基于固相表面增强光散射的生物分子相互作用分析方法

摘要

本发明是一种基于生物探针分子与生物靶分子在玻片表面发生相互作用，引起光散射信号增强，进而实施对生物靶分子的定性和定量测定以及分子间相互作用特性分析的分析方法。方法过程包括对凹玻片的预处理，探针分子的固定，生物探针与生物靶分子的结合，在普通荧光光度计上采用同步扫描方式得到散射光谱，并通过生物分子作用前后光谱强度的变化实施对生物靶分子的定性、定量测定，以及分子间作用特性的分析，以及对生物探针的再生。其优点是分析灵敏度高，选择性非常好，使用仪器简单，分析成本低廉，可广泛适用于各种生物分子含量的测定及分子相互作用特性分析。

说明书

技术领域

本发明属光分析技术，具体涉及生物分子在固相表面特异性的聚集导致表面光散射信号增强而进行生物分子的定性和定量测定以及生物分子相互作用特性分析的分析方法，可广泛应用于蛋白质、核酸、酶、细胞与细菌、生化药物等的高灵敏度、高选择性的定量测定以及蛋白质与蛋白质(如抗原与抗体、给体与受体、蛋白质与酶等)DNA与DNA、DNA与蛋白质(包括酶)等之间特异性的相互作用分析。

背景技术

光散射现象广泛存在于光与粒子的作用过程中。已有研究结果表明生物大分子的识别、组装和聚集导致强烈的共振光散射信号(RLS)增强，且信号增强与聚集体系(散射粒子)的浓度成正比。近年来，散射技术已应用于生物大分子、生化药物、表面活性剂、纳米粒子和无机金属离子的分析。然而，建立在溶液本体基础上的散射分析技术，虽然灵敏度高，使用的仪器简单，操作简便，但存在致命的缺陷。1、选择性不好，抗干扰能力较差。在本体溶液，所有能对光产生散射的物质都会对被测物分析带来大的干扰。2、目前采用的散射技术都是在水溶液中进行测定，而对于需要在油溶性试剂中进行的分析则不能进行，因而使其分析的范围受到了一定的局限。3、在本体溶液中由于干扰成分多，对于进行生物分子相互作用的分析也有较大的困难。

对于类似本发明的表面等离子分析(SPR)技术，虽然它也利用生物分子之间特异性相互作用而进行分析测定，但它需要将生物分子固定在特制的金表面，且利用的是全内反射时渐消失波的影响，通过测定反射角和反射光能量的变化来进行分析测定。其采用的原理与本发明完全不相同，而且需要昂贵的专业仪器设备(SPR仪)来完成。

发明内容

本发明的针对现有技术存在的上述不足，提出一种基于固相表面增强光散射的生物分子相互作用分析方法，将散射技术引入到固相表面，并与高选择性的生物分子相互作用相结合，从而构建得到一种新的光分析方法，充分继承散射技术的优点，克服它仅能在本体溶液中应用和选择性低的局限，为生物分子的含量测定和生物分子相互作用机理的表征提供了一种简便、快速、灵敏的技术平台。

本发明的技术方案如下：

基于固相表面增强光散射的生物分子相互作用分析方法，总的方法是先将生物探针分子固定在玻片表面，再利用探针与生物靶分子在玻片表面相互作用，从而引起光散射信号增强，进而实施对生物靶分子的定性和定量分析测定以及分子间相互作用特性(如亲合特性、动力学特性等)分析。具体包括以下步骤：

1、先依据不同生物分子探针的特性，选择合适材质的凹玻片(如普通玻片、石英玻片等)，使用恰当的化学修饰剂(如氨基硅烷化试剂、巯基硅烷化试剂、戊二醛等)，进行表面修饰处理。

2、通过共价键合方式固定探针分子：实际操作中可分别采用物理吸附、化学键合、物理吸附与化学键合相结合、双功能试剂交联、纳米材料(如金纳米粒子)、特殊吸附蛋白(如G蛋白、A蛋白等)等进行生物分子探针在玻片表面上的固定。

3、利用生物分子之间的特异性相互作用使生物探针与生物靶分子结合。

4、在普通荧光光度计上采用同步扫描方式得到散射光谱，并通过生物分子作用前后光谱强度变化实施对生物靶分子的定性和定量测定，以及分子间作用特性的分析。在采用普通荧光光度计进行检测时，入射光与玻片成45°角，在入射光的90°角方向实施散射信号的检测，并采用激发和发射波长相同(即Δλ＝0)的同步扫描模式进行。

5、对生物探针进行再生，使得探针可继续用于靶分子的检测。

本发明的优点及积极效果：

1、本发明将散射技术引入到固相表面，克服了散射技术在本体溶液中使用所受到的共存物质的干扰，分析灵敏度高，并大大提高了分析方法的选择性。

2、克服了散射技术只能运用于水作溶剂的物质的分析测定，拓展了散射技术的运用范围。

2、本发明不仅能进行对生物靶分子的定性和定量测定，而且还能进行生物分子间相互作用特性(如亲和性，动力学特性)分析。

3、本发明技术仅需要普通的仪器，仪器简单，分析成本低廉。

附图说明：

图1：是玻片的固定结构示意图。

具体实施方式

以下以采用本发明的分析方法对抗原抗体进行分析为例来详细说明本发明的实现过程：

(1)选用普通凹玻片，其规格为25mm×70mm，凹面的直径为10mm；

(2)在玻片经过浓氢氧化钠、浓硫酸、蒸馏水充分洗净后，用氨丙基三甲氧基硅烷试剂对玻片凹面进行硅烷化处理；

(3)用5％的戊二醛作为偶联剂，将生物分子探针----羊抗人IgG(抗体)固定在玻片凹面上；

(4)在玻片凹面滴入生物靶分子----人IgG(抗原)溶液，通过探针和靶分子之间特异性的反应(即抗原抗体的特异性反应)将靶分子吸附在玻片表面；

(5)将玻片1放入基座2中，如图1所示，再置入普通荧光光度计内，采用同步扫描方式扫描得到散射光谱，并通过生物分子作用前后光谱强度的变化实施对生物靶分子的定性、定量测定，以及分子间作用特性的分析；

(6)在玻片凹面加入0.1mol/l的脲溶液洗脱吸附在探针上的靶分子，从而再生探针，以便其再进行靶分子的检测。

实验结果表明，采用本发明分析方法，固定羊抗人IgG(抗体)作为探针对人IgG(抗原)靶分子进行测定时，分析的相关系数可以达到0.993，最低检测浓度可达10ng/ml。