对微量蛋白质或多肽同步富集、脱盐并直接进行分析的方法

摘要

本发明属生化分析鉴定技术领域，具体是一种以氧化硅纳米粒子作为吸附剂，对痕量蛋白质以及蛋白质酶解样品脱盐富集并直接进行基质辅助激光解吸离子化/质谱(MALDI/MS)分析的方法。氧化硅纳米粒子能克服高浓度盐的干扰，对蛋白质以及蛋白质酶解多肽有很好的吸附效果。与传统耙上洗涤脱盐以及商业ZipTip

说明书

技术领域

本发明属于生化分析鉴定技术领域，具体涉及一种微量蛋白质或多肽脱盐、富集和鉴定分析的方法。利用氧化硅纳米粒子高效抗盐作用以及其对蛋白质/多肽分子的富集能力，实现痕量蛋白质/多肽高效脱盐富集，以及直接的基质辅助激光解吸离子化/质谱分析和鉴定。

背景技术

基质辅助激光解吸离子化/质谱(MALDI/MS)以其分析速度快、灵敏度高、易于操作等特点成为蛋白质组学研究中的有效工具。但是存在于分析样品中的大量盐或其它非蛋白质成分(样品前期处理过程中加入)会使得质谱灵敏度大大降低，被称为质谱研究中的压制效应(suppression effect)。避免压制效应的有效方法就是对样品进行脱盐处理。另外在蛋白质组学研究过程中，有大量承担生物体重要生命活动的蛋白质是低丰度蛋白质，其极低的含量给后续的分析和检测带来困难。因此，实现低丰度蛋白质的有效富集是实现其准确分析和鉴定的首要条件之一。目前最常用的溶剂蒸发法在样品浓缩的同时也会使其中盐等杂质得到富集，而传统的脱盐方法是采用Millipore公司推出的用于微量样品制备带有C₁₈填料的ZipTip^TM吸嘴脱盐或采用去离子水对样品进行靶上洗脱去盐，但是这两种方法脱盐能力有限。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单、价格便宜、效果良好，能对痕量多肽或蛋白质进行富集并同步脱盐以实现其质谱鉴定的新方法。

本发明提出的微量蛋白质或多肽同步富集、脱盐并直接进行分析的方法，是利用氧化硅纳米粒子极强的抗盐能力和对多肽或蛋白质样品良好的吸附能力，以及纳米尺寸的粒径与有机基质极好的相容性，对痕量蛋白质或蛋白质酶解肽段进行富集并脱盐，中间无需洗脱步骤，然后直接进行MALDI/MS的分析检测。其具体步骤如下：

(1)以氧化硅纳米粒子作为纳米吸附剂，加入多肽或蛋白质样品的水溶液或盐溶液中，通过静电吸附、亲/疏水作用富集样品并脱盐；样品浓度是10^-11M-10^-6M，富集时间5-60分钟，富集温度4-60摄氏度，氧化硅纳米粒子用量是样品重量的1％-10％；

(2)被富集的样品直接与基质均匀混合，形成均匀细致的结晶，进行MALDI/MS分析；

(3)根据质谱结果，鉴定多肽或蛋白质。

上述方法中，氧化硅纳米粒子与蛋白质或多肽的极稀的水溶液或者含盐溶液混合，优选富集温度35-50℃，优选富集时间25-34分钟。然后离心，弃除上清液，收集下层氧化硅相，得到富集样品。富集样品后的氧化硅纳米粒子与有机基质混合后，进行MALDI/MS测定。其中有机基质可以是2-氰基-4-羟基肉桂酸(α-CHCA)或芥子酸、2，5-二羟基苯甲酸等。

本发明的氧化硅纳米粒子粒径为3-200nm范围较为合适。该范围的氧化硅纳米粒子具有大的比表面积，丰富可调的表面性质。

本发明利用氧化硅纳米粒子对蛋白质和多肽良好的吸附作用，高效的脱盐能力以及它与MALDI过程的高度相容性，建立了纳米氧化硅富集同时脱盐并进行MALDI/MS直接分析的方法，分析痕量蛋白质和多肽。

本发明的氧化硅纳米粒子对多肽或蛋白质有富集和脱盐作用，与传统的溶剂蒸发浓缩方法相比，氧化硅纳米粒子在富集样品同时可以高效脱盐，其脱盐能力远远高于商品化ZipTip^TM吸嘴。

本发明的氧化硅纳米粒子可以与基质均匀混合形成均匀细致的结晶，纳米粒子与基质的混晶体的形成有利于基质将吸收的激光能量转移给氧化硅纳米粒子吸附的样品，实现样品的基质辅助激光解析离子化过程；同时均匀细致的结晶体保证了分析的重现性和结果的可靠性。

本发明样品富集后可直接进行MALDI质谱鉴定，无需样品洗脱步骤，操作简单，避免了洗脱过程带来的样品损失。本方法成本低廉，浓缩效率高，对蛋白质的富集效率可达100倍，除盐能力强，可以实现10^-10M蛋白质酶解产物的成功鉴定。

附图说明

图1本发明使用一种氧化硅纳米粒子的扫描电镜照片。由图可看出纳米氧化硅粒子尺寸分布均匀，其粒径均小于100nm。

图2为10^-7M泛素样品的MALDI/MS谱图。

图3为氧化硅纳米粒子富集泛素样品的MALDI/MS谱图。样品浓度，10^-8M，实验方法依照实施例1。对比图2和图3可以看出，氧化硅纳米粒子对泛素样品有很强的富集能力。

图4为含4M氯化钠的细胞色素C样品的MALDI/MS谱图。细胞色素C浓度为10^-7M。

图5为氧化硅纳米粒子富集细胞色素C同步除氯化钠后的MALDI/MS谱图。细胞色素C浓度10^-7M。氯化钠浓度4M。对比图4和图5可以看出，氧化硅纳米粒子在富集细胞色素C的同时可以克服高浓度无机盐对质谱信号的干扰。

图6为含8M尿素的细胞色素C样品的MALDI/MS谱图。细胞色素C浓度10^-7M。

图7为氧化硅纳米粒子富集细胞色素C同步除尿素后的MALDI/MS谱图。细胞色素C浓度10^-7M。尿素浓度8M。对比图6和图7可以看出，氧化硅纳米粒子在富集细胞色素C的同时可以克服高浓度有机盐对质谱信号的干扰。

图8为含有1M氯化钠的细胞色素C溶液使用靶上脱盐后的MALDI/MS谱图。细胞色素C浓度10^-7M。对比图5和图8可以看出，当溶液中盐浓度很高时，靶上脱盐方法效果很差。

图9为含有1M氯化钠的细胞色素C溶液使用ZipTip^TM吸嘴脱盐后的MALDI TOF/MS谱图。细胞色素C浓度10^-7M。

图10为含有400mM尿素的细胞色素C溶液使用ZipTip^TM吸嘴脱盐后的MALDITOF/MS谱图。细胞色素C浓度10^-7M。对比图5和图9，图7和图10可以看出，本发明脱盐方法远远优于传统ZipTip^TM吸嘴脱盐。

图11为含有100mM碳酸氢铵的10^-10M马心肌红蛋白质酶解样品经氧化硅纳米粒子同步富集并脱盐后的的MALDI/MS谱图。氧化硅纳米粒子富集，实验方法依照实施例8，质谱数据的数据库检索结果列于表1。良好的数据结果表明该方法对于复杂的蛋白质酶解样品同样适用。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明所提供氧化硅纳米粒子材料进行样品富集同时脱盐和MALDI/TOF MS直接分析过程的进一步说明。

实施例1，氧化硅纳米粒子对蛋白质溶液的富集和MALDI TOF/MS测定

取1mL浓度10^-8M的泛素蛋白质样品溶液中加入2μL的10mg/mL氧化硅纳米悬浮液，在37℃下振荡30min；17000g下离心20min，弃除上清，在氧化硅沉淀中加入5μL50％乙腈，振荡使之悬浮。

取前述悬浮液0.5μL滴到MALDI耙板上，再加入等体积基质溶液，待结晶干燥后，进行质谱分析。所用质谱MALDI TOF/TOF(4700 Proteomics Analyzer，AppliedBiosystems)；激光器为Nd-YAG激光，波长355nm，激光脉冲频率200Hz；加速电压20kV，正离子模式线性TOF检测，检测结果见图3。

实施例2，氧化硅纳米粒子对含有高浓度无机盐蛋白质样品的抗盐富集以及MALDITOF/MS测定

取1mL含有4M氯化钠的细胞色素C蛋白质样品溶液，细胞色素C浓度为10^-7M，按照实施例1的方法加入氧化硅纳米悬浮液，离心后点样，正离子模式线性TOF检测，检测结果见图5。

实施例3，氧化硅纳米粒子对含有高浓度无机盐蛋白质样品的抗盐富集以及MALDITOF/MS测定

取1mL含有8M尿素的细胞色素C蛋白质样品溶液，细胞色素C浓度为10^-7M，按照实施例1的方法加入氧化硅纳米悬浮液，离心后点样，正离子模式线性TOF检测，检测结果见图7。

实施例4，氧化硅纳米粒子对蛋白质酶解样品的抗盐富集以及MALDI TOF/MS测定

初始浓度5mg/ml马心肌红蛋白溶液经胰蛋白酶酶解后，用100mM碳酸氢铵溶液将产物稀释至10^-10M，取0.8mL样品加入2μL的1mg/mL的纳米氧化硅悬浊液，依照实例1的方法进行样品富集，正离子模式反射式TOF检测的方法进行质谱分析。质谱结果通过Mascot进行数据库检索。

下表是实施例4的马心肌红蛋白酶解样品数据库检索结果。“+”代表检索到肽段

  748.46  941.51  1086.61  1271.71  1378.89  1502.73  1606.92  1661.94  1815.98  1854.04  ALELFR  YKELGFQG  HLKTEAEMK  LFTGHPETLEK  HGTVVLTALGGILK  HPGDFGADAQGAMTK  VEADIAGHGQEVLIR  LFTGHPETLEKFDK  GLSDGEWQQVLNVWGK  GHHEAELKPLAQSHATK  6.05  6.00  6.76  5.40  8.76  5.21  4.65  5.45  4.37  7.03  0.700  -0.800  -1.244  -0.645  1.171  -0.733  0.153  -0.836  -0.575  -1.082 + + + + + + + + + +  匹配肽段数 11  序列覆盖率(％) 78  蛋白质得分 149