截短胰高血糖素样肽1(sGLP－1)、制法及其应用

摘要

本发明涉及促胰岛素分泌的胰高血糖素样肽1(glucagon－likepeptide－1，GLP－1)的类似物，截短胰高血糖素样肽1(sGLP－1)，其由26个氨基酸组成，其序列如下：His－X1－Glu－Gly－Thr－Phe－Thr－Ser－Asp－Val－Ser－Ser－Tyr－Leu－Glu－Gly－Gln－Ala－Ala－Lys－Glu－Phe－Ile－Ala－Trp－Leu。发明所述的截短胰高血糖素样肽1(sGLP－1)与目前GLP－1及其类似物相比，具有突出的特点：1.截短肽链改构后与胰岛细胞受体结合力更强，刺激更强的胰岛素分泌作用；2.通过第二位氨基酸序列的改变，由Ala改为Gly或Ser使改构的模拟序列可抵抗二肽基肽酶降解作用，从而使半衰期延长，药效增强；3.通过截短肽链，降低合成成本。

说明书

技术领域：

本发明涉及促胰岛素分泌的胰高血糖素样肽1(glucagon-likepeptide-1，GLP-1)的类似物，另外还涉及其制法及其应用。

背景技术：

近年来对促胰岛素分泌肽GLP-1和Exendin 4的研究进展很快，两者具有很高的同源性，应用于治疗II型糖尿病取得较好的效果。GLP-1是人肠道中分离纯化得到的多肽，Exendin 4是从墨西哥巨蜥蜴的毒液中分离得到的一种短肽。两者在很低浓度下即可促进胰脏合成和分泌胰岛素，从而能帮助糖尿病人控制血糖。

GLP-1是人体分泌的一种肠道激素，由胰高血糖素原(Proglucagon)分子经肠道蛋白水解酶作用而产生，因而称为胰高血糖素类多肽。当血糖浓度高于6mmol/L时，GLP-1能显著促进胰岛素分泌；而一旦血糖浓度恢复至正常值则不再继续作用，这一点对II型糖尿病的治疗十分有用。人体内的GLP-1有两种形式，一种为GLP-1(7-36)NH₂，是由30个氨基酸残基组成的多肽，即由胰高血糖素原中第7位至第36位氨基酸组成，其C端是酰胺化了的；另一种为GLP-1(7-37)，是由31个氨基酸残基组成的多肽，即胰高血糖素原中第7位至第37位氨基酸，GLP-1(7-36)NH₂和GLP-1(7-37)有相同的促胰岛素分泌作用，实验证明，在1×10^-10-1×10^-111mol/L浓度下，GLP-1与离体胰岛细胞作用时，可促进其分泌胰岛素，故又称它们为促胰岛素分泌肽。美国专利USP 05424286公开了Exendin4和GLP-1促胰岛素分泌的对比实验。与GLP-1相比，产生胰岛素分泌作用所需的Exendin 4浓度更低，而且Exendin 4在人体内的半衰期更长。这些研究表明，GLP-1或Exendin 4可能成为一种较为理想的II型糖尿病治疗药物。

一个治疗II型糖尿病的理想药物应该是既能降低空腹血糖，也能降低餐后血糖，又不会导致低血糖，还能减少心血管系统的并发症，并且没有其它的副反应。GLP-1是由30个氨基酸组成的肽，其序列His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg。虽然该序列用于治疗糖尿病优点是该序列为人体产生的天然序列，具有上述的多种特性，副反应少，比如它能象糖原那样抑制糖原的分泌，减慢胃肠排空，抑制食欲等；此外，GLP-1受体的刺激还可以促进细胞增殖及更新，从而使胰岛素分泌增多，对糖的耐受性提高。但缺点是，头两个氨基酸His-Ala很快就被体内的二肽基肽酶降解而丧失活性，在体内的半衰期太短，只有90至120秒，几乎没有太大的临床实用价值。目前国内外进行GLP-1序列改构的研究和专利均有很多，但没有在GLP-1序列改构同时进行序列长度缩减的。

Exendin 4在人体内的半衰期长，降血糖作用明显，但化学合成的Exendin 4是39个氨基酸组成的肽，成本高，而且作为异源多肽，长期使用有诱发人体产生对应抗体而失效的可能。

发明内容：

本发明的目的是克服上述不足问题，提供一种截短胰高血糖素样肽1(sGLP-1)，与胰岛细胞受体结合力更强，刺激胰岛素分泌作用更强；半衰期延长，另外还提供其制法，合成成本低，最后还提供其应用。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：截短胰高血糖素样肽1(sGLP-1)，其由26个氨基酸组成，其序列如下：His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu

式中英文缩写表示：His(缩写为：H，以下相同。)组氨酸、Gly(G)甘氨酸、Glu(E)谷氨酸、Thr(T)苏氨酸、Phe(F)苯丙氨酸、Ser(S)丝氨酸、Asp(D)天冬氨酸、Val(V)缬氨酸、Tyr(Y)酪氨酸、Leu(L)亮氨酸、Gln(Q)谷氨酰胺、Lys(K)赖氨酸、Ile(I)异亮氨酸、Trp(W)色氨酸。

其中所述的X1为Gly或Ser。

本发明所述截短胰高血糖素样肽1(sGLP-1)的制法：

第一步：sGLP-1肽树脂的合成：

称取0.5克的多肽合成树脂倒入合成反应柱中，加入二甲基甲酰胺溶剂溶胀，按照sGLP-1氨基酸序列依次称取0.1克的9芘甲氧羰基进行氨基酸N端(FMOC)保护的氨基酸于反应器的容器中，采用Merrifield发明的固相化学合成方法合成，sGLP-1的氨基酸序列从C端开始依次进行，在合成反应柱中，加入用二甲基甲酰胺溶解的N，N二异丙级碳二亚胺(DIC)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)，C端第一个氨基酸(FMOC-Leu)，反应2-3小时中止，减压抽干反应液，洗树脂，分别用异丙醇洗3次，二氯甲烷洗3次，二甲基甲酰胺洗3次，加入含20％(V/V)6-氢吡啶的二甲基甲酰胺脱保护溶液，反应30分钟，抽干反应液，分别用异丙醇洗3次，二氯甲烷洗3次，二甲基甲酰胺3次，随后加入的第二个FMOC保护的氨基酸，和无水羟基苯丙三氮唑(HOBT)，2-苯骈三氮唑-1，1，3，3，-四甲基脲四氟硼酸酯(HBTU)，N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)，溶解活化5分钟，立即加入反应器中反应2小时，按上法洗树脂，脱保护，随后依照序列结构偶连反应直到序列完全，偶连完成后，用二甲基甲酰胺充分洗去残余的未偶连试剂，用惰性气体N₂吹干肽树脂，备用。

第二步：sGLP-1树脂的裂解：

取上述肽树脂于容器中，加入裂解液：9.5ml三氟乙酸，0.4ml硫代苯甲醚，0.4ml苯甲醚，0.2ml-1，2-乙二硫醇，于室温避光反应2小时，过滤，滤液于室温浓缩后加入预先冷冻的无水乙醚中，冰冻过夜，离心，弃上清液，沉淀用水或冰醋酸溶解后，冷冻后置冷冻干燥机中干燥，得粗肽。第三步：sGLP-1肽纯化

取上述粗肽，加入无热源水溶解，得到样品溶液，过滤并收集样品滤液；将乙腈及无热源水用0.45u滤膜过滤，分别加入0.1％三氟乙酸，混匀，用C18反向柱分离纯化，分离条件采用：流动相A：0.1％三氟乙酸+100％H₂O；流动相B：0.1％三氟乙酸+100％乙腈；0→90分钟梯度洗脱纯化制备，收集纯化的sGLP-1洗脱液，冷冻后置冷冻干燥机中干燥，得到sGLP-1多肽纯品。

本发明所述截短胰高血糖素样肽1(sGLP-1)在治疗II型糖尿病药物中的应用。如在治疗II型糖尿病注射针剂、口服片剂或胶囊、喷雾剂中的应用。

所述中成分除sGLP-1外，注射针剂包含sGLP-1及人体可接受的稀释液体，如注射用水、生理盐水和磷酸盐缓冲液等；口服片剂或胶囊包括sGLP-1及医药可接受的稳定剂、固型剂等。

本发明所述的截短胰高血糖素样肽1(sGLP-1)与目前GLP-1及其类似物相比，具有突出的特点：1.截短肽链改构后与胰岛细胞受体结合力更强，刺激更强的胰岛素分泌作用；2.通过第二位氨基酸序列的改变，由Ala改为Gly或Ser使改构的模拟序列可抵抗二肽基肽酶降解作用，从而使半衰期延长，药效增强；3.通过截短肽链，降低合成成本。多肽的制备一般可采用化学合成和基因工程技术两种方法生产。但生产的成本很高，这成为其进入药品市场的障碍。本发明提供的合成方法，通过改变肽链中的少数若干个氨基酸可得到多肽的类似物，同时又可以大规模、低成本地进行生产。通过用II型糖尿病大鼠模型试验，进行II型糖尿病降血糖治疗试验，结果表明本发明sGLP-1降血糖作用优于GLP-1及其改构序列，动物试验表明降糖效果明显提高。用改构的缩短序列与胰岛细胞受体结合，具有更佳的刺激胰岛素分泌作用，具有较好的用于II型糖尿病病人的治疗药物的应用前景。

附图说明：

图1为本发明sGLP-1液相色谱纯度鉴定图。

图2为本发明sGLP-1分子量质谱鉴定图。

具体实施方式：

实施例1

按下述方法合成sGLP-1，其序列如下：His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu

第一步：sGLP-1肽树脂的合成：称取0.5克的Wang树脂(或其他多肽合成树脂)倒入合成反应柱中，加入二甲基甲酰胺溶剂溶胀，按照本发明的降血糖肽的氨基酸序列依次称取0.1克的FMOC(9芘甲氧羰基进行氨基酸N端保护的)氨基酸于反应器的容器中，按照Merrifield发明的固相化学合成方法(具体方法如下)依照本发明的sGLP-1的氨基酸序列从C端开始依次进行，在合成反应柱中，加入用10ml的二甲基甲酰胺溶解的4ml N，N二异丙级碳二亚胺(DIC)，0.012克4-二甲氨基吡啶的C端第一个氨基酸(FMOC-氨基酸)，反应2-3小时中止，减压抽干反应液，洗树脂，分别用异丙醇洗3次，二氯甲烷洗3次，二甲基甲酰胺3次，加入含20％(V/V)6-氢吡啶的二甲基甲酰胺脱保护溶液，反应30分钟，抽干反应液，分别用异丙醇洗3次，二氯甲烷洗3次，二甲基甲酰胺3次，随后加入的第二个FMOC保护的氨基酸，和0.22克无水羟基苯丙三氮唑，0.6克2-苯骈三氮唑-1，1，3，3，-四甲基脲四氟硼酸酯(HBTU)，0.35mlN，N-二异丙基乙胺，溶解活化5分钟，立即加入反应器中反应2小时，按上法洗树脂，脱保护，随后依照序列结构偶连反应直到序列完全，偶连完成后，用二甲基甲酰胺充分洗去残余的未偶连试剂，用惰性气体N₂吹干肽树脂，备用。

第二步：sGLP-1树脂的裂解：

取上述肽树脂于容器中，加入裂解液：9.5ml三氟乙酸，0.4ml硫代苯甲醚，0.4ml苯甲醚，0.2ml-1，2-乙二硫醇，于室温避光反应2小时，过滤，滤液与室温浓缩后加入预先冷冻的无水乙醚中，冰冻过夜，离心，弃上清液，沉淀用200ml水或冰醋酸溶解后，冷冻后置冷冻干燥机中干燥，得粗肽。

第三步：sGLP-1肽纯化：

取粗肽，加入200ml无热源水溶解，得到样品溶液，过滤并收集样品滤液；将乙腈及无热源水用0.45u滤膜过滤，分别加入0.1％三氟乙酸，混匀，用C18反向柱分离纯化，分离条件采用：流动相A：0.1％三氟乙酸+100％H₂O；流动相B：0.1％三氟乙酸+100％乙腈；0→90分钟梯度洗脱纯化制备，收集纯化的sGLP-1洗脱液，冷冻后置冷冻干燥机中干燥，得到sGLP-1多肽纯品。

实施例2

按照实施例1所述方法合成sGLP-1，其序列如下：His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu。

动物实验：

1、降血糖效果实验：

材料和方法

GK糖尿病大鼠(中国科学院上海动物中心提供)

sGLP-1序列如下：

No1：HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR

No2：HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWL

No3：HSEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWL

No4：HSEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFI

No5：HGEGTFTSDVSSYLEGQAVRLFI

No6：HGEGTFTSDVSSYMEEEAVR    

No7：HGE GTFTSDVSSYM

No8：HGEGTFTSDVSS

上述8种序列多肽用0.9％NaCl溶液配置成1mg/ml溶液，备用。

大鼠随机分组，禁食过夜后，用刻度毛细管(注射前以肝素处理)从眼窦取血20微升，置入300微升生理盐水中混匀，3000转/分离心除去红血球，血清用于空腹血糖浓度测定。然后各组分别注射不同多肽，用生理盐水作阴性对照，每只大鼠每天注射两次，每次0.1mg，连续注射两周，禁食过夜后，再次按上法取血，测定空腹血糖。

结果见附表1，No1～No5均有降血糖作用，其中No1序列是第2位氨基酸由A改为G的全长GLP-1序列作为阳性对照；No2～No5为不同截短长度的改构序列，而且No2和No3组降血糖作用明显高于No1组，为最终确定的本发明sGLP-1序列。

2、对NOD小鼠的降血糖作用

实验材料与方法：

NOD小鼠禁食过夜(中国科学院上海动物中心提供)40％葡萄糖、0.9％NaCl溶液、sGLP-1纯品(实施例1所得产品)、GLP-1纯品、血糖测定试剂盒(中国卫生部上海生物制品所出品)

NOD小鼠禁食过夜，分为三组。第一组腹腔注射200微升40％葡萄糖和10微克sGLP-1，第二组腹腔注射200微升40％葡萄糖和10微克GLP-1，第三组为对照组，只注射葡萄糖。立刻用刻度毛细管(注射前以肝素处理)从眼窦取血20微升，置入300微升生理盐水中混匀，3000转/分离心除去红血球，血清用于血糖浓度测定。分别于30，60，120分钟按同样操作取血，分离血清。三组血清均按照试剂盒所述方法测定血糖浓度，以检验各组的降血糖作用。

结果如表1所示。

对照组血糖浓度大幅度升高后，逐渐回落到正常水平；而给药组血糖浓度未出现显著升高，一直保持在正常水平附近。这是由于给药后促进了胰岛素分泌，从而避免了血糖浓度的大幅波动。由此可证明sGLP-1和GLP-1的降血糖作用。

表1.sGLP-1对NOD小鼠的降血糖作用

  给药后时间  0min  30min  60min  120min  sGLP-1  4.08  4.34  4.28  3.98  GLP-1  4.11  5.12  4.87  4.03  对照组  4.09  8.07  6.30  5.16

注：表中血糖浓度值为：mmol/L

3、sGLP-1的促胰岛素分泌作用

实验材料与方法：

NOD小鼠(中国科学院上海动物中心提供)

0.9％NaCl溶液、sGLP-1纯品(实施例1所得产品)、GLP-1纯品放射免疫胰岛素测定试剂盒(中国卫生部上海生物制品所出品)

NOD小鼠分成三组。首先用刻度毛细管(先以1mg/mL肝素润洗毛细管内壁并晾干)从眼窦取血50微升，然后三组小鼠分别腹腔注射10微克sGLP-1、10微克GLP-1和200微升生理盐水，并记此时为零时刻。然后分别于5，10，20，30分钟按同样操作取血。取血后各血样立刻加入盛有50微升生理盐水的离心管中，混匀，3000转/分离心除去红血球，按放射免疫试剂盒使用方法测定血清中胰岛素浓度，以检验sGLP-1的促胰岛素分泌作用。

实验结果如表2所示。该结果表明，腹腔注射sGLP-1能显著促进胰岛素的分泌，短时间刺激产生胰岛素能力与GLP-1相当，中长时间刺激产生胰岛素能力超过GLP-1。

表2.sGLP-1的促胰岛素分泌作用

  给药后时间  0min  5min  10min  20min  30min  sGLP-1  2.88  10.56  19.88  24.67  16.45  GLP-1  3.11  9.76  10.63  11.23  6.27  对照组  2.09  2.07  1.80  1.90  1.86

注：表中胰岛素值为：10^-6国际单位

4.sGLP-1的促C肽分泌作用

实验材料与方法：

健康C57/BL小鼠(中国科学院上海动物中心提供)0.9％NaCl溶液、sGLP-1纯品(实施例1所得产品)、GLP-1纯品。放射免疫C-肽测定试剂盒(中国卫生部上海生物制品所出品)

健康C₅₇/BL小鼠分成三组。首先用刻度毛细管(先以1mg/mL肝素润洗毛细管内壁并晾干)从眼窦取血50微升，然后两组小鼠分别腹腔注射10微克sGLP-1、10微克GLP-1和200微升生理盐水，并记此时为零时刻。然后分别于5，10，20，30分钟按同样操作取血。取血后各血样立刻加入盛有50微升生理盐水的离心管中，混匀，3000转/分离心除去红血球，按放射免疫试剂盒使用方法测定血清中C肽浓度，以检验sGLP-1的促C肽分泌作用。

实验结果如表3所示。该结果表明，腹腔注射sGLP-1能显著促进c肽的分泌，而且促进c肽的分泌能力高于GLP-1。

表3.sGLP-1的促胰岛素分泌作用

  给药后时间  0min  5min  10min  20min  30min  sGLP-1  0.07  0.08  0.20  0.16  0.15  GLP-1  0.07  0.08  0.15  0.11  0.09  对照组  0.07  0.06  0.08  0.06  0.06

注：表中c肽浓度为：pmol/mL

附表1  降血糖效果实验

  给药组                      试验动物血糖测定值  平均值  与对照组差值  No1  6.7178  6.4751  7.488  7.2322  7.3233  7.1411  6.5342  6.978275  2.252205  No2  5.1729  3.0507  3.3886  3.314  4.43259  3.8536  4.131  3.906199  5.324281  No3  6.1934  6.62873  4.084  4.0045  5.1729  5.5309  6.5114  5.446547  3.96498  No4  9.2146  7.1244  7.4364  6.915  6.60755  5.6346  6.7982  7.104393  2.126087  No5  6.2663  8.9084  7.0863  7.1229  7.848  8.0304  8.2343  7.642371  1.588109  No6  9.1616  9.0243  8.37  7.3035  6.9875  6.4176  7.4175  7.811714  1.41876  No7  8.3869  9.8194  9.0325  9.0344  9.2661  7.8949  8.906  8.9057  0.32478  No8  9.417  9.0365  8.3983  7.2232  8.7884  9.014  8.0691  8.563786  0.6666  对照组  8.1364  10.7211  9.5314  9.2867  8.4768  9.441  9.026  9.23048  0