一种c－FLIP反义寡核苷酸纳米粒的制备方法

摘要

本发明涉及医药技术领域，是一种c－FLIP反义寡核苷酸纳米粒的制备方法。本发明采用复乳－干燥法制备c－FLIP反义寡核苷酸纳米粒制剂。将适量c－FLIP－ASODN(600μg)溶于超纯水中，作为水相；将适量聚乳酸－羟基乙酸共聚物(PLGA RG503H)溶于二氯甲烷中，作为油相；将水相与油相混合，冰浴条件下超声乳化形成初乳；取泊洛沙姆188(Poloxamer188)溶液加至初乳中，冰浴条件下再次超声乳化得到复乳；将复乳加至聚乙烯醇(PVA)溶液中，室温下低速搅拌挥发有机溶剂，然后用离心收集沉淀，水洗后，制成冻干粉即可。本发明制备方法所得的纳米粒粒径分布范围窄，平均粒径小，载药量大，有机溶剂挥发较彻底，吸附的PVA少，使用更为安全。

说明书

                          技术领域

本发明涉及医药技术领域，是一种c-FLIP反义寡核苷酸纳米粒的制备方法。

                          背景技术

反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides，ASODN)即为人工合成长度为10-30个碱基的DNA分子及其类似物，通过Watson-Crick碱基配对，与特定的mRNA或DNA发生特异性结合，从而抑制或封闭基因的表达，使其丧失活性，达到基因治疗的目的。c-FLIP蛋白是细胞凋亡过程中的抑制蛋白，已证实c-FLIP表达于多种肿瘤中，从而使肿瘤细胞产生凋亡障碍。c-FLIP-ASODN序列为：5′-ACT TGT CCC TGC TCCTTG AA-3′，Mr＝6 000，下划线部分为硫代修饰提高其稳定性[Bannerman DD，Tupper JC，Ricketts WA，et al.Aconstitutive cytoprotective pathway protects endothelial cells from li-popolysaccharide-induced apoptosis [J]. J Biol Chem，2001，276(18)：14924-14932.]。它可在mRNA水平抑制c-FLIP表达，从而恢复肿瘤细胞的凋亡敏感性。

眼眶横纹肌肉瘤(RMS)为儿童期最常见的原发性眶内恶性肿瘤，该肿瘤恶性度高，发展迅速，死亡率高，严重威胁患儿的生命。目前主要采取手术与放、化疗结合的综合治疗，但治疗效果不理想，预后较差。c-FLIP在RMS中高表达，而针对c-FLIP的ASODN，成为重建RMS肿瘤细胞凋亡机制的有效基因治疗方法。

然而未经包裹修饰的单纯ASODN片段为亲水性的聚阴离子，生物膜的通透性差，在体液中易受核酸酶的降解，并且对肿瘤组织缺乏靶向性，使其应用受到了限制。因此，选择安全有效的导入载体成为这项基因治疗技术开展的关键。作为非病毒类载体系统新成员的纳米粒(nanoparticles，NP)，因其稳定性远好于脂质体，且克服了病毒载体的生物毒性，原料来源广泛，安全性高，成为研究的热点。经过纳米材料包裹，可对ASODN起到保护和控释作用。尤其在各种可作为传递ASODN的纳米粒载体中，聚乳酸-聚羟乙酸(PolyD，L-lacticco-glycolic acid，PLGA)是经过美国FDA批准应用于临床的一种高分子聚合体，成为基因载体的良好选择。已有报道采用二次超声乳化和溶剂挥发技术，PLGA制备成纳米粒用于传递c-FLIP-ASODN。制备步骤简要描述如下：c-FLIP-ASODN(600μg)冻干粉适量溶于150ml超纯水中，作为水相；将适量(50mg)PLGA溶于1.5ml乙酸乙酯中，作为油相；将水相与油相混合，冰浴条件下超声乳化20s(功率20W)，形成初乳；取3ml1％PVA溶液加至初乳中，冰浴条件下再次超声乳化20s(功率20W)，形成复乳；将复乳加至30ml 0.3％PVA溶液中，37℃水浴搅拌(400r/min)挥发有机溶剂乙酸乙酯，然后用高速离心机20000r/min离心10min，收集沉淀，超纯水洗涤3次，制成冻干粉备用。[聂有华，魏锐利，李国栋等，载c-FLIP反义寡核苷酸聚乳酸-聚羟乙酸纳米粒的制备及评价。第二军医大学学报，2005，26(5)：547-550.]该方法实用有效、简便易行，但在制备过程中存在有机溶剂及聚乙烯醇(PVA)残留较多的情况，它们对正常细胞都存在一定的毒性；同时制得的纳米粒存在粒径分布范围偏广(50-150nm)、平均粒径较大(95.5nm)、载药量低(0.579％)的缺陷。

                          发明内容

本发明提供了一种有机溶剂及PVA残留少、粒径分布范围窄、平均粒径较小、载药量提高的c-FLIP反义寡核苷酸纳米粒制备的方法。本发明采用复乳-干燥法，是对上述制备方法的改进，通过对有机溶剂和分散介质的改变，增加了纳米粒使用的安全性及纳米粒粒径大小的可控性，同时载药量增加。一是有机溶剂以二氯甲烷替代了乙酸乙酯，因为二氯甲烷较乙酸乙酯的沸点低、易挥发，这样有机溶剂残留少，更加安全；二是在形成复乳的过程中分散介质以泊洛沙姆188(Poloxamer188)替代了聚乙烯醇(PVA)。Poloxamer188(Pluronic F68)是目前可用于静脉注射的水包油乳化剂之一，更为安全，且用其制备的乳剂，乳粒小，吸收率高。因此本发明采用Poloxamer188水溶液加入初乳后形成复乳，制备的纳米粒的粒径比较一致，物理性质更加稳定，平均粒径较小，载药量增加；另外，在形成复乳后，再与致孔剂PVA结合，减少了制备过程中PVA的使用与吸收，增加了使用的安全性。

具体方法为：

1.组分与配比：

c-FLIP反义寡核苷酸                  330-1650μg

聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA RG503H)  15-80mg

Poloxamer188                        0.1％-5％(w/v)

聚乙烯醇(PVA)                       0.2-0.6％(w/v)

二氯甲烷                            0.5-2.4ml

缓冲液                              75-350μl

2.制备c-FLIP反义寡核苷酸纳米粒：

(1)制备油相：按配比将PLGA溶于有机溶剂二氯甲烷制成油相，浓度为30mg～50mg/ml；

(2)制备内水相：按配比将c-FLIP反义寡核苷酸溶于缓冲液形成内水相，缓冲液可选自PBS(PH＝7.4)和TE缓冲液；

(3)制备纳米粒：将内水相加入上述油相冰浴超声乳化形成初乳，按配比将Poloxamer188水溶液加入至初乳，继续冰浴超声乳化，形成复乳，将复乳倒入PVA水溶液中，室温下继续低速搅拌4小时(搅拌速度为300～600rpm)形成纳米粒，用水洗涤，离心收集沉淀，冷冻干燥即可得纳米粒干粉。

上述制备所得的c-FLIP反义寡核苷酸纳米粒粒径圆整、大小较均匀，粒径集中分布在50-80nm内，平均65.77nm；平均包封率达到48％，平均载药量为0.697％；体外释药于第17.9天达到最终基本稳定的平台期；能有效保护寡核苷酸的水解。

                          具体实施方式

现结合实施例，对本发明作详细描述：

实施例1：复乳-干燥法制备c-FLIP反义寡核苷酸纳米粒

取反义寡核苷酸660μg溶于150ul的缓冲液中(PBS pH＝7.4)作为内水相，将50mg PLGA(RG503H)溶于1.5ml二氯甲烷中作为油相，将内水相加入到油相冰浴超声乳化20s(功率为20W)得初乳，将1％(w/v)poloxamer188水溶液3ml加入至初乳，继续冰浴超声乳化30s(功率为20W)形成复乳，将复乳倒入30ml 0.3％(w/v)的PVA水溶液中，室温下低速搅拌4小时(搅拌速度为400rpm)，挥发去除有机溶剂，离心收集纳米粒，超纯水洗涤三次，冷冻干燥，得到本发明纳米粒。

本发明制备方法所得的纳米粒粒径分布范围窄，平均粒径小，载药量大，有机溶剂挥发较彻底，吸附的PVA少，使用更为安全。