马铃薯病毒病两步法多重RT－PCR固相化检测试剂盒及其检测方法

摘要

本发明涉及两步法双重RT－PCR同步检测马铃薯Y病毒、马铃薯卷叶病毒，三重RT－PCR同步检测马铃薯X病毒、马铃薯A病毒、马铃薯S病毒的方法及检测试剂盒，是专门针对马铃薯产业影响较大的5种马铃薯病毒而建立的一种同步检测2或3种病毒的快速方法，检测时间仅用4h，且灵敏度高、特异性强、稳定可靠。该方法克服了现有对马铃薯病毒病依据症状学的常规诊断方法误判率较高、血清学方法难以检测休眠马铃薯中的病毒及病毒含量较少的韧皮部病毒—马铃薯卷叶病毒等缺点；该方法适用于马铃薯种苗、种薯多种病毒病的早期诊断，对马铃薯种薯质量监测和病毒病预防有着重要的作用。

说明书

                               技术领域

本发明涉及一种农业生物技术，具体的说，涉及一种同步扩增多种马铃薯病毒的简单、快速的固相化核酸检测试剂盒，适合于植物保护、农产品质量技术监督等部门使用。

                               背景技术

马铃薯是世界性的高产作物，我国的种植面积和产量都居世界第一位。马铃薯病毒病是马铃薯生产中的一个重要制约因素，是引起马铃薯品种退化的主要原因，严重影响了马铃薯的产量和质量。在我国，危害马铃薯的几种主要病毒和类病毒是马铃薯X病毒(简称PVX)、马铃薯Y病毒(简称PVY)、马铃薯卷叶病毒(简称PLRV)、马铃薯A病毒(简称PVA)、马铃薯S病毒(简称PVS)，其中危害最严重的病毒是PLRV、PVY。马铃薯生产中，在不同地区几种不同的马铃薯病毒病往往混合发生。马铃薯病毒病在早期常常没有症状或症状混杂，只有当病毒病发生严重时才表现一定症状，各种病毒表现的症状又很难区分，要准确鉴定马铃薯感染的病毒种类，光凭症状观察容易引起误判。目前我国马铃薯生产上普遍采用种薯脱毒技术来预防病毒病的危害，为了确保马铃薯原原种、原种的脱毒质量，准确鉴定种薯病毒病种类，马铃薯种薯生产上急需一种更为灵敏和准确的检验方法。传统的生物学检测方法对专业技术要求高，且费时费力；一般的免疫学方法难以检测含量极少的韧皮部病毒如PLRV及休眠种薯中的病毒。基于核酸分子检测的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，以下简称PCR)具有灵敏度高、特异性强、准确性好等优点，在病毒的检测上日益显示出强大的优势。由于常见马铃薯病毒大都是单链正义RNA(ssRNA)病毒，因此实际检测中需先将病毒RNA反转录后再进行PCR扩增。传统的生物学检测方法对专业技术要求高，且费时费力；一般的免疫学方法难以检测含量极少的韧皮部病毒如PLRV及休眠种薯中的病毒。基于核酸分子检测PCR技术具有灵敏度高、特异性强、准确性好等优点，在病毒的检测上日益显示出强大的优势。

本发明针对田间经常是2～3种马铃薯病毒引起复合侵染，以常规反转录聚合酶链

式反应(以下简称RT-PCR)检测需要多次操作，检测成本高；而一步法RT-PCR法检测多种马铃薯病毒，加入的多种引物之间的相互竞争性抑制作用导致检测灵敏度降低的弊病，采用两步法双重RT-PCR同步检测马铃薯Y病毒、马铃薯卷叶病毒；三重RT-PCR同步检测马铃薯X病毒、马铃薯A病毒、马铃薯S病毒，可以确保微量马铃薯病毒核酸的同步快速灵敏地检出。适用于早期鉴定马铃薯种薯原原种及原种脱毒效果，马铃薯种苗携带病毒类型的快速鉴定。利用固相化核酸两步法RT-PCR试剂盒及配套的制样、检测技术，适合田间复合侵染的马铃薯多种病毒和传毒蚜虫带毒状态的鉴定和监测，省时省力，可以降低检测成本。

通过两年田间调查及分子检测发现在重庆、四川等马铃薯种植地区，马铃薯病毒病常常2-3种病毒复合侵染，迫切需要经济方便的多重检测方法，但没有检测到PSTVd类病毒。马铃薯病毒是单链正义RNA病毒(ssRNA)，利用核酸分子检测需要首先将病毒RNA反转录为cDNA，再进行PCR扩增(RT-PCR)。已经报道的常规马铃薯病毒核酸分子检测技术在制样技术、检测对象、检测特异性以及检测体系优化等方面还存在一定的局限。目前仅国外的Rudra讨论了二重RT-PCR反转录反应中试剂浓度对PCR的影响。针对目前马铃薯病毒分子诊断试剂盒国内尚无生产、而进口的少量血清学试剂盒存在特异性差，缺少阳性对照、不能确定病毒种类等问题，合格种苗的质量检测技术难以保证，严重制约马铃薯脱毒种薯的应用和发挥其增产潜力。本研究拟通过特异性引物筛选、样品快速制备方法优化，多重RT-PCR反转录及PCR反应中的引物浓度比例、试剂浓度、反应条件优化等步骤，建立一种快速准确的多重RT-PCR分子检测技术平台，以期同时检测多种病毒，简化操作程序，降低检测成本，并为开发马铃薯快速、简便、灵敏、特异性强的检测试剂盒奠定基础。

                               发明内容

本发明的目的旨在克服上述现有技术的不足，提供一种马铃薯病毒病两步法多重RT-PCR固相化检测试剂盒及其检测方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：

1.引用现有技术中马铃薯病毒检测的寡核苷酸引物，包括：

寡核苷酸引物对：5’-TAGCACAACACAGGCCACAG-3’

                5’-GGCAGCATTTCAGCTTC-3’(序号：NO.1)；

寡核苷酸引物对：5’-ACGTCCAAAATGAGAATGCC-3’

                5’-TGGTGTTCGGTGATGTGACCT-3’(序号：NO.2)；

寡核苷酸引物对：5’-CGCGCTAACAGAGTTCAGCC-3’

                5’-GCAATGGGGGTCCAACTCAT-3(序号：NO.3)；

寡核苷酸引物对：5′-GTTGGAGAATTCAAGATCCTGG 3′

                5′-TTTCTCTGCCACCTCATCG 3′(序号：NO.4)

寡核苷酸引物对：5’-TGGCGAACACCGAGCAAATG-3’

                5’-ATGATCGAGTCCAAGGGCACTG-3’(序号：NO.5)。

其中NO.1用于扩增马铃薯X病毒，扩增产物大小为562bp；NO.2用于扩增马铃薯Y病毒，扩增产物大小为480bp；NO.3用于扩增马铃薯卷叶病毒，扩增产物大小为336bp；NO.4用于扩增马铃薯A病毒，扩增产物大小为255bp，NO.5用于扩增马铃薯S病毒，扩增产物大小为187bp。

2.制备用于田间复合侵染的马铃薯Y病毒(简称PVY)和马铃薯卷叶病毒(简称PLRV)的同步反转录两步法双重RT-PCR固相化试剂盒，由以下各种检测试剂组成：

样品病毒RNA提取试剂，

病毒RNA反转录固相化试剂，

cDNA扩增固相化试剂，

无害化PVY和PLRV阳性对照品，

健康马铃薯植株阴性对照品；

其关键是，所述样品病毒RNA提取试剂是0.4～0.5％曲拉通X-100与0.35～0.45％NaSO₃在常温下的混合物；所述无害化PVY和PLRV阳性对照品由如下步骤制得：

(1)种马铃薯Y病毒、马铃薯卷叶病毒于健康马铃薯植株上，

(2)提取马铃薯Y病毒和马铃薯卷叶病毒复合侵染后的病毒RNA，

(3)设计扩增5种马铃薯病毒的上下游引物，上游引物的特征是5’端带有T7启动子序列，

(4)行双重RT-PCR扩增得PVY、PLRV DNA片段混合物，

(5)PVY、PLRV DNA片段混合物为模板转录得PVY、PLRV RNA片段混合物；

所述病毒RNA反转录固相化试剂、cDNA扩增固相化试剂分别是固相化混合物冻干胶珠；其中，病毒RNA反转录固相化试剂由双重RT-PCR同步反转录马铃薯Y病毒和马铃薯卷叶病毒组成，该试剂中含有如下组分：

组分                                    终浓度

5x反转录缓冲液                          1X，

25mM MgCl₂                             3mmol/L，

25mM dNTPs                              1.0～1.5mmol/L，

40U/μL RNA酶抑制剂                     5～10Unit/10uL，

200U/μL MMLV反转录酶                   50～100Unit/10uL，

25μM PVY∶PLRV反义引物                 0.30～0.50∶0.70～0.90，

25ng/μL待测样品或RNA模板               1.0～2.5μL，

生物大分子稳定剂                               加至10μL，

所使用的反义引物为寡核苷酸引物对：

        5’-ACGTCCAAAATGAGAATGCC-3’

        5’-TGGTGTTCGGTGATGTGACCT-3’(序号No.2)，

和寡核苷酸引物对：5’-CGCGCTAACAGAGTTCAGCC-3’

                  5’-GCAATGGGGGTCCAACTCAT-3；(序号No.3)；

cDNA扩增固相化试剂由同步扩增马铃薯Y病毒和马铃薯卷叶病毒cDNA的二重PCR反应组成，该试剂中含有如下组分：

组分                                        终浓度

10x PCR缓冲液                               1X，

25mM MgCl₂                                 2.0～2.5mmol/L，

25mM dNTPs                                  0.4～0.5mmol/L，

5U/μL Taq热启动聚合酶                      1.5～2.5Unit/25uL，

25ng/μl PVY∶PLRV(上下游引物对)            0.30～0.40∶0.15～0.30，

生物大分子稳定剂                            加至21μL，

所使用的引物为寡核苷酸引物对：

            5’-ACGTCCAAAATGAGAATGCC-3’

            5’-TGGTGTTCGGTGATGTGACCT-3’(序号：NO.2)，

和寡核苷酸引物对：5’-CGCGCTAACAGAGTTCAGCC-3’

                  5’-GCAATGGGGGTCCAACTCAT-3(序号：NO.3)，

反转录合成的cDNA 4μL作为PCR反应的模板。

3、制备用于田间复合侵染的马铃薯病毒X病毒(简称PVX)、马铃薯A病毒(简称PVA)、马铃薯S病毒(简称PVS)的同步反转录两步法三重固相化RT-PCR试剂盒，由以下各种检测试剂组成：

样品病毒RNA提取试剂，

病毒RNA反转录固相化试剂，

cDNA扩增固相化试剂，

无害化PVX、PVA和PVS阳性对照品，

健康马铃薯植株阴性对照品；

其关键是，所述样品病毒RNA提取试剂是0.4～0.5％曲拉通X-100与0.35～0.45％NaSO₃在常温下的混合物；所述无害化PVX、PVA和PVS阳性对照品由如下步骤制得：

(1)接种马铃薯X病毒，马铃薯A病毒，马铃薯S病毒于健康马铃薯植株上，

(2)提取马铃薯病毒X病毒、马铃薯A病毒、马铃薯S病毒复合侵染后的病毒RNA，

(3)设计扩增5种马铃薯病毒的上下游引物，上游引物的特征是5’端带有T7启动子序列，

(4)进行三重RT-PCR扩增得PVX、PVA、PVS DNA片段混合物，

(5)以PVX、PVA、PVS DNA片段混合物为模板转录得PVX、PVA、PVS RNA片段混合物，用作三重RT-PCR的无害化阳性对照；

所述病毒RNA反转录固相化试剂、cDNA扩增固相化试剂分别是固相化混合物冻干胶珠；其中，病毒RNA反转录固相化试剂由同步反转录三重RT-PCR马铃薯Y病毒和马铃薯卷叶病毒组成，该试剂中含有如下各种组分：

组分                                  终浓度

5X反转录缓冲液                        1X，

25mM MgCl₂                           3mmol/L，

25mM dNTPs                            1.5～2.0mmol/L，

40U/μL RNA酶抑制剂                   5.0～10.0Unit/10uL，

200U/μL MMLV反转录酶                 50～100Unit/10uL，

25μM PVX∶PVA∶PVS引物               0.30～0.40∶0.80～1.00∶0.80～1.00，

25ng/μL无害化阳性对照品              1.0～2.5μL，

25ng/μL待测样品或RNA模板             1.0～2.5μL，

生物大分子稳定剂                      加至10μL，

所使用的引物为寡核苷酸引物对：

                5’-TAGCACAACACAGGCCACAG-3’

                5’-GGCAGCATTTCAGCTTC-3’(序号：NO.1)，

和寡核苷酸引物对：5′-GTTGGAGAATTCAAGATCCTGG 3′

                  5′-TTTCTCTGCCACCTCATCG 3′(序号：NO.4)，

和寡核苷酸引物对：5’-TGGCGAACACCGAGCAAATG-3’

                  5’-ATGATCGAGTCCAAGGGCACTG-3’(序号：NO.5)；

cDNA扩增固相化试剂由同步扩增马铃薯X病毒、马铃薯A病毒和马铃薯S病毒cDNA三重PCR反应组成，该试剂中含有如下组分：

组分                                      终浓度

10x PCR缓冲液                             1X，

25mM MgCl₂                               2.5～3.0mmol/L，

25mM dNTPs                            0.4～0.5mmol/L，

5U/μL Taq热启动聚合酶                1.5～2.5Unit/25μL，

25ng/μL PVX∶PVA∶PVS                0.35～045∶0.15～0.25∶0.10～0.20，

生物大分子稳定剂                      加至21μL，

所使用的引物为寡核苷酸引物对：

                    5’-TAGCACAACACAGGCCACAG-3’

                    5’-GGCAGCATTTCAGCTTC-3’(序号：NO.1)，

和寡核苷酸引物对：5′-GTTGGAGAATTCAAGATCCTGG 3′

                  5′-TTTCTCTGCCACCTCATCG 3′(序号：NO.4)，

和寡核苷酸引物对：5’-TGGCGAACACCGAGCAAATG-3’

                  5’-ATGATCGAGTCCAAGGGCACTG-3’(序号：NO.5)，

反转录合成的cDNA 4μL作为PCR反应的模板。

本发明所述病毒RNA反转录固相化试剂、cDNA扩增固相化试剂的固相化混合物冻干胶珠是利用生物大分子稳定剂经真空冷冻干燥制备而成的可以常温贮运的PCR扩增固相化混合物冻干胶珠。而生物大分子稳定剂由重量体积比为0.05-0.1％明胶、0.1～0.2％多糖、0.02～0.05％BAS，其余为纯净水混合而成。

4、提供用于马铃薯多种病毒RNA提取方法，按以下步骤进行：

(1)配制马铃薯病毒RNA专用浸提液，即试剂盒中的样品病毒RNA提取试剂，它由0.4～0.5％曲拉通X-100与0.35～0.45％ NaSO₃在常温下与无RNA酶的灭菌纯化水混合溶液；

(2)在100μL马铃薯病毒RNA浸提液中分别加入样品马铃薯植株的叶片5～10mg、叶梗20～30mg、茎干30～40mg或块茎50～60mg于37℃下进行浸提30min；

(3)10000r/min离心10min，取上清直接用于RT-PCR。

5、在具备上述1、2、3、4、条件的情况下，提供一种同步检测多种马铃薯病毒的多重RT-PCR检测方法，其步骤如下：

(1)根据马铃薯病毒的特异序列设计设计马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯卷叶病毒、马铃薯A病毒、马铃薯S病毒特异性引物对，该引物分别是第1点所述引物；

(2)采用简易浸提法快速提取马铃薯多种病毒RNA(即第4点所述方法)，同时加入PCR反应抑制因子解除剂；该解除剂以重量份数0.3-0.5％NaSo₃，0.01-0.1％Triton X-100，与适量无RNA酶的灭菌纯水，在常温下混合搅拌所得溶液；

(3)对于双重RT-PCR，加入马铃薯Y病毒、马铃薯卷叶病毒特异性下游引物及反转录反应组分进行反转录合成cDNA；

(4)对于三重RT-PCR，加入马铃薯X病毒、马铃薯A病毒、马铃薯S病毒特异性下游引物及反转录组分进行反转录合成cDNA；同时做好阳性对照和阴性对照；病毒RNA反转录固相化试剂；

(5)将反转录合成的cDNA作为模板，双重RT-PCR分别加入马铃薯Y病毒、马铃薯卷叶病毒特异性引物对及PCR反应组分进行PCR扩增；三重RT-PCR分别加入马铃薯X病毒、马铃薯A病毒、马铃薯S病毒特异性引物对及PCR反应组分进行PCR扩增；同时做好阳性对照和阴性对照定量品；即试剂盒中cDNA扩增固相化试剂。

(6)将扩增产物进行凝胶电泳，GV荧光染料显色后，在凝胶成像仪上照相。

本发明经实验获得显著成功，其部分实验及检测数据请见图1、图2和表1。

由图1可知，应用双重RT-PCR检测带有马铃薯病毒PVX和PVY或PVA和PLRV；表明检测体系特异、灵敏。

由图2可知：应用三重RT-PCR检测带有马铃薯病毒PVX，PVS和PVA；表明三重检测体系准确和特异。

表1是马铃薯病毒RT-PCR实际检测结果。

由表1可看出，采用RT-PCR技术对不同来源的部分马铃薯样品进行实际检测，结果表明本发明所提出的方法具有特异性强，灵敏度高，准确性好的特点。

表1 马铃薯病毒RT-PCR实际检测

   马铃薯样品   样品来源   马铃薯品种  样品   数量                    马铃薯病毒   PVX  PVA  PVS  PVY  PLRV  脱毒种薯  重庆武隆  鄂薯3号  9  1  0  3  0  0   重庆永川   中薯3号   中薯2号   3    0    0    0    0    0   重庆巫山  鄂薯3号  1  0  0  0  0  0  重庆江津  中薯2号  2  0  0  0  0  0  重庆渝  北   中薯3号   9   0   0   0   0   0   组培苗  重庆渝北   鄂薯3号   39   0   0   0   0   0   四川雅安  中薯3号  34  0  2  0  0  0  脱毒组培苗  重庆渝北  鄂薯3号  6  0  0  1  0  0  大田种薯植株  重庆永川  中薯2号  25  0  0  0  14  0  四川雅安  中薯3号  14  0  0  0  6  0  重庆渝北  川渝4号  30  10  0  12  0  0  大田种薯植株  重庆渝北  大田常规品种  44  6  12  15  5  10

采用上述技术方案，本发明突出的技术进步在于：

1、可以同步检测马铃薯Y病毒和马铃薯卷叶病毒的固相化试剂盒和两步法三重RT-PCR同步检测马铃薯X病毒、马铃薯A病毒、马铃薯S病毒的试剂盒；

2、本发明以分子检测为基础，利用RNA简易快速浸提技术和多重RT-PCR技术，只需微量材料即可对多种马铃薯病毒直接进行RT-PCR检测，突出的优点就在于快速、灵敏度高、特异性强、所需检测材料少，克服了现有的对马铃薯病毒病依据症状学的常规诊断方法误判率高、传统的生物学检测方法费时费力、一般的免疫学方法难以检测含量极少的韧皮部病毒如PLRV及休眠种薯中的病毒等缺陷，以及一步法多重RT-PCR灵敏度低、不稳定的缺点。

3、由于本发明在灵敏度和特异性方面的特长及同时可检测2-3种马铃薯病毒，因此特别适合于早期快速鉴定马铃薯种薯原原种及原种带毒情况以及马铃薯叶片、叶梗、茎干和块茎样品中病毒类型的快速鉴定。

4、两步法多重RT-PCR检测技术及固相化试剂盒尤其适合田间复合侵染的马铃薯多种病毒和传毒蚜虫带毒状态的鉴定和监测，并省时省力，可以降低检测成本。

5、由于本发明RNA提取时间短，缩短了病毒的检测时间，现在利用原始材料进行RT-PCR检测只需要4-6小时，特别适合于马铃薯原原种、原种种苗进行脱毒检验，以确保组培马铃薯种苗的质量。

综上所述，采用本发明，能对马铃薯种薯种苗和田间调查过程中所获得的各种材料进行马铃薯病毒病分子生物学鉴定或检测，对马铃薯脱毒种苗的生产和质量监督具有重要作用。

附图说明

图1是应用双重RT-PCR扩增马铃薯病毒PVX和PVY；PVA和PLRV对照图，其中1列：100bp DNA片断大小标准；2列：空白对照；3-4列：PVX和PVA；5列：空白对照；6-7列：PVY and PLRV；8列：阴性对照。

图2是三重RT-PCR扩增马铃薯病毒检测图，其中1列：100bp DNA片断大小标准；2-5列：RT-PCR检测PVX，PVA和PVS；6列：阴性对照。

                             具体实施方式

实施例一、两步法二重RT-PCR同步检测马铃薯Y病毒、马铃薯卷叶病毒固相化检测试剂盒及检测方法。

一、固相化检测试剂盒的组分：

样品病毒RNA提取试剂，PVY、PLRV病毒RNA反转录固相化试剂，cDNA扩增固相化试剂，无害化PVY、PLRV阳性对照，健康植株阴性对照。

二、固相化试剂盒的制备：

1、检测方法包括如下步骤：

1)提取病毒RNA：配制马铃薯病毒RNA专用浸提液(是0.5％曲拉通X-100与含终浓度0.4％ NaSO₃在常温下与适量无RAN酶的纯净水的混合液)；取出待检马铃薯样品，在100μL马铃薯病毒RNA浸提液中分别加入样品马铃薯植株的叶片10mg、叶梗30mg、茎干40mg或块茎60mg于37℃下进行浸提30min；10000r/min离心10min，取上清液直接用于反转录聚合酶链式反应。在加温37℃时混合，搅拌5分钟所得溶液；

2)设计两对引物：一对寡核苷酸引物用于扩增马铃薯Y病毒：5’-

ACGTCCAAAATGAGAATGCC-3’，5’-TGGTGTTCGGTGATGTGACCT-3’(序号：NO.2)；另一对寡核苷酸引物用于扩增马铃薯卷叶病毒：5’-CGCGCTAACAGAGTTCAGCC-3’，5’-GCAATGGGGGTCCAACTCAT-3(序号：NO.3)；

3)加入NO.2和NO.3中的下游引物于反转录反应体系中，反转录反应体系为：1×反转录反转录反应缓冲液是3mmol/L MgCl₂，1.5mmol/L dNTPs，10U RNA酶抑制剂，100U MMLV反转录酶，反义引物PVY∶PLRV为0.50∶0.90，提取的病毒RNA2.5μL，生物大分子稳定剂0.4％明胶、0.2％多糖、0.05％BAS、无RNA酶的超纯水补足至10uL。将反应体系混合离心后再置于PCR扩增仪(Bio-Rad，USA)进行PCR反应，反应用水作空白对照，用无害化PVY和PLRV病毒RNA作阳性对照，用健康马铃薯植株作阴性对照。反应程序为反转录反应：25℃ 10min，42℃ 1h，95℃ 5min。

4)加入NO.2和NO.3引物对于PCR反应体系中，PCR扩增反应体系为：4μL反录录合成的cDNA作为PCR反应模板，1×PCR缓冲液，2.5mM/L MgCl₂，0.5mM/L dNTPs，Taq DNA聚合酶2.5U，正义反义引物对PVY∶PLRV为0.40∶0.30；生物大分子稳定剂0.05％明胶、0.1％多糖、0.03％BAS、去离子水补足至25uL。将反应体系混合离心后再置于定量PCR扩增仪(Bio-Rad，USA)进行PCR反应，PCR扩增程序为94℃变性1min，60℃复性1min，72℃延伸1min；共30个循环，最后72℃ 10min。

5)扩增产物检测：扩增反应结束后，取10μl扩增产物加1μl含溴酚蓝的上样缓冲液，用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，缓冲液为1×TAE，100V电泳30min，GV荧光染色，DNA片段大小标准采用100bp DNA ladder。凝胶成像系统观测电泳结果并照相记录。

2、检测结果：

若检测到以马铃薯病毒病RNA为模板的阳性对照有靶带产生，阴性对照和空白对照没有靶带产生，而样品的检测结果与阳性对照的靶带大小一致，即产生480bp大小的带则是PVY病毒，产生336bp大小的带为PVY，若同时产生480bp、336bp的带，则为PVY，PLRV复合侵染。如图1，图2所示。

实施例二、两步法三重RT-PCR同步检测马铃薯X病毒、马铃薯A病毒、马铃薯S病毒固相化检测试剂盒及检测方法。

一、固相化检测试剂盒的组分：

样品病毒RNA提取试剂，PVX、PVA、PVS病毒RNA反转录固相化试剂，cDNA扩增固相化试剂，无害化PVX、PVA、PVS阳性对照，健康植株阴性对照。

二、固相化试剂盒的制备：

1、检测方法包括如下步骤：

1)提取病毒RNA：配制马铃薯病毒RNA专用浸提液(是0.5％ Triton X-100与含终浓度0.4％ NaSO₃在常温下与适量无RAN酶的纯净水的混合液)；取出待检马铃薯样品，在100μL马铃薯病毒RNA浸提液中分别加入样品马铃薯植株的叶片5mg、叶梗20mg、茎干30mg或块茎50mg于37℃下进行浸提30min；10000r/min离心10min，取上清液直接用于反转录聚合酶链式反应。

2)设计两对引物：一对寡核苷酸引物用于扩增马铃薯X病毒：5’-TAGCACAACACAGGCCACAG-3’，5’-GGCAGCATTTCAGCTTC-3’(序号：NO.1)；一对寡核苷酸引物用于扩增马铃薯A病毒：5′-GTTGGAGAATTCAAGATCCTGG 3′，5′-TTTCTCTGCCACCTCATCG 3′(序号：NO.4)；另一对寡核苷酸引物用于扩增马铃薯S病毒：5’-TGGCGAACACCGAGCAAATG-3’，5’-ATGATCGAGTCCAAGGGCACTG-3’(序号：NO.5)。

3)加入NO.1、NO.4和NO.5中的下游引物于反转录反应体系中，反转录反应体系为：1×反转录反应缓冲液即3mmol/L MgCl₂，1.5mmol/L dNTPs，5U RNA酶抑制剂，50～100U MMLV反转录酶，反义引物PVX∶PVA∶PVS为0.40∶0.80～1.00∶0.80，提取的病毒RNA 1μL，生物大分子稳定剂0.08％明胶、0.2％多糖、0.02％BAS、无RNA酶的超纯水补足至10uL。将反应体系混合离心后再置于PCR扩增仪(Bio-Rad，USA)进行PCR反应，反应用水作空白对照，用无害化PVX、PVA和PVS病毒RNA作阳性对照，用健康马铃薯植株作阴性对照。反应程序为反转录反应：25℃ 10min，42℃ 1h，95℃ 5min。

4)加入NO.1、NO.4和NO.5引物于PCR反应体系中，PCR扩增反应体系为：4μL反转录合成的cDNA作为PCR反应模板，1×PCR缓冲液，2.5mmol/L MgCl₂，0.4mmol/L dNTPs，Taq DNA聚合酶1.5U，正义反义引物对PVX∶PVA∶PVS为0.35∶0.15∶0.10；生物大分子稳定剂0.1％明胶、0.2％多糖、0.04％BAS、去离子水补足至25uL。将反应体系混合离心后再置于PCR扩增仪(Bio-Rad，USA)进行PCR反应，PCR扩增程序为94℃变性1min，60℃复性1min，72℃延伸1min；共30个循环，最后72℃ 10min。

5)扩增产物检测：扩增反应结束后，取10μl扩增产物加1μl含溴酚蓝的上样缓冲液，用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，缓冲液为1×TAE，100V电泳30min，GV荧光染色，采用100bp DNA ladder作为DNA片段大小标准。凝胶成像系统观测电泳结果并照相记录。

检测结果判定：

若检测到以马铃薯病毒病RNA为模板的阳性对照有靶带产生，阴性对照和空白对照没有靶带产生，而样品的检测结果与阳性对照的靶带大小一致，即产生562bp大小的带则是PVX病毒，产生255bp大小的带为PVA，产生187bp大小的带为PVS，若同时产生562bp、255bp和187bp大小的带，则为PVX、PVA和PVS复合侵染。