农药对捕食性天敌体内消化酶活性的快速检测方法

摘要

本发明公开了一种农药对捕食性天敌体内消化酶活性影响的快速检测方法，即压电石英阻抗分析法。该方法是一个由网络/频谱/阻抗分析仪、电子计算机和金电极等组成的检测架，在农药的影响下，对捕食性天敌体内消化酶活性进行快速检测。利用本方法实时动态监测拟环纹豹蛛中肠蛋白消化酶对酪蛋白的酶促水解过程及三大类农药对酶活性的影响，结果表明这三大类农药的合适低剂量可显著地增强蛋白消化酶的活性，较高剂量地农药可显著抑制蛋白酶的活性，且水解过程稳态频移值可准确地反映酶活性与农药浓度的关系，证实该法比传统的紫外光光度分析法优势明显，可广泛用于生物酶的活性检测。同时低剂量农药对天敌的保护与利用及害虫防治上有广泛的应用前景。

说明书

[技术领域]

本发明涉及利用低剂量的农药(有机磷类、有机氯类、菊酯类)增强蜘蛛等捕食天敌的控虫潜能，以及蜘蛛等捕食天敌体内消化酶活性的快速检测方法——压电石英阻抗分析法，属于生物技术领域。

[背景技术]

长期以来，大多的人只考虑到施用农药对环境污染及对天敌杀害的副作用，忽视了它存在的合理性。本发明人通过多年的探索，发现施用低剂量的化学农药既增强了天敌的控虫力，同时又不会导致环境和粮食的污染，因为这些低剂量的农药不会超出生态系统的“弹性限度”，通过生态系统的自身调节作用，生物体的生物转化及其生物修复作用，完全能把这些小剂量的有毒物质分解成无毒物质。其主要机理是：低剂量农药增强了蜘蛛等天敌体内消化酶的活性和抑制了其体内乙酰胆碱酯酶的活性，从而增强了蜘蛛的消化能力及其神经系统的兴奋性，增加了蜘蛛等天敌控制害虫的潜能，因此低剂量农药在农田生态系统中具有较大的应用潜力。同时，在生物学领域创建了一种快速检测酶活性的新技术——压电石英阻抗分析法，该技术与其它的压电技术不同，不需要把酶固定在金电极上，在液相中压电传感器能灵敏地对溶液的粘密度有较好的响应特性，且反应液采用合适pH值的磷酸缓冲液配制，不受反应过程中pH值变化的影响。与传统的酶活性检测方法相比，如分光光度法、化学发光法等，检测灵敏、快速，不需使用有毒试剂，且能提供反映所研究体系的一些物理或化学性质变化的多维动态信息。

[发明内容]

本发明目的是维持农田生态系统平衡，生产无公害绿色食品，配制各类农药的最适低剂量洒于稻田，充分挖掘和发挥蜘蛛等天敌的控虫潜能。同时提供一种灵敏度高，操作简便，不需把酶固定在金电极上，能现场提供反映所研究体系的一些物理或化学性质变化的多维动态信息，能全面、实时的对变化过程进行在线监测和分析体内消化酶活性的快速检测方法。

本发明的目的是这样实现的：本发明人在主持国家自然科学基金项目研究期间，发现低剂量的化学农药能大大地增强蜘蛛等捕食性天敌的控虫效能，并试图构建一种蜘蛛等捕食性天敌体内酶活性的快速检测方法，经较长时间的研究认为，压电石英阻抗分析法是一种能实现发明目的的快速检测法。具体步骤是：

1、最适低剂量农药的选择

所谓低剂量农药是指不杀死天敌也很难杀死害虫的小剂量的化学农药。首先把各类农药(有机磷类、有机氧类、菊酯类等)配制成系列的低剂量浓度，通过在不施农药时，蜘蛛的控虫力测定试验；对害虫施药，蜘蛛不施药，蜘蛛的控虫力测定试验；对蜘蛛施药、害虫不施药时，蜘蛛的控虫力试验和对蜘蛛和害虫同时施药时，蜘蛛的控虫力测定试验。筛选出增强蜘蛛控虫力的最适低剂量浓度。现已筛选出增强狼蛛类的控虫力的最适的甲胺磷(50％)、杀虫双(18％)和烯丙菊酯(0.3％)的最适低剂量浓度分别为原药∶水等于2∶5000、12∶5000和1∶5000。

2、酶液提取

在体视显微镜下于冰浴中解剖已经用低剂量农药和高剂量农药处理的蜘蛛，取其中肠和消化腺，用一定体积pH8.0的磷酸缓冲液在冰浴中研磨匀浆，匀浆液在0～4℃下用4000×g离心15min，取上清液测定消化酶的活力。也可解剖未经农药处理的蜘蛛，按上述方法得到离体的酶液，然后在酶的活性检测时，加一定量的最适低剂量浓度的农药，检测农药对酶活力的影响。

3、酶液的总蛋白含量测定：采用考马斯亮蓝G250法测定，牛血清白蛋白为标准蛋白。

4、酶液的活性检测设备和材料的准备：

本检测方法所需设备是：一台网络/频谱/阻抗分析仪(型号HP4395)和一台与之相连的电子计算机(型号IBM166MMX)、一个玻璃池及一面镀金一面镀银的压电石英晶体，该晶体镀金的一面作为金电极没入反应液，接入阻抗测试架的地端作为工作电极，另一面露于空气中的银电极接入阻抗分析架的非地端。玻璃池内设有一个搅拌子，玻璃池外设有控温器，把玻璃池放入控温器中，然后将两者放在磁振动器上振动。因为网络/频谱/阻抗分析仪可同步测量压电石英晶体(PQC)谐振的电导(G)与电纳(B)谱，通过HP82341C高性能HP-IB接口卡用专用程序控制阻抗分析仪获得导纳数据，运用Gauss-Newtin非线性最小二乘法实时拟合每组G与B数据并完成导纳数据和其他等效电路参数分析。采用AT——切MHz的单面触液压电石英晶体，单面触液型镀金一面的金电极没入反应液，银电极露于空气中。用常规的合适体积的玻璃检测池，电磁搅拌器恒速搅拌。温控装置为恒温水套与超级恒温槽以及WM2K-1型温度自动控制仪，检测过程中温度均控制在27.5～28.5℃。

5、消化酶的压电阻抗分析

1mol/L PH7.5的PBS缓冲液2.5ml和0.2ml 0.5％的专一性底物(如酪蛋白、淀粉、橄榄油等)注入检测池中，一段时间后得到稳定的信号值，分别记为初始谐振频率(f₀₁)、动态电阻(R₁₁)、动态电感(L₁₁)和静态电容(C₀₁)作为参比值。接着，同时注入0.2ml的酶液到检测池引发反应，记录时间(t)并同步采集各电路参数信号值(即f₀、R₁、L₁、C₀)，得到整个过程的相应信号变化(即Δf₀＝f₀-f₀₁)、ΔR₁＝R₁-R₁₁、ΔL₁＝L₁-L₁₁、ΔC₀＝C₀-C₀₁)随时间的关系曲线。反应完毕后，这些参数又会维持一个相对稳定的状态，此时被记为f₀₂、R₁₂、L₁₂，则相应的终点变化值分别为Δf_m(＝f₀₂-f₀₁)、ΔR_M(＝R₁₂-R₁₁)、ΔL_m(＝L₁₂-L₁₁)和ΔC_m(＝C₀₂-C₀₁)。通过其中的频率变化就可实现对消化酶水解底物过程的实时监测，即由Δf-t曲线即可得到酶促反应的初速度V(Δf/t)。

6、将测定的参数信息动态送入计算机，在专用程序控制下，经运算并打印出相应的曲线图，供研究人员分析。

本发明所用压电石英晶体阻抗的工作原理是：

压电石英晶体传感器主要利用其谐振/振荡体声波在液相中的微米级距离传播，可感电极表面纳克级的质量变化，故也称为石英晶体微天平或压电体声波传感器。在AT切压电体声波液相定量传感理论中，有如下两个重要方程，其中式(1)为Sauerbrey方程描述质量效应，而式(2)为Martin方程描述牛顿型液体负载导致的净粘密度效应。

$>>\Delta f>0>=>>>Fog>2>>>>(>>\rho >Q>>>\mu >Q>>)>>>1>/>2>>>>·>>\Delta m>A>>=>->2.264>>>>\times >10>>>->6>>>>>f>og>>2>>>\Delta m>A>>->->->>(>1>)>>>s>$

式中f_og为晶体基频(H_z)，A为压电活性面积(cm²)，μ_Q和ρ_Q分别为石英剪切模量和密度。

$>>\Delta >>R>>1>L>>>=>->4>x>>L>Q>>\Delta >>f>01>>>f>>\mu >Q>\; >/>>>f>og>>ver>>C>‾>>66>\; >\approx >->4>\pi >>L>Q>>\Delta >>f>01>>->->->>(>2>)>>>s>$

式中Δf_o1和ΔR_1L分别为液相负载变化时晶体谐振频率(f₀)和动态电阻(R₁)的响应，f为谐振区中心频率，C₆₆为压电晶体的弹性常数，L_Q为晶体在空气中的动态电感。

而消化酶对底物的水解作用是将蛋白质、淀粉、脂肪类大分子底物分解成氨基酸、单糖和脂肪酸等小分子的产物，溶液的粘密度在反应过程中发生明显的变化，因此可通过压电体声波传感器的谐振频率与酶促反应液的粘密度的关系，即基于压电传感器对溶液粘密度变化的实时响应来检测消化酶的活性大小。

本发明的有益效果是：①本发明采用压电体声波阻抗分析法动态监测生物体内消化酶对底物的酶促水解过程及有毒物质(如农药、有机磷类、有机氯类和菊酯类)对酶活性的影响，与传统的紫外分光光度分析法相比，灵敏度高，优势明显，在计算机的参与下，能反映所研究体系的一些物理和化学性质的多维动态信息，能全面、实时的对变化过程进行在线监测和分析。用本发明所述方法检测三大农药对生物体内消化酶的活性影响，准确、迅速的得出如下结论，即：上述三大农药的合适低剂量可显著地增强消化酶的活性，较高剂量的农药可显著抑制消化酶的活性，这为人们正确使用农药，利用天敌控制害虫，充分发挥天敌的控虫效能，降低农作物的生产成本，减少农产品的农药残留量都有积极作用。②本发明方法所用设备少，操作简便、快捷、检测成本低，因此便于推广应用。③最适低剂量农药可广泛应用于农业生产中，对保护和利用天敌，充分发挥天敌控虫潜能，生产无公害食品，减少其副作用及协调生防和化防的关系，都具有积极的意义。

[附图说明]

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是本发明所用仪器装置的结构示意图。

图2是没有农药时四个压电参数对时间的关系图。

图3是不同甲胺磷农药浓度下的频率变化时间曲线。

其中农药浓度分别为：1为2∶5000，2为0，3为4∶5000，4为5∶5000，5为8∶5000。

图4是不同有机氯农药(杀虫双)浓度下的频率响应对时间的曲线。

图5是不同菊酯类(烯丙菊酯)浓度下的频率响应对时间的曲线。

[具体实施方式]

实施例：用压电石英阻抗分析法动态监测拟环纹豹蛛中肠蛋白消化酶对酪蛋白的酶促水解过程及三大类农药对酶活性的影响，具体步骤如下：

①试验设备和条件的准备，参照附图1：选择一台HP4395A网络/频谱/阻抗分析仪(1)与一台IBM166MMx计算机(2)相连，在阻抗分析仪(1)的输入端通过管道(9)连至玻璃池(3)内，玻璃池内设有反应液(6)，反应液中设有一面镀金一面镀银的压电石英晶体(4)，镀金的一面金电极没入反应液中，镀银的一面电极露于空气中，玻璃池内的底部设有一个搅拌子(5)，玻璃池外设有控温器(8)，玻璃池外的底部设有磁性搅拌器(7)，把玻璃池放入控温器中，然后将两者放在磁搅拌器上振动。

①实验材料的准备

稻田蜘蛛为拟环纹豹蛛雌成蛛，从无农药污染的生物防治田中采集，活体带回实验室饲养备用。

低剂量农药的配制：将甲胺磷按原药与水之比配成2∶5000、4∶5000、5∶5000和8∶5000四个浓度；将杀虫双按原药与水之比配成28∶5000、14∶5000、12∶5000、10∶5000和8∶5000五个浓度；将烯丙菊脂按原药与水之比配成6∶20、4∶20、3∶20、2∶20和1∶20五个浓度。

②实验方法

取2-3头已饥饿48h的拟环纹豹蛛雌成蛛，然后在体视显微镜下于冰浴中解剖，取其中肠，用2mlpH8.0的磷酸缓冲液在冰浴中研磨匀浆，匀浆在0～4℃下用4000×g离心15min，取上清液测定酶的活力；

测定蛋白质含量：采用考马斯亮蓝G250法测定，以牛血清白蛋白为标准蛋白。

③消化酶的压电阻抗分析

用前述的压电阻抗分析法，动态监测拟环纹豹蛛中肠蛋白的酶促水解过程及三大类农药(有机磷类、有机氯类和菊酯类)对酶活性的影响，并将动态过程中的变化信息送入计算机，在专用程序处理下，输出相应的图象或曲线。下面是经计算机处理后输出的分析结果曲线：

图2所示，曲线显示了在酪蛋白溶液(0.5％)中滴加一定量蜘蛛中肠蛋白消化酶后(无农药作用)PQC等效电路参数(Δf₀、ΔR₁、ΔC₁、ΔL₁)随时间的变化情况。可见，酶的加入导致了Δf₀的急剧上升，然后慢慢的继续上升，最后达到一个相对稳定的值(Δf_m)，然而与此同时，ΔR₁与ΔL₁则呈现出相反的变化态势，ΔC₁却有一个较小的上升趋势。Δf₀主要由酪蛋白与蜘蛛中肠蛋白消化酶作用后产生的粘密度效应所引起；ΔR₁的变化暗示了随着蛋白消化酶的加入，酪蛋白被分解为小分子的氨基酸，即溶液粘密度的减少而导致R₁变小；ΔC₁主要由蛋白消化酶的滴入把酪蛋白分解为两性电解质的氨基酸，增大了溶液的介电性质而引起。在后续在三大类杀虫剂的系列低剂量农药作用下，其PQC等效电路参数(Δf₀、ΔR₁、C₁和ΔL₁)随时间的变化情况类同。

图3所示，在蛋白水解酶——酪蛋白体系中加入系列低剂量的有机磷类甲胺磷杀虫剂后，PQC的Δf₀-t响应曲线发生了显著的变化：

在原药∶水＝2∶5000的作用下，响应曲线向左移，斜率与幅度明显增加，加速了频率上升，增大了酶的反应速度；在4∶5000农药浓度的作用下，在0～8min时间内，曲线左移，曲线斜率增大，加速了频率上升，但在反应8min以后，曲线明显右移，上升的斜率和幅度明显减少，酶促反应速度明显减慢。这说明合适低剂量的有机磷农药能提高蜘蛛中肠蛋白消化酶的活性，稍大剂量则抑制其活性，并随农药浓度的增大，抑制程度相应增强，蛋白消化酶的作用是：蛋白质+蛋白消化酶→蛋白质-酶复合物→小肽或氨基酸。最适低剂量的甲胺磷(2∶5000)能提高酶促反应速度，有机理可能是，低剂量的甲胺磷促进了蛋白酶的构象变化，使酶的活性中心更易于接近底物，易于蛋白质-酶复合物的形成，同时也提高了蛋白酶水解蛋白质的能力；稍大剂量的甲胺磷(4∶5000)在反应前期(0～8min)与前者类似，酶促反应速度也得到了提高，但在后期却受到了抑制，其主要原因是该剂量的甲胺磷农药抑制了酶-蛋白复合物的降解。而更大剂量的甲胺磷(5∶5000和8∶5000)农药导致了酶的构象变得更加紧凑，活性中心与底物的结合更困难，导致酶促反应速度减慢。

图4是低剂量的有机氯类杀虫双农药对蛋白水解酶活性的影响曲线：从图4中可知：在酶-酪蛋白体系中加入系列低剂量浓度的有机氯农药——杀虫双后，酶促反应曲线发生了显著的变化。在原药∶水为8∶5000至14∶5000范围内时，酶促反应曲线都有不同程度的左移，斜率和幅度都有不同程度的增加，频率上升的速度均不同程度的大于未有农药刺激的情形，说明在该范围内的杀虫双能有效的提高蜘蛛中肠消化酶的活力。在原药∶水为8∶5000至12∶5000范围内时，随农药浓度的递增，酶促反应速度也随之增大，直对原药∶水为12∶5000时，酶促反应速度达最大值，在原药∶水为12∶5000至14∶5000范围内时，随农药浓度的增加，酶促反应速度减慢，但仍大于未施药的情形，但当杀虫双农药浓度达一定量(28∶5000)时，酶促反应曲线明显右移，曲线斜率和幅度明显减少，频率上升速度减慢，酶的活性受到明显抑制。

图5是低剂量的菊酯类杀虫剂对蛋白水解酶活性的影响曲线：

从图5可知，在原药∶水为1∶20至3∶20的浓度范围内时，PQC的Δf₀-t响应曲线都不同程度的左移，其上升幅度也均大于没有农药的情形，但随农度的增加，上升幅度逐次减少，即酶被激活的程度也依次减少。在较高剂量农药农度(4∶20和6∶20)的作用下，PQC的Δf₀-t响应曲线明显右移，曲线斜率和幅度明显减少，频率上升速度减慢，且农药浓度越高，其右移幅度越大，曲线斜率和幅度就越少，酶的活性受到明显的抑制。

总之，用本发明方法对有机磷类、有机氯类和菊酯类三大类农药的检测结果表明，这三大类农药的合适低剂量可显著地增强蛋白消化酶的活性，较高剂量的农药可显著抑制蛋白消化酶的活性。证实压电石英阻抗分析法比传统的紫外分光光度分析法优势明显。这对探讨低剂量杀虫剂增强蜘蛛控虫力的生物化学机制和对合理使用杀虫剂，减少其副作用及协调生防和化防的关系，都具有积极的意义。