J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著，科学出版社：2002，p981)。

说明9：引物(引物是指与模板DNA待扩增区两侧的碱基相互补的短核苷酸链。详见《现代医学分子生物学》谷志远著，人民军医出版社：1998，p238)。

说明10：模板(模板是指PCR扩增时的DNA或RNA核苷酸链。详见《现代医学分子生物学》谷志远著，人民军医出版社：1998，p240)。

说明11：硫氧还蛋白(Thioredoxin)(硫氧还蛋白是作为基因融合表达系统中的伴侣蛋白，特别适用于在大肠杆菌胞质中表达高产量的可溶性融合蛋白。详见《精编分子生物学实验指南》奥斯伯等著，金冬雁校科学出版社：1998，p652)。

说明12：LB培养基(1升LB培养基：其成分为胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，详见《分子克隆实验指南》第二版金冬雁校p908)。

说明13：IPTG(IPTG是异丙基硫代半乳糖苷。详见《现代医学分子生物学》谷志远著，人民军医出版社：1998，p130)。

说明14：SDS-PAGE(SDS-PAGE为十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。《精编分子生物学实验指南》奥斯伯等著，金冬雁校科学出版社：1998，p336-337)。

说明15：16％Tricine SDS-PAGE(是一种用于分离肽类物质的凝胶电泳，配方详见《生物化学与分子生物学实验常用数据手册》吴冠芸等主编，科学出版社：1998，p192)。

说明16：HPLC反相柱层析(HPLC包含一个其内充满固定相的柱管，液相的流动相在高压下，以泵输入柱管，流动相经柱管流出。在柱管的前方有个进样器和泵，柱后有一个检测器，其后再联一个记录仪。详见《微生物药品化学与分析》顾觉奋等主编，军事医学科学出版社：1996，p214)。

说明17：质谱分析(详见下文“质谱联用技术在生物大分子分析中的应用”龙耀庭，陆妙琴。化学进展，1994，6(3)244-248)。

说明18：EC₅₀(EC₅₀为半数效量。详见下文“半数效量分析模型在小鼠血清溶血素测定中的应用”徐以平，张晶，李龙，石年。湖北职业技术学院学报，2003，6(3)：74-77)。

实施例：

一、pET32a/hUNP表达质粒的构建

pET32a/hUNP表达质粒的构建：以化学合成的hUNP基因为模板，采用PCR扩增hUNP双链DNA。PCR扩增条件为：5.0fmol hUNP模板(SEQ ID NO.3)，50pmol的上游引物(SEQ ID NO.4)和下游引物(SEQ ID NO.5)，0.25U taq酶，94℃变性2min后进行以下26个循环：94℃、30s；52℃、1min；72℃、40s，PCR产物经琼脂糖电泳纯化后用DNA片段回收试剂盒回收，用KpnI/XhoI双酶切，回收大片段(约120bp)与经过KpnI/XhoI消化的表达质粒pET32a用T4DNA连接酶连接形成pET32a/hUNP质粒，并转化E.coli DH5α感受态细胞，用KpnI/XhoI双酶切鉴定阳性克隆，对pET32a/hUNP质粒进行序列测定。

二、Thioredoxin-hUNP融合蛋白的表达及纯化

1.Thioredoxin-hUNP融合蛋白的表达：用pET32a/hUNP质粒转化E.coli BL21感受态细胞，挑取单菌落接种至含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB培养基，置37℃振摇过夜。过夜菌按2％(v/v)接种于新鲜LB培养基(含氨苄青霉素50μg/mL)，37℃、200r/min振摇培养至OD₆₀₀值为0.6～0.8，加入终浓度为0.5mmol/L IPTG诱导3.5hr，离心(8000rpm，10min，4℃)并收集菌体。

2.Thioredoxin-hUNP融合蛋白的纯化：按每克菌体加入7.5mL裂解缓冲液(20mmol/LTris-HCl，0.5mol/LNaCl，pH7.9)的比例，在4℃用超声破菌，将裂解的菌液用20000r/min，4℃离心30min，收集上清。上清液上样至预先用平衡缓冲液(20mmol/LTris-HCl，0.5mol/L NaCl，5mmol/L咪唑，pH7.9)平衡的Zn-Sepharose层析柱(2.5cm×5.0cm)，用洗涤缓冲液(25mmol/LTris-HCl，0.5mol/LNaCl，40mmol/L咪唑，pH7.9)充分洗涤，再用洗脱缓冲液(25mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，300mmol/L咪唑，pH7.9)洗脱。收集thioredoxin-hUNP融合蛋白，用SDS-PAGE检测其纯度。

三、Thioredoxin-hUNP融合蛋白的酶解及酶解产物的纯化

1.Thioredoxin-hUNP融合蛋白的酶解：将用Zn-Sepharose亲和层析纯化的thioredoxin-hUNP样品在4℃对20mmol/L Tris-HCl，50mmol/L NaCl，pH7.4透析过夜，补加CaCl₂至终浓度2.0mmol/L，酶与底物(thioredoxin-hUNP)按1∶75的重量比加入肠激酶，37℃酶解6h，用16％Tricine SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的酶切效果。

2.融合蛋白酶解产物的纯化：将thioredoxin-hUNP酶解产物上样至预先用25mmol/L Tris-HCl，0.3mol/L NaCl，pH7.9缓冲液平衡的Zn-Sepharose亲和柱(2.5cm×5.0cm)，收集穿过峰，即得rhUNP粗品液，经超滤浓缩至蛋白浓度为2mg/mL左右。浓缩液经半制备型C4 HPLC反相柱(C4烷基键合硅胶柱，300×30mm)层析，用缓冲液A(0.1％三氟乙酸)和B(95％乙腈，0.1％三氟乙酸)进行梯度洗脱，梯度洗脱的条件为：用16％的缓冲液B洗涤3分钟，然后在40分钟内缓冲液B的浓度由16％上升至45％(相同时间点的缓冲液A与B的浓度总和为100％)。收集rhUNP的紫外吸收峰(220nm)，柱温25℃，流速10ml/min，得rhUNP纯品液。用NaOH调节pH至5.0后，对5mmol/L的NH₄HCO₃溶液充分透析，冷冻干燥。用Tricine SDS-PAGE进行纯度鉴定，并做质谱分析。

四、rhUNP的活性测定

通过对兔胸主动脉条的血管舒张效应来测定rhUNP的生物活性，测定方法参照文献[6，7]。取主动脉剪成3cm左右的动脉条，在37℃恒温的麦氏浴槽内加入20mL台氏溶液(NaCl 8.0g、KCl 0.2g、MgSO₄·7H₂O 0.26g、NaH₂PO₄ 0.065g、Glucose 1.0g、CaCl₂0.2g，定容(蒸馏水)至1000mL，调pH为7.4)，通空气。对血管条加挂1.0g负荷，保持1h，每隔20min更换一次台氏液，用记录仪监测血管条的张力变化。待基线稳定后，加入肾上腺素，至终浓度为1.5×10^-4mg/mL，此时血管条的张力显著增加，当张力升至最高并稳定10min后，记录其血管张力变化。充分洗去麦氏浴槽中的肾上腺素，并重新加入20mL台氏液，按累积浓度加样法加入rhUNP样品(设置5×10^-7mg/mL、1.5×10^-6mg/mL、3.0×10^-6mg/mL、5×10^-6mg/mL、1×10^-5mg/mL、2×10^-5mg/mL、3.5×10^-5mg/mL、5.5×10^-5mg/mL系列浓度)，记录血管张力的变化。计算hUNP标准样品和待测样品的EC₅₀，根据EC₅₀值来比较标准品和待测品的生物活性。

实验结果：

(一)pET32a/hUNP表达质粒的构建：以化学合成的hUNP基因为模板，用PCR扩增hUNP模板(SEQ ID NO.3)双链DNA(图1中B列)。PCR产物经琼脂糖电泳纯化后通过KpnI/XhoI酶切位点插入表达载体pET32a，并转化至DH5α感受态细胞。用KpnI/XhoI双酶切鉴定、筛选阳性克隆(见图1)，图1中，A列为DNA分子量标志；B列为SEQ ID NO.3双链DNA，C列为pET32a/hUNP双酶切消化产物。并对阳性克隆的pET32a/hUNP质粒进行全序列分析，结果表明序列完全正确(包含SEQ ID NO.3)。

(二)Thioredoxin-hUNP融合蛋白的表达与纯化：用经测序鉴定正确的pET32a/hUNP表达质粒转化E.coli BL21，挑取单菌落接种于LB培养基(含氨苄青霉素50μg/mL)，经IPTG诱导后，thioredoxin-hUNP的表达量占菌体总蛋白的27％(干重)，每升细菌培养液(即步骤二.1中IPTG诱导后离心前的含细菌菌体的培养液，下同)可得thioredoxin-hUNP融合蛋白124mg。Thioredoxin-hUNP融合蛋白经纯化后经凝胶电泳扫描仪测定纯度可达80％(见图2)。图2中，A列为蛋白分子量标准；B列为Thioredoxin-hUNP纯化产物。

(三)融合蛋白的裂解及rhUNP的纯化当肠激酶和thioredoxin-hUNP按1∶75的比例混合，置于37℃反应6h后，超过86％的融合蛋白被酶解，解离出thioredoxin(MW15000Da)和rhUNP(MW 3500Da)(图3)。图3中，A列为蛋白分子量标准；B列为对照(不加肠激酶裂解时)；C列为thioredoxin-hUNP肠激酶裂解产物(标*为rhUNP)。

裂解产物经Zn-Sepharose亲和柱层析，rhUNP存在于穿过液中，不被Zn-Sepharose柱吸附。将rhUNP穿过液超滤浓缩后进一步用半制备型C4反相HPLC柱纯化，rhUNP样品被洗脱(见图4，标*为rhUNP)，收集rhUNP，用C18反相HPLC检测rhUNP样品的纯度达95％以上(见图5，A为样品HPLC图谱，B为标准品HPLC图谱)。质谱测定rhUNP样品的分子量为3507Da(见图6，标*为rhUNP)，与hUNP的理论分子量相吻合。从每升细菌培养液可得rhUNP纯品4.8mg。获得的rhUNP经测序为SEQ ID NO.2。该氨基酸序列与野生型hUNP氨基酸序列一致。

(四)hUNP的活性测定：活性测定结果表明，本发明制备的rhUNP和hUNP标准品均对兔胸主动脉条具有强烈的血管舒张效应，二者的EC₅₀分别为(1.72±0.42)×10^-6mg/mL及(1.64+0.48)×10^-6mg/mL，说明二者的比活性几乎相等。

参考文献：

[1]Schulz-Knappe P，Forssmann K，Herbs F，et al.Isolation and structure analysis of‘urodilatin’，a new peptide of the cardiodilatin-ANP-family，extracted from human urine.KlinWochenschr，1988；66：752-759.

[2]Carstens J，Jensen KT，Pedersen EB.Effect of Urodilationon renal hemodynamics，tubular function and vasoactive hormones.Clin Sci 1997；92：397-407.

[3]Vesely DL.Natriuretic peptides and acute renal failure.American Journal ofPhysiology，2003；285：167-177.

[4]Dorner T，Gagelmann M，Feller S，Herbst F，Forssmann W.Phosphorylation anddephosphorylation of the natriuretic peptide urodilation(CDD-/ANP-95-126)and the effecton biological activity.Biochemical and Biophysical Research Communications，1989；163：830-835.

[5]Gagelmann M，Hock D，Forssmann W，Urodilation(CDD-/ANP-95-126)is notbiologically inactivated by a peptidase from dog kidney cortex membranes in contrast to atrialnatriuretic peptide/cardiodilatin(CDD-/ANP-99-126).FEBS Letter，1988；233：249-254.

[6]Hildebrandt DA，Mizelle HL，Brands MW，Hall JE，Comparison of renal action ofurodilatin and atrial natriuretic peptide.American Journal of Physiology，1992；262：R395-399.

[7]Forssmann W，Meyer M，Forssmann K，The renal urodilation system：clinicalimplications.Cardiovascular Research，2001；51：450-462.

[8]Elsner D，Muders F，Muntze A，Efficacy of prolonged infusion of Urodilatin(ANP-99-126)in patients with congestive heart failure.Am.Heart J.1995；129：765-773.

[9]Fluge T，orssmann W，Kunkel G，et al.，Bronchodilation using combinedurodilatin-albuterol administration in asthma：A randomized，double-blind，placebo-controlledtrial，.Eur.J.Med.Res.1999；4：411-415.

[10]Meyer M.Wiebe K，Forssmann W，et al.，Urodilatin as a new drug for the therapy ofacute renal failure following cardiac surgery.Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.1997；24：374-376.

[11]Gottesman S.Genetics of proteolysis in Escherichia coli.Annual Review Genetics.1989；23：163～98.

[12]Collins-Racie LA，McColgan JM，Grant KL，et al.Production of recombinantbovine enterokinase catalytic subnit in Escherichia coil using the novel secretory fusionpartner DsbA.Biotechnology，1995；13：982 987.

                       序列表

<110>刘建宁

<120>编码重组人尿钠素的基因及利用该基因生产重组人尿钠素的方法

<160>7

<210>1

<211>99

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>重组人尿钠素肽编码基因

<400>

accgctccgc gttctctgcg tcgctccagc tgcttcggtg gccgtatgga ccgtatcggt 60

gcacagtctg gtctgggctg taactccttc cgttactaa                        99

<210>2

<211>32

<212>PRT

<213>artificial

<220>

<223>重组人尿钠素肽的氨基酸序列

<400>

Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg

1               5                   10                  15

Met Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe

                20                  25                  30

Arg Tyr

    32

<210>3

<211>126

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>人工合成的hUNP模板序列

<400>

ggtaccgacg acgatgacaa aaccgctccg cgttctctgc gtcgctccag ctgcttcggt 60

ggccgtatgg accgtatcgg tgcacagtct ggtctgggct gtaactcctt ccgttactaa 120

gagctc                                                            126

<210>4

<211>40

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>上游引物

<400>

gttggtaccg acgacgatga caaaaccgct ccgcgttctc                            40

<210>5

<211>41

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>下游引物

<400>

ggtgagctct tagtaacgga aggagttaca gcccagacca g                          41

<210>6

<211>15

<212>DNA

<213>编码肠激酶识别位点的核苷酸序列

<400>

gacgacgatg acaaa 15

<210>7

<211>5

<212>PRT

<213>肠激酶识别位点的氨基酸序列

<400>

Asp Asp Asp Asp Lys

1               5