通过(例如)T细胞受体V/D/J基因中的重复鉴定克隆性细胞

摘要

本发明涉及表征核酸区域的方法，特别是涉及分析标志物物核酸区域的方法。本发明的方法基于侧翼于标志物核酸区域的一个或两个核酸区域的鉴定，并且提供了分析标志物核酸区域的方法，所述标志物核酸是细胞克隆性群体的特征。本发明的方法用于如下应用，所述应用包括，但不限于，监测特征在于存在细胞克隆性群体存在的病况(例如致瘤性病况)的进展、监测一种或多种克隆性细胞群体的水平、预测患者从康复状态复发至疾病状态的可能性、用于估计现有治疗性药物和/或新治疗性药物的功效以及鉴定标志物区域的存在。

说明书

发明领域

本发明涉及表征核酸区域的方法和，更特定地涉及分析标志物核酸区域的方法。本发明的方法基于侧翼于标志物核酸区域的一侧或两侧核酸区域的鉴定并且提供了分析标志物核酸区域的单元，所述标志物核酸区域是细胞克隆性群体的特征。本发明的方法用于一系列应用的环境中，所述应用包括，但不限于，监测以细胞克隆性群体存在为特征的病况(例如致瘤性病况)的进展、监测一个或多个细胞克隆性群体的水平、预测受试者从康复状态复发至疾病状态的可能性、用于估计现有治疗性药物和/或新的治疗性试剂的功效以及鉴定标志物区域的存在。

发明背景

本说明书中关于现有技术的文献不是并且不应当被当作承认或以任何形式的暗示现有技术构成澳大利亚公知常识的一部分。

克隆通常被理解为共同祖先细胞子代的细胞群体。在受试者中对细胞或生物体的克隆性群体存在的诊断和/或检测通常已构成了相对而言存在许多问题的方法。特别地，克隆性群体可在更大的细胞或生物群体内构成极小的成分。例如，就哺乳动物生物体来说，一个需要在其中进行细胞克隆性群体检测的更普通的情况发生在肿瘤例如癌症的诊断和/或检测上。然而，一个或多个克隆性群体的检测在病况例如骨髓发育不良或红细胞增多vera的诊断上以及还有在免疫系统产生的抗原驱动克隆的检测上可能是非常重要的。

通常，在其中产生克隆的群体对应于身体的特定组织或区室内的细胞群体。然而，尽管事实上对这种细胞群体进行取样有效地减少了对细胞或生物亚型的检查，但其仍可给临床带来许多非克隆性细胞或生物群体背景，在所述背景中所述克隆性群体必需鉴定。

如果克隆的成员之特征在于分子标志物，例如改变的DNA序列，那么检测的问题就可以转化成在更大的分子群体内检测全部具有相同分子序列的分子群体的问题，其中所述更大的分子群体具有完全相同和完全不同或者或多或少异源的不同序列。可达到的标志物分子的检测水平高度依赖于检测方法的灵敏性和特异性，但几乎总是，当靶分子在更大的分子群体中的比例变小时，来自更大群体的干扰信号使得不可能检测出来自所述靶分子的信号。

因此，需要发展用于在任何生物学背景(即与非克隆背景细胞材料的水平无关)下定性和/或定量地检测细胞克隆性群体存在的方法，所述方法是高度灵敏而且易于常规操作的。

在通往本发明的工作中，已确定检测方法所针对的目的标志物，序列位于基因组的单个区域并且侧翼通常连接有独特性序列。特别地，已确定所述目的标志物通常在一侧或两侧都连接有对应于重复序列家族的一个或两个成员的独特性序列。根据各受试重复序列家族不同成员自身序列的不同，已确定这些序列提供了分析(例如表征、检测、分离或定量)目的标志物序列的独特方法。也确定了通过任一合适的方法例如微阵列相关的方法学或PCR可常规地和简单地对这些序列进行鉴定。关于后者，例如，可进行多重扩增反应，其中各反应在构成该反应的引物对这点上不同。特别地，通过设计引物对，可清楚和容易地确定侧翼于表征目的克隆性群体的标志物核酸分子之两个重复序列家族成员，其中一个引物对于所有反应是共用的并且针对一个侧翼序列的保守区(例如共有序列)，而另一个引物选自引物组，所述引物组中的各单个成员对重复序列家族的各单个成员是特异性的。这种原理也可用于其它平台的技术中，例如基于芯片的微阵列分析中，所述芯片包含特异性针对重复序列家族各成员的探针阵列。因此这种方法的发展促进了检测和/或监测受试的细胞克隆性群体的手段，即使在大量非受试克隆性背景细胞群体的背景下，通过提供使用根据本发明方法鉴定的引物特异性地富集所述标志物序列的手段也可检测和/或监测受试的细胞克隆性群体。

发明概述

在整个本说明书和随后的权利要求中，除非上下文要求外，单词“包含”和变体例如“包括”和“含有”应当理解为表示包含提到的整体或步骤或整体群或步骤群但不排除任何其它的整体或步骤或整体群或步骤群。

本发明不受限于此处描述的具体的实施方案的范围，所述具体的实施方案只是用于示例说明的目的。如此处所描述的，功能性等同物、组合物和方法清楚地属于本发明的范围内。

如此处所用的，术语“来源于”是表示特定的整体或整体群起源于特定的物种，但不必从特定的来源直接获得。

本说明书包含使用程序PatentIn Version 3.1提供的核苷酸序列信息，此处在参考书目后提供。在序列表中，通过数字标记<210>后接序列标识符(例如<210>1，<210>2，等)给核苷酸序列做标记。各核苷酸序列的长度、序列类型(DNA，等)和生物来源分别通过数字标记字段<211>、<212>和<213>来表示。本说明书中提到的核苷酸序列通过标记字段SEQ ID NO：后接序列标识符(例如SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2，等)来做标记。在本说明书中涉及的序列标识符与序列表中数字标记字段<400>提供的信息相关，所述数字标记字段后接序列标识符(例如<400>1，<400>2，等)。就是说如发明书中详述的SEQ ID NO：1与序列表中标记为<400>1的序列相关联。

本发明的一个方面涉及分析标志物核酸区域的方法，所述标志物核酸区域是细胞克隆性群体的特征并且在一侧或两侧有独特重复序列家族的成员，所述方法包括鉴定侧翼于所述标志物核酸区域的一个或多个核酸序列区域。

在另一方面提供了分析标志物DNA区域的方法，所述标志物DNA区域是细胞克隆性群体的特征并且在一侧或两侧有独特性重复DNA序列家族成员，所述方法包括鉴定侧翼于所述标志物DNA区域的一个或多个DNA区域。

本发明的另一方面提供了分析可变区基因节段的方法，所述可变区基因节段是淋巴细胞克隆性群体的特征，所述方法包括鉴定所述V和D基因家庭成员。

本发明的另一方面提供了分析可变区基因节段的方法，所述可变区基因节段是淋巴细胞克隆性群体的特征，所述方法包括鉴定所述V和J基因家族成员。

本发明的另一方面提供了分析可变区基因节段的方法，所述可变区基因节段是淋巴细胞克隆性群体的特征，所述方法包括鉴定所述D和J基因家族成员。

本发明的另一方面提供了分析标志物核酸序列区域的方法，所述标志物核酸序列区域是细胞克隆性群体的特征并且在一侧或两侧有独特重复序列家族成员，所述方法包括：

(i)促进对来源于所述细胞克隆性群体的核酸分子的多重扩增反应，所述扩增反应使用引物对，其中第一个引物对于所有反应都是共用的并且针对上游侧翼序列的保守区，而第二个引物选自组引物，其中各引物特特异于所述下游重复序列家族成员是；

(ii)鉴定哪一种所述第二引物促进所述侧翼序列的扩增；

(iii)重复步骤(i)和(ii)，其中所述第一引物对于所有反应是共用的并且针对下游侧翼序列的保守区，而所述第二引物选自引物组，各引物特异于所述重复序列家族的上游成员。

在本发明的进一方面提供了分析标志物核酸序列区域的方法，所述标志物核酸序列区域是细胞克隆性群体的特征并且在一侧或两侧有独特重复序列家族成员，所述方法包括：

(i)促进对来源于所述细胞克隆性群体的核酸分子的多重扩增反应，所述扩增反应使用引物对，其中第一引物选自引物组，各引物特异于所述上游重复序列扩增家族成员，而第二引物选自引物组，其中各引物特异于所述重复序列下游家族成员；和

(ii)鉴定哪一种所述第一和第二引物促进所述侧翼序列的扩增。

本发明的另一方面提供了分析标志物核酸序列区域的方法，所述标志物核酸序列区域是细胞克隆性群体的特征并且在一侧或两侧有独特重复序列家族成员，所述方法包括：

(i)促进对来源于所述细胞克隆性群体的核酸分子的多重聚合酶链式扩增反应，所述扩增反应使用引物对，其中第一个引物对所有反应都是共用的并且针对上游侧翼序列的保守区，而第二引物选自引物组，其中各引物特异于所述重复序列下游家族成员；

(ii)鉴定哪一种所述第二引物促进所述侧翼序列的扩增；

(iii)重复步骤(i)和(ii)，其中所述第一引物对所有反应是共用的并且针对下游侧翼序列的保守区，而所述第二引物选自引物组，其中各引物特异于所述重复序列家族上游成员。

本发明的另一方面提供了分析标志物核酸序列区域的方法，所述标志物核酸序列区域是细胞克隆性群体的特征并且在一侧或两侧有独特重复序列家族的成员，所述方法包括：

(i)促进对来源于所述细胞克隆性群体的核酸分子的多重聚合酶链式扩增反应，所述扩增反应使用引物对，其中第一引物选自引物组，其中各引物特异于所述重复序列上游家族的成员，而第二引物选自引物组，其中各引物特异于所述重复序列下游家族的成员；和

(ii)鉴定哪一种所述第一和第二引物促进所述侧翼序列的扩增。

在另一步方面提供了在哺乳动物中监测细胞克隆性群体的方法，所述克隆性细胞的特征在于标志物核酸分子并且在所述标志物核酸分子的一侧或两侧有根据上文描述的方法所述的独特重复序列家族的成员。

附图简述：

图1是使用与侧翼序列结合的引物进行白血病定量的图示。

发明详述

本发明部分基于简单但高度精确的分析方法的发展，所述方法用于分析标志物核酸区域特别是区分目的细胞克隆性群体的标志物核酸区域。特别地，根据侧翼连接标志物区域的核酸区域，已确定标志物核酸区域可被准确地表征，并因此有助于其常规分析。当所述标志物核酸区域的侧翼为在实际核酸序列上相互不同的独特重复序列家族成员时，该方法特别有用。于是就提供了用于减少存在于受试样品中的非标志物背景序列的方法，因此有助于监测以细胞克隆性群体扩增为特征的病况的进展，预测受试者从康复状态复发至疾病状态的可能性或用于估计现有治疗性药物和/或新治疗剂的功效。

因此，本发明的一个方面用于分析标志物核酸区域的方法，所述标志物核酸区域是细胞克隆性群体的特征并且在一侧或两侧为独特重复序列家族成员，所述方法包括鉴定一个或多个侧翼于所述标志物核酸区域的核酸序列区域。

“细胞”应当理解为来自任何物种的所有细胞形式和其突变体或变体。不将本发明限制于任何一个理论或行为模式的情况下，细胞可组成生物体(在单细胞生物的情况)或其可以是多细胞生物体的亚单位，在所述多细胞生物体中单个细胞可为特定功能或多或少地特化(分化)。所有活的生物体由一个或多个细胞组成。所述受试细胞可在同系、同种异体或异种背景下形成接受检验的生物学样品的部分。同系过程是指克隆性细胞群体和该克隆性群体存在的生物学样品具有相同的MHC基因型。这最有可能存在于例如当在个体中筛选瘤形成存在的情况下。“同种异体”过程是指受试克隆性群体实际上表达与生物学样品采自的个体的MHC不同的MHC。这可以发生在例如当在移植对宿主疾病的病况背景下筛选移植的供体细胞群(例如免疫活性的骨髓移植体)增殖的时候。“异种”过程是指受试克隆性细胞与所述生物学样品来自的受试者的细胞是完全不同的物种。其可发生在例如当潜在的致瘤性供体群体来源于异种移植体的情况下。

受试细胞的“变体”包括，但不限于，表现一些但不是所有的产生变体的细胞的形态学或表型特征或功能活性的细胞。“突变体”包括，但不限于已经天然地或非天然地修饰过的细胞例如经遗传修饰的细胞。

“克隆性”是指受试细胞群体来源于共同的细胞起源。例如，致瘤性细胞群体来源于已经在特定的分化阶段经过转化的单个细胞。在这一点上，尽管属于不同的细胞克隆性群体，经过进一步细胞核重排或突变以产生遗传上不同的致瘤性细胞群体的致瘤性细胞也是细胞“克隆性”群体。在另一个例子中，响应急性或慢性感染或免疫刺激而增殖的T或B淋巴细胞在此处提供的定义内也是细胞“克隆性”群体。在另一个例子中，所述细胞克隆性群体是克隆性微生物群体，例如产生于更大的微生物群体内的药物抗性克隆。优选地，受试细胞克隆性群体是致瘤性细胞群体或免疫细胞克隆性群体。

受试细胞的特征在于“标志物核酸区域”。作为受试克隆性细胞群体的特征的“标志物核酸区域”应当理解为发现于克隆性细胞但未在非克隆性细胞中发现或未以明显数量在非克隆性细胞中发现的核酸分子序列(例如单一序列或基因区域序列)。“明显”是指受试标志物的检测无论如何提供表示存在于所述样品中的克隆性细胞的有用标志。所述标志物优选地对应于分开的核酸分子区域并因此可对应于一个或多个基因或基因的部分。受试基因可不必编码蛋白但可对应于无论如何是所述受试克隆性细胞特征的非编码序列。

标志物区域也可以对应于特定的基因重排。例如标志物可对应于T细胞受体(此处称为“TCR～)链或免疫球蛋白链的重排基因组可变区核酸分子。不将本发明限制于任何方式，各淋巴细胞通过其依赖于特定重排基因的种系可变区基因节段(V和J或V，D和J片段)的体细胞重组以产生总共大约10¹⁶种不同可变区结构的抗原多样性。在任何给定的淋巴细胞例如T细胞或B细胞中，由于两条包含TCR或免疫球蛋白分子的链的两个或多个可变区基因节段重排的缘故，至少可能发生两个不同可变区基因节段重排。特别地，TCR的α、β、γ或δ链和/或免疫球蛋白的重链和轻链。除了任何给定的免疫球蛋白或TCR基因的VJ或VDJ节段重排外，随机地在所述节段之间的连接上除去和/或插入核苷酸。这导致大量多样性的产生。

标志物区域可以是DNA或RNA，例如mRNA，或其衍生物或类似物。当所述标志物区域是编码蛋白质分子的DNA时，其表达可以是组成型的，或其可能需要细胞接收到的刺激信号以诱导其的转录和翻译。因为本发明的方法用于筛选标志物核酸区域本身，当基因组DNA是检测的主题时，所述标志物是否表达就不重要了。但是，如果主题方法是用于检测mRNA，由所述标志物编码的蛋白不是组成型产生的情况下，就必须在筛选前适当地刺激所述受试细胞。从哺乳动物收集包含所述受试细胞的生物学样品后，可在体外进行这种刺激，或在生物学样品收集前，给哺乳动物施用刺激信号。进一步地，标志物核酸区域通常可以是在所述受试细胞克隆性扩增前发现于其中的标志物。可选择地，所述标志物可以是在受试细胞克隆性扩增时发生于其中的突变。例如，当通过病毒感染非致瘤性细胞来诱导致瘤性转化时，受试标志物可以是病毒来源的或病毒特异性分子。

优选地，所述标志物核酸分子区域是标志物DNA区域。

因此本发明更特别地提供了分析标志物DNA区域的方法，所述标志物DNA区域是细胞克隆性群体的特征并且在一侧或两侧为独特重复DNA序列家族成员，所述方法包括鉴定一个或多个侧翼于所述标志物DNA区域的DNA区域。

本发明的方法用于鉴定侧翼于受试标志物区域的核酸序列区域。“侧翼”序列是指位于标志物核酸区域附近的核酸序列。“附近”是指序列与标志物区域位置上相关，使其鉴定为分析或研究受试克隆性群体提供了有用的方法。优选地，所述侧翼序列位于受试标志物区域终止末端附近或直接与其相邻。应当理解在这个方面所述标志物区域是分开的基因或基因的区域，侧翼序列位于该基因附近。然而，应当理解在标志物区域通过基因组重排事件进行定义这个意义上，所述受试侧翼序列可包含侧翼于重排基因(例如T或B细胞的重排VJ或VDJ基因)组的序列或，优选地所述侧翼序列可对应于重排基因自身，例如VJ、VD或DJ基因。在这种情况下，标志物可被认为对应于重排VJ、VD或DJ基因之间产生的独特连接。所述受试侧翼序列可以是基因或基因的部分。

如上文中所详述的，根据本发明的方法作为鉴定受试者的侧翼序列是独特重复序列家族成员。“独特重复序列家族”是指核酸序列(优选地是基因)组，所述序列表现出同源性高至足以可将其分类成单个基因类别的成员的水平，但所述成员仍然在其实际核酸序列上表现独特的差异。应当理解当讨论两个侧翼序列时，其可以是相同重复序列家族的成员，或其可以是两个不同的重复序列家族的成员。优选地，所述受试家族序列是免疫球蛋白或T细胞可变区受体基因家族(即，可变V、D和J成员)、核糖体RNA基因、HOX基因、重复元件例如Alu或MHC基因的成员。

优选地，所述克隆性细胞是淋巴细胞，所述标志物是重排可变区域基因节段。

因此，本发明优选的实施方案提供了分析可变区基因节段的方法，所述可变区基因节段是淋巴细胞克隆性群体的特征，所述方法包括鉴定所述V和D基因家族成员。

本发明另一个优选的实施方案提供了分析可变区基因节段的方法，所述可变区基因节段是克隆淋巴细胞群体的特征，所述方法包括鉴定所述V和J基因家族成员。

还有本发明另一个优选的实施方案提供了分析可变区基因节段的方法，所述可变区基因节段是克隆淋巴细胞群体的特征，所述方法包括鉴定所述D和J基因家族成员。

应当理解“淋巴细胞”是任何已发生至少一个种系组的免疫球蛋白或TCR可变区基因节段重排的细胞。可重排的免疫球蛋白可变区编码基因组DNA包括与重链或κ或λ轻链相关的可变区，而可重排的TCR可变区编码基因组DNA包括α、β、γ和δ链。在这点上，如果细胞已经重排了至少一个免疫球蛋白或TCR基因节段区域的可变区编码DNA，所述细胞应当被理解为落于“淋巴细胞”定义的范围内。细胞不必也要转录或翻译所述重排DNA。在这点上，“淋巴细胞”在其范围内包括，但绝不限于，已重排了TCR或免疫球蛋白可变区基因节段但还没有表达重排链的未成熟T和B细胞((例如TCR-胸腺细胞)或还未重排其TCR或免疫球蛋白的两条链的可变区基因节段的未成熟T和B细胞。该定义进一步扩展至淋巴样细胞，所述淋巴样细胞已经经历了至少一些TCR或免疫球蛋白可变区重排但所述细胞可不表现所有教义上与成熟T细胞或B细胞相关的表型或功能特征。因此，本发明的方法可用于监测细胞的瘤形成，包括但不限于，在发育的任何分化阶段的淋巴细胞、被激活的淋巴细胞或非淋巴/淋巴样细胞，前提是已发生重排至少一个可变区基因区域的部分重排。其也可用于监测应答特定抗原而发生的克隆性扩增。

也应当理解尽管已经完成至少一个可变区基因的重排，但本发明的方法仍然能用于监测仅表现部分重排的致瘤性细胞。例如，只经过DJ重组事件的B细胞是只经过部分重排的细胞。除非DJ重组节段进一步与V节段重组否则不能达到完全重排。因此，通过使用与该标志物序列互补的参照分子，本发明的方法可设计用来检测一个TCR或免疫球蛋白链的部分或完全可变区重排或，例如，如果需要更高的特异性并且致瘤性细胞已重排了TCR或免疫球蛋白的两条链的可变区，可使用针对两种重排形式的引物分子。

如上文中所述，“核酸”应当理解为脱氧核糖核酸和核糖核酸或其衍生物或类似物。在这点上，应当理解包含核糖核苷酸和/或脱氧核糖核酸的磷酸酯，尤其包括DNA(cDNA或基因组DNA)、RNA、mRNA或tRNA。包含标志物和侧翼序列的核酸分子可天然地发生或其可以是非天然事件例如受试细胞的重组基因工程(例如在更早期是基因治疗性食物疗法的受试者细胞)的结果。对于可能用于鉴定侧翼序列的探针或引物分子，应当理解这些核酸分子包含核酸分子的衍生物或类似物。

“衍生物”应当理解为包括来自天然的、合成的或重组来源的片段、部分、级分、化学等同物、类似物、突变体、同源物和模拟物。“功能性衍生物”应当理解为表现一个或多个核苷酸或核酸序列的功能活性的衍生物。所述核苷酸或核酸序列(例如，所述标志物区域或所述引物)的衍生物包括具有特定表位或融合至其它蛋白质或非蛋白质分子的核苷酸或核酸序列部分的片段。受试核酸分子(例如引物)可融合入标签，例如有助于分离或检测所述分子的标签。此处涉及的类似物包括，但不限于，对核苷酸或核酸序列的修饰，例如对其化学组成或总体构象的修饰。这包括，例如，对核苷酸或核酸序列与其它核苷酸或核酸序列相互作用的方式的修饰，例如在主链形成或互补碱基对杂交水平上修饰。生物素化的核苷酸或核酸序列是此处定义的“功能性衍生物”的例子。核酸序列的衍生物可来源于单个或多个核苷酸的替换、缺失和/或添加。术语“功能性衍生物”也应当被理解为包括表现出任何一种或多种核苷酸或核酸序列的功能活性的核苷酸或核酸序列，例如，经天然产物筛选后获得的产物，同时也包括在不同主链例如肽核酸上的核苷酸序列。

在鉴定侧翼于标志物核酸区域的核酸序列区域的上下文中的“鉴定”应当理解为确定受试侧翼区域的足够核酸序列信息以有助于标志物区域的鉴定和/或分离/富集和/或定量和暗示目的细胞克隆性群体的鉴定和/或分离/富集和/或定量。通过任何合适的技术可鉴定受试侧翼区域，所述技术包括但不限于：

(i)利用对按照顺序排列在固体表面(例如芯片或载玻片表面)的一系列探针进行平行杂交反应之多样性的微阵列分析技术。各单个探针或探针亚组具有对不同单个侧翼序列家族成员的特异性。通过确定杂交的模式，侧翼于标志物序列的家族成员通常可鉴定为显示杂交的最3’端的V家族探针，显示杂交的最5’端J家族探针和显示最高程度杂交的D探针。

(ii)用于确定侧翼和/或核酸区域的核酸测序技术。可使用包括便不限于高温测序(pyrosequencing)和微型测序(minisequencing)的任何合适形式的测序技术。

(iii)利用扩增反应多样性的核酸扩增技术(例如PCR)，各反应的特征在于使用独特的引物分子组合，为了确定一个或两个侧翼于目的标志物核酸区域的区域，其引物分子针对推定的侧翼区域家族的特定成员或针对其共有序列。

例如，使用成对引物可进行多重扩增反应，其中第一引物对于所有反应都是通用的并且针对标志物区域上游侧翼序列，而第二引物选自引物组，其中各引物特异于位于所述标志物区域下游侧重复序列家族的成员。这些反应也可以相反的设计进行，其中所述第一引物针对下游侧翼序列而第二引物针对上游侧翼序列。可选择地，通过进行大的多重扩增反应可将上述步骤组合起来，各反应涉及使用针对上游侧翼序列家族的特定成员和下游侧翼序列家族的特定成员的第一和第二引物。在这种类型的扩增设计中，扩增反应整体包括了上游和下游引物的不同组合。通过设计和进行包含所有两个家族单个成员组合的单个反应，可进行更多的PCR反应。然而，这些反应以单一步骤方法进行，当用更小克隆性群体进行时，所述方法可供明显的有利方面。

(iv)直接确定侧翼序列的DNA测序。

优选地，受试技术是核酸扩增技术。

根据一个优选的实施方案，本发明提供了分析标志物核酸序列区域的方法，其中所述标志物核酸区域是细胞克隆性群体的特征并且在一侧或两侧为独特重复序列家族成员，所述方法包括：

(i)促进来源于所述克隆性细胞群体的核酸分子进行多重扩增反应，所述扩增反应使用引物对，其中第一引物对于所有反应是共用的并且针对上游侧翼序列的保守区，而第二引物选自引物组，其中各引物特异于下游重复序列家族的成员；

(ii)确定哪一种所述第二引物促进所述侧翼序列的扩增；

(iii)重复步骤(i)和(ii)，其中所述第一引物对于所有反应是公用的并且针对下游侧翼序列的保守区，而第二引物选自引物组，其中各引物特异于所述重复序列家族的上游成员。

根据另一个优选的实施方案，本发明提供了分析标志物核酸序列区域的方法，其中标志物核酸区域是细胞克隆性群体的特征并且在一侧或两侧为独特重复序列家族的成员，所述方法包括：

(i)促进来源于所述克隆性细胞群体的核酸分子的多重扩增反应，所述扩增反应使用了引物对，其中第一引物选自引物组，其中各引物特异于所述上游重复序列家庭的成员，而第二引物选自引物组，其中各引物特异于下游重复序列家族的成员；和

(ii)确定哪一种所述第一和第二引物促进所述侧翼序列的扩增。

根据优选的实施方案，所述克隆性细胞是淋巴细胞，所述标志物是重排的可变区基因节段。

最优选地，所述独特重复序列家族是V和D家族序列、V和J家族序列或D和J家族序列。在这点上，应当理解上游和下游侧翼序列可以是相同重复序列家族的相同或不同成员，或其可以是不同重复序列家族的成员。

根据本发明这些优选的方法进行的侧翼序列的鉴定基于进行一系列扩增反应，其中各反应用于确定独特重复序列家族的一个特定成员是否对应于侧翼于目的克隆性群体的标志物区域的成员。在这点上，“扩增”应当理解为任何本领域技术人员熟知的扩增核酸序列的方法。优选的，所述方法是聚合酶链式反应。

根据该优选的实施方案，提供了分析标志物核酸序列区域的方法，其中所述标志物核酸区域是细胞克隆性群体的特征并且在一侧或两侧为独特重复序列家族的成员，所述方法包括：

(i)促进来源于所述克隆性细胞群体的核酸分子进行多重聚合酶链式反应，所述扩增反应使用引物对，其中第一引物对于所有反应是通用的并且针对上游侧翼序列的保守区，而第二引物选自引物组，其中各引物特异于所述下游重复序列家族成员；

(ii)确定哪一种所述第二引物促进所述侧翼序列的扩增；

(iii)重复步骤(i)和(ii)，其中所述第一引物对所有反应是通用的并且针对下游侧翼序列的保守区，而第二引物选自引物组，其中各引物特异于所述重复序列家族的上游成员。

根据另一个优选的实施方案，本发明提供了分析标志物核酸序列区域的方法，其中标志物核酸区域是细胞克隆性群体的特征并且在一侧或两侧为独特重复序列家族的成员，所述方法包括：

(i)促进来源于所述克隆性细胞群体的核酸分子的多重聚合酶链式反应，所述扩增反应使用了引物对，其中第一引物选自引物组，其中各引物特异于所述上游重复序列家族的成员，而第二引物选自引物组，其中各引物特异于所述下游重复序列家族的成员；和

(ii)确定哪一种所述第一和第二引物促进所述侧翼序列的扩增。

根据优选的实施方案，所述克隆性细胞是淋巴细胞，所述标志物是重排的可变区基因节段。

最优选地，所述独特重复序列家族是V和D家族序列、V和J家族序列或D和J家族序列。在这点上，应当理解上游和下游侧翼序列可以是相同重复序列家族的相同或不同成员，或其可以是不同重复序列家族的成员。

本发明的该优选实施方案的扩增基于引物对的使用。“引物”核酸序列应当理解为任何包含序列核苷酸的分子或其功能性衍生物，其功能包括至少一个所述核苷酸序列的区域与靶核酸分子的杂交。衍生物可包括例如以这种增强或减弱杂交的方式修饰的封闭核酸(DNA或RNA)的衍生物。因此，“靶核酸分子”是任何包含核苷酸或其功能性衍生物的序列的分子，所述分子是目的分子，特别是侧翼序列，并因此是通过有效的初始探测步骤鉴定的受试物。核酸引物和靶核酸序列可包含非核酸成分。例如，核酸引物也可包含非核酸探测标签，例如荧光标签，或一些其它可有助于扩增过程的某些方面或有助于分析来自其结果的非核酸成分。类似地，靶核酸序列可包含非核酸成分。例如，靶核酸序列可连接抗体。其可发生于例如当所述靶核酸序列(即所述侧翼序列)存在于分离自个体的生物学样品中时，所述个体正进行对所述侧翼序列的免疫应答，例如对在细胞核水平上的自身免疫应答。在另一个例子中，所述核酸引物可以是包含肽主链接受核酸侧链的蛋白质核酸。

引物优选地是单链核苷酸序列且可以具有任何构象，包括，例如线性构象或开环构象，即所述核苷酸引物在形状上基本上是环形的但其末端区域不连接。核酸引物的“末端区域”是指位于引物各末端的区域。

以任何适合的方法将引物与来源于所述克隆性群体的核酸分子群体接触以促进与任何存在于受试样品中的侧翼序列相互作用。这些方法对本领域技术人员来说是已知的。在这点上，“相互作用”应当理解为任何形式的相互作用，例如互补核苷酸碱基对之间的杂交，或一些其它形式的相互作用，例如受试核酸分子的核酸部分之间键的形成。相互作用可通过键的形成或任何其它相互作用机制发生，所述键是例如但不限于共价键、氢键、范德瓦尔斯力。此处所有两个核酸分子之间的“杂交”应当理解为包含任何形式的所述分子之间的相互作用。为了促进这种相互作用，优选地使引物和靶核酸分子部分或完全变成单链一段时间，并处于足以使单链引物和单链侧翼序列之间发生杂交的条件下。

不以任何方式限制本发明的理论或操作模式的情况下，将来源于目的克隆性群体的核酸分子群体在杂交条件下与引物分子接触将导致双链形成，根据任何使用的扩增方法学，所述双链将导致侧翼序列和确定的间插标志物序列的扩增。在这点上，本发明基于一系列分离扩增反应(“多重”扩增反应)的建立，所述反应被设计用来鉴定下游和/或上游侧翼序列。“下游”和“上游”是指相对于标志物区域侧翼序列的位置。在这点上，通常理解为：下游序列是出现在标志物区域的3’侧的序列而上游区域是位于标志物区域的5’侧的序列。

在引物与靶核酸分子杂交后，由于DNA聚合酶作用的结果发生了延伸。为了最优地鉴定侧翼连接标志物序列的重复序列家族的特定成员，对于鉴定家族中该成员的引物来说，引物的结合和延伸尽可能地特异是优选的。增强特异性和抑制非特异性杂交和延伸的方法对本领域技术人员来说是已知的。其包括最优化扩增反应的条件和可包括使用封闭的核酸，特别是在引物的3’末端。

为了以简单而有效的方式鉴定侧翼于目的克隆性群体的标志物区域的特定核酸区域，建立扩增反应以进行系列反应来确定上游侧翼序列的本质，设计并行的系列反应以检测下游侧翼序列。关于上游侧翼序列，在第一次提到的本发明的优选实施方案中，建立扩增反应以使各反应包含针对下游侧翼序列的保守区的公用引物。“保守区”是指对该侧翼序列所属家族的所有成员共同的区域。优选地，受试保守区是共有序列。由于本发明的侧翼区域是已知的序列家族，因此共有序列的确定对本领域技术人员来说是驾轻就熟的。为了鉴定上游侧翼区域的本质，这些扩增反应(使用共有下游引物)中的每一个实际上将各自分别利用针对上游侧翼序列所属家族的所选成员的引物。优选地，建立足够的扩增反应以使针对各家族成员的引物在目的核酸群体的背景中可被检验到。扩增这些反应中的每一个后，只有一个是包含特异于上游侧翼区域的引物的反应，会导致扩增产物的产生。使用针对其它来自上游侧翼序列所衍生的家族成员之引物的反应不会导致扩增产物的产生。除了所有使用的引物是针对重复序列家族的特定成员外，第二个被提到的本发明优选的实施方案按相同的原理进行操作。然而，应当理解尽管使用多重扩增反应进行本发明的实施方案是优选的，但可以不需要建立这样大规模的多重扩增反应，所述多重扩增反应用于测试给定的侧翼序列家族的每一个和各个成员。例如，已知某些基因家族优势性地更常见表达该家族的一些成员而非其它成员。因此，本领域技术人员在进行一系列反应(所述反应用于检测在从第一组反应中获得阴性结果的事件中较不常见表达的成员)前，可以一开始就设计用于检测最常见表达的基因成员的扩增反应。

上述方法学提供了确定上游侧翼序列特异性本质的方法。然而，如上文所述，本发明的目标是鉴定侧翼上游和下游的序列，以提供常规监测表达侧翼为这些特异性基因序列的标志物区域的细胞群体。因此，本发明包括进一步系列扩增反应的设计和实施，所述反应按与上述实验相反方向设计。即，该进一步的系列实验设计用来鉴定下游侧翼序列的特异性本质，根据其对应的重复序列家族成员，通过使用针对这些扩增反应中的每一个中上游侧翼序列之保守区的引物以及特异性针对重复序列家族中的一员的引物来鉴定下游侧翼序列。如所详述的关于上游侧翼序列的鉴定，尽管建立检测重复序列家族的每一个和各个体成员的系列扩增反应是优选的，但应当理解扩增反应可设计使得首先只检验其中的一些成员。

也应当理解尽管对标志物序列上游和下游的侧翼序列都进行鉴定是优选的，但本发明的方法包括只鉴定其中一个侧翼序列。其可发生在例如当标志物区域只有一侧被重复序列家族成员连接的情况下。

进行扩增反应和确定已导致扩增产物产生的反应的方法对本领域技术人员来说是熟知的。

本发明基是于分析来源于细胞克隆性群体的核酸群体。对于许多类型的分析，通过研究纯克隆性细胞群体或至少有效纯的细胞群体，最容易进行侧翼序列的鉴定。“有效纯的”是指任何污染非克隆性细胞水平足够低，这样本发明的方法仍可以获得准确的结果。就分离克隆性群体而言，应当理解存在许多疾病病况，在所述疾病病况中合适生物学样品的收获会有效地导致只收获含有慢性扩增细胞群体的细胞群体。例如，许多形式的白血病特征在于收获自患者的诊断材料中存在白血病群体的有效纯群体。为了本发明的一些用途，在进行本发明方法之前对细胞样品进行一步或多步纯化步骤可能是必需的。例如，假如血液样品可能包含与正常的非骨髓细胞异源群体一起的致瘤性骨髓细胞，人们尝试根据CD34的表达分选血液样品，以使在最初步的纯化步骤中将骨髓细胞从非骨髓细胞中分离开。通过使用例如荧光激活细胞分选可常规地进行这类分离技术。

然而，对于各种对细胞样品种中多种不同克隆进行分析的分析中，纯克隆性群体不是必须的。侧翼于各克隆的标志物区域之序列可通过各特异性引物对进行鉴定，所述引物对导致所述克隆的标志物核酸扩增。在实际情况下，特异性侧翼序列形成部分标志物序列但，如果希望的话，通过分析侧翼序列内的标志物序列，在扩增之后，或甚至作为相同扩增反应的一部分，可对扩增产物进行额外的分析。

根据本发明方法进行检验的细胞样品可来源于任何合适的来源包括体外和体内的来源。如果克隆性细胞群体来源于体内来源，其可来源于任何生物学生物体。在这个意义上，生物学样品可来源于任何人或非人生物体。本发明涉及的非人生物体包括灵长类动物、牲畜动物(例如绵羊、猪、母牛、马、驴)、实验室实验动物(例如小鼠、仓鼠、兔、大鼠、豚鼠)、驯养伙伴动物(例如狗、猫)、禽类(例如鸡、鹅、鸭和其它家禽鸟类、狩猎鸟类、鸸鹋、鸵鸟)、捕获的野生或驯化动物(例如狐狸、袋鼠、澳洲野狗)、爬行类动物、鱼或原核生物。非人生物体也包括植物来源例如水稻、小麦、玉米、大麦或canola。植物生物体方面，本发明的方法特别有用，例如，用于通过想要的或不想要的细胞群体或不受控制的细胞亚群的增殖来鉴定植物的定植。

应当理解生物学样品可以是任何来源于生物体的材料样品。其包括天然存在于生物体的样品，例如哺乳动物的组织和体液(例如活检组织样品例如淋巴样品、血液、淋巴液、粪便或支气管分泌物)和被导入生物体体内然后被去除的样品，例如从经过肺灌洗的肺或从经过灌肠的结肠中提取的盐溶液。如果受试生物学样品是植物，生物学样品包括其繁殖材料。

根据本发明的方法进行检验的生物学样品可直接进行检验或在检验之前可要求一些形式的处理。例如，生物活检样品可在检验之前匀浆。当样品包含细胞材料时，可能必需提取或暴露存在于细胞材料中的核酸材料以进行所述核酸材料的分析。如果检验是设计用来检测mRNA标志物侧翼序列的，样品在检验前也可要求一些形式的刺激。在另一个例子中，样品可以在分析之前被部分纯化或富集。例如，对于包含非常多种细胞群的生物学样品来说，选出特定目的亚群是想要的。例如，和如上文所详述的，如果检测急性骨髓白血病的进展，富集CD34⁺的血液样品提供了分离血液样品的骨髓细胞组分以进行进一步分析的手段。通过除去非骨髓细胞，这在对功能水平影响不显著的情况下将要接受分析的细胞种类数目减少到最小。在另一个例子中，当特异性引物可获得时，在检验前扩增标志物核酸群体可以是想要的，或为了提供更大起始核酸分子群体，使用万能引物将受试样品的核酸群体作为整体进行扩增可以是想要的。

对最适合于根据此处公开的方法检验之样品种类的选择将依赖于被监测病况的本质。例如，如果致瘤性病况是淋巴白血病，那么血液样品、淋巴液样品或骨髓吸出物有可能提供合适的检测样品。当致瘤性病况是淋巴瘤时，淋巴结活检样品或血液或骨髓样品可能提供适合用于检测的组织来源。至于是否监测致瘤性细胞的原始来源或是否监测来自原始位点的瘤形成的转移或其它形式的扩散的存在也要求在考虑之中。在这点上，收获和检测来自任何一个生物体的许多不同样品可以是想要的。在另一个例子中，如果要检测淋巴细胞克隆的正常扩增，优选地收获来自次级淋巴器官的生物样品，如果免疫应答已提升使得扩增的克隆性群体进入到循环中，可收集血液或淋巴液样品。

本发明的方法提供了简单、有效和准确的分析细胞克隆性群体的方法，所述方法基于对侧翼于标志物区域的序列之特定形式的鉴定(如果那些侧翼序列对应于基因或归属于所定义的这些基因家族的基因区域的话)。在这点上，“分析”应当以其广义来理解并且包括，但不限于，标志物序列的表征、检测、分离、扩增或定量。现在，根据本方法对这些侧翼序列的分析有助于各种潜在的应用，包括，但不限于：

(i)富集来源于生物学样品的核酸群体(例如由此处鉴定的侧翼序列连接的核酸材料)的单元。当生物学样品包含高度异源的细胞类型混合物时这种富集方法学特别有用。

“富集”应当理解为增加表达标志物核酸区域的核酸分子相对于包含于受试样品中的背景非标志物核酸分子的比例。例如，通过降解、去除或其它减少不表达此处鉴定的特异性侧翼序列组合的核酸分子可实现富集。通过提供可设计用来减少来自受试样品的非相关核酸分子的富集步骤，而不是必需扩增目的核酸群受试检测方法提供了高度灵敏的不因非特异性扩增发生而折衷的工具。应当理解“富集”不限于从受试样品中除去所有非相关核酸分子的富集步骤。更确切地，其是指降低非相关核酸分子在受试样品中的浓度。因此该浓度可以有变化范围。

通过许多适合的技术中的任何一个或多个可对包含标志物序列的核酸分子进行富集，所述技术包括但不限于，将标签整合入针对根据本发明方法已鉴定的侧翼序列的探针分子中。所述标签可用于将分子偶连于(无论是通过共价键还是非共价键)至固相，以促进通过清洗或其它方式除去不想要的分子。除了任何起始的富集步骤外，也可以可选择地通过使用针对一个或两个侧翼序列的引物进行核酸扩增技术来实现富集。

(ii)提供在受试者中监测细胞克隆性群体的进展的单元。这最可能在疾病状态或非疾病状态的进展方面监测患者的情况下发生，所述状态的特征在于细胞群体的克隆扩增。例如，将本发明方法应用于患有恶性和非恶性肿瘤的病人是非常有潜力的。另一方面，当人们可尝试鉴定可通过患者个体的免疫系统引起的特异性免疫细胞扩增的本质时，在患有各种形式的免疫缺陷的患者的病况下使用本发明方法也是有潜力的。这种监测可通过例如上述描述于步骤(i)中的富集方法学进行。

(iii)根据本发明方法鉴定的侧翼序列提供了简单和有效的标记细胞群体的方法。例如，当这些序列被鉴定时，可常规地筛选细胞群体以鉴定(定性和/或定量地)表达该特异性标志物的细胞群体的存在。其可以在缺少任何后续富集步骤的情况下进行。对由细胞克隆性群体(例如致瘤性克隆)表达的单一突变的鉴定可以是高度复杂的并且难以实现，然而，本发明的方法提供了表征细胞克隆性群体的相对常规的方法，因而提供了用于进行检测/监测应用的标志物而不需进行复杂的基因分析。

(iv)当使用“共有”引物不能实现所述用途时，所述方法有助于细胞克隆性群体的检测。通过使用个别的针对各序列家族个别成员的引物，和使用单一的或多样的引物尝试在受试样品上进行核酸扩增，可以成功地验证克隆性群体的存在，并且通过鉴定其和确定侧翼序列，就能够随后监测该群体。

(v)当多个恶性克隆存在于恶性群体中时，通过使用大量的核酸扩增反应，其中每一个使用不同的引物对，这样一来全部不同引物的使用涵盖了针对两个侧翼家族个体成员的所有引物组合，并且通过以定量的方式进行核酸扩增，就可测量各种恶性亚克隆的相对大小。这可能在许多情况下是有价值的，所述情况包括但不限于在患有淋巴癌的患者体内跟踪恶性克隆。

(vi)当多个克隆存在于群体中时，例如在多克隆性群体中的正常免疫克隆，通过使用大量的核酸扩增反应，其中每一个使用不同的引物对，这样一来全部不同引物的使用涵盖了针对两个侧翼家族个体成员的所有引物组合，并且通过以定量的方式进行核酸扩增，就可测量各种克隆的相对大小。这可能在许多情况下是有价值，所述情况包括但不限于在正常生理学或异常病况学的病况下对免疫系统的研究。

因此，在另一方面提供了在哺乳动物中诊断/或监测细胞克隆性群体的方法，该克隆性细胞的特征在于标志物核酸分子，并且该标志物核酸分子侧翼为根据此处描述的方法鉴定的独特重复序列家族成员的序列，所述方法包括针对所述侧翼序列的存在与否，筛选来自所述哺乳动物的生物学样品的核酸序列。优选地，所述细胞克隆性群体是致瘤性细胞群体、免疫细胞群体或微生物群体。更优选地，所述免疫群体是T细胞群体或B细胞群体。

关于本发明的这个方面，“监测”应当理解为检测受试者的存在，或在最初诊断所述群体存在后，检测所述受试细胞克隆性群体的存在或水平。“监测”包括进行单独的一次性检测或经历数天、数周、数月或数年的系列检测。所述检测可因许多原因进行，所述原因包括，但不限于，预测处于康复状态的哺乳动物复发疾病的可能性、监测处理方案的有效性、检查康复患者的状态、在应用治疗性食物疗法之前或之后监测病况的进展、为了帮助作出关于合适治疗方法的决定或为了检验新形式的治疗方法。因此本发明的方法既用作临床工具也可作为研究工具。

在另一方面提供了诊断和/或监测哺乳动物疾病病况的方法，所述疾病病况的特征在于细胞克隆性群体，所述克隆性细胞的特征在于标志物核酸分子并且标志物核酸分子在一侧或两侧为根据权利要求1-15中任一项的方法鉴定的独特重复序列家族成员的序列，所述方法包括就所述侧翼序列的存在与否检测来自所述哺乳动物的生物学样品的核酸分子。

优选地，所述细胞克隆性群体是致瘤性细胞群体、免疫细胞群体或微生物群体。更优选地，所述免疫群体是T细胞群体或B细胞群体。

更优选地，所述细胞群体是致瘤性细胞群体，所述病况是恶性或非恶性肿瘤病况。

在另一个最优选的实施方案中，所述细胞群体是免疫细胞群体和所述病况是想要的或不想要的免疫应答，或免疫缺陷病况，例如AIDS。

在另一个优选的实施方案中，所述克隆性群体是微生物群体，所述病况是感染。

根据那些优选的本发明方面，如果所述克隆性群体是T或B细胞群体，所述标志物核酸区域是优选的重排免疫球蛋白或T细胞受体可变区基因节段，所述独特重复序列是V、D或J基因节段。

本发明的另一方面涉及在生物学样品中富集核酸分子群体的方法，所述核酸分子的特征在于标志物核酸分子并且所述标志物核酸分子在一侧或两侧为根据权利要求1-15中任一项的方法鉴定的独特重复序列家族成员的序列，所述方法包括增加包含所述侧翼序列核酸分子相对于不包含所述侧翼序列的核酸分子的比例。

本发明进一步特征更全面地描述于下列非限定性的实施例中。

                     实施例1

             说明治疗期间白血病定量的流程图

起始材料—包含各种大小范围从1个至非常多个细胞的淋巴细胞多克隆性群体，各克隆特征在于＞50个V片段中的一个，＞30个D片段中的一个和6个J片段中的一个

用于分析的白血病克隆具有未知的V、D和J节段(讨论中的V₂₃、D₇和J₄)

在诊断中使用白血病细胞作为相对纯的克隆性群体

确定侧翼J、V和D节段(在该情况下为J₄、V₂₃和D₇)。

分析上述起始材料

                用V₂₃和J₄引物对起始材料进行扩增反应

                             ↓

                用D₇和J₄引物对V₂₃和J₄扩增的材料进行扩

增反应

                             ↓

            扩增材料大部分或完全只来源于特征在于V₂₃、D₇

            和J₄的克隆。因此大大地富集了来自白血病克隆的

            材料。

                             ↓

            通过定量聚合酶链式反应和/或通过使用例如电泳

            或层析方法研究长度和/或序列来分析扩增材料的

            标志物区域以检测和/或定量在起始材料中的白血

            病克隆。

说明当侧翼序列未知时对多个克隆进行定量的流程图

            从被研究的材料中建立多个扩增反应，各反应使用

            不同引物对(对于每一对通常一个V和一个J，但

          也可以是一个V和一个D，或一个D和一个J)

                           ↓

          通过定量聚合酶链式反应和/或通过使用例如电泳

          或层析或使用不同引物对进行进一步扩增反应来研

          究长度和/或序列以分析扩增材料的标志物区域来

          检测和/或定量在起始材料中的白血病克隆

                       实施例2

             用于鉴定J、V、D区域的方法

筛选J

-taqman探针MJB2

-每管使用10ng诊断DNA，各管备份二份

-3A-J1、J1双份、J2、J2双份，......J6，J6双份

-28个管，包括对照

-使用92℃进行15秒，58℃进行1分钟X45个循环进行定量PCR

-在凝胶上的相关泳道上跑胶以验证大小

·A Ct大约27-35个循环时显示显性克隆的J区域

当已经确定特异性J区域时进行V筛选

V筛选

-aqman探针MJB2

-每管使用10ng诊断DNA，各管备份二份

-V特异性(41引物)-J特异性

-90个管，包括对照

-使用92℃进行15秒，58℃进行1分钟X45个循环进行定量PCR

-在凝胶上的相关泳道上跑胶以确定大小

·A Ct大约25-30个循环时显示显性克隆的V区域

D筛选

-aqman探针MJB2

-使用来自V筛选中的V特异性-J特异性大约1/100,000的稀释物作为模板

-D特异性(31引物)-J特异性

-65个管，包括对照

-使用file 40CX2(92℃进行15秒，40℃进行1分钟)进行定量PCR

44C×2

48C×2

52C×2

54C×2

58C×30

-在凝胶上的相关泳道上跑胶以确定大小

·A Ct大约20-25个循环时显示显性克隆的D区域

                     实施例3

      使用结合至侧翼序列的引物进行白血病定量

使用结合至侧翼序列的引物(如实施例1中的图示)和通过显示于实施例2中的方法鉴定的侧翼序列和引物进行白细胞定量的结果。将白血病细胞以已知的比例与正常血液细胞混合，然后使用所述方法对混合物中的白细胞比例进行定量。各符号表示来自不同样品混合物的结果。注意“真实”结果之间存在高度的一致性，如从细胞混合的比例和通过所述方法获得的测量值所推断的。

正在使用的确定侧翼序列的引物

特异于单个Vh节段的VH引物

  Vh  家族  Vh  区域  位置  序列5’至3’ SEQ ID NO：  1  2  CDR2  ATCAACCCTAACAGTGGTGG  1  1  3  CDR2  GCTGGCAATGGTAACACAAAA  2  1  8  CDR2  ACCTAACAGTGGTAACACAGG  3  1  18  CDR2  GGGATGGATCAGCGCTT  4  1  24  CDR2  TGGAGGTTTTGATCCTGAAGA  5  1  45  CDR2  ACACCTTTCAATGGTAACACC  6  1  46  CDR2  GGGAATAATCAACCCTAGTGG  7  1  58  CDR2  GATAGGATGGATCGTCGTTG  8  1  69  CDR2  TCATCCCTATCTTTGGTACAG  9  1  C  -  [见假基因表]  1  E  -  用1.69，CDR2  1  F  -  用1.24，CDR2  2  5  CDR2  ACTCATTTATTGGAATGATGATAAG  10  2  5var  Cdr2  ACTCATTTATTGGGATGATGATAAG  11  2  26  CDR2  ACACATTTTTTCGAATGACGAA  12  2  70  CDR2  TGATTGGGATGATGATAAATTCT  13  3  7  CDR2  AGCAAGATGGAAGTGAGAAA  14  3  9  CDR2  GGAATAGTGGTAGCATAGGC  15  3  9B  CDR2  TTGGAATAGTGGTAGCATAGG  16  3  11  CDR2  CATTAGTAGTAGTGGTAGTACCAT  17  “  “  L-V  内含子  GAACTAGAGACATTGAGTGGA  18  3  13  CDR2  TGGTACTGCTGGTGACACA  19  3  13A  CDR2  TCTCAGCTATTGGTACTGC  20  3  15  CDR2  GCGGTATTAAAAGCAAAACTG  21  3  16  -  [见假基因表]  3  19  -  [用V3-16，见假基因表]  3  20  CDR2  [GAATGGTGGTAGCACAGGT]  22  3  20B  CDR2  GCTGGAGTGGGTCTCT  23  3  21  CDR2  CATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTT  24  3  23  CDR2  GTGGGTCTCAGCTATTAGTG  25  3  30  CDR2  AGTGGGTGGCAGTTATATCA  26  3  30.3  用3.64，CDR1  3  30.5  用3.30，CDR2.  3  33  CDR2  AGTGGGTGGCAGTTATATGG  27  3  35  -  [用V3-16，见假基因表]  3  38  -  用3D，CDR2  3  43  CDR2  GGTCTCTCTTATTAGTTGGGA  28  3  47  -  [见假基因表]  3  48  用3.11，CDR2  [但安排非特异性3.48引物]  3  49  CDR2  ATGGTGGGACAACAGAATACA  29  3  53  CDR2  GTGGGTCTCAGTTATTTATAGC  30  “  “  FR1  AGCTGGTGGAGACTGGA  31  3  64  CDR2  CTCAGCTATTAGTAGTAATGGG  32  3  66  -  用3.53，CDR2  3  72  CDR2  AAACAAAGCTAACAGTTACACC  33  3  73  CDR2  AAGCAAAGCTAACAGTTACG  34  3  74  CDR2  TCACGTATTAATAGTGATGGGA  35  3  D  CDR2  TCCATTAGTGGTGGTAGCA  36  3  H  -  [见假基因表]  4  4  CDR1  CCATCAGCAGTAGTAACTGG  37 “  “  FR3 top  GTGGATTGGGCGTATCTATAC  38  4  4B  -  TAG TAA CTG GTG GAG TTG  GG  39  4  28  CDR1  用4.4，CDR1  4  28  FR1  [TGCGCTGTCTCTGGTTA]  40  4  28B  密码  39  GCAGTAGTAACTGGTGGG  41  4  28C  密码  97  GCTCTGTGACCGCCGT  42  4  28D  -  同28C  4  30.1  FR1  GACTGGTGAAGCCTTCACA  43  4  30.2  -  用4.30.1，FR1  4  30.2B  密码  9.1  TGC AGG AGT CCG GCT  44  4  30.4  -  用4.30.1，FR1  4  31  -  用4.30.1，FR1  4  31b  密码  83.3  ACC ATA TCA GTA GAC  ACG TCT  45  4  34  FR1  TATGGTGGGTCCTTCAGTG  46  4  34B  -  同4.34  4  39  LV  内含子  AGGGCTCACTGTGGGTTTT  47  4  39B  密码  79.3  AGA GTC GAG TCA CCA  TAT CC  48  4  59  LV  内含子  CAGCTCCCAGATGTGAGTA  49  4  59B  LV  内含子  同4.59  4  61  FR1  GTCTCTGGTGGCTCCG  50  4  61B  同4.61  4  B  -  同4.28，FR1  5  51  CDR2  CTGGTGACTCTGATACCAGA  51  5  78  -  用5-5引物，CDR2  5  A  CDR2  ATCCTAGTGACTCTTATACCAAC  52  6  1  CDR2  CATACTACAGGTCCAAGTGG  53  7  4.1  CDR2  GATCAACACCAACACTGGG  54  7  81  -  用7-4.1 CDR2引物

J_H特异性引物

  J  ELJH  下游  位置  序列5’至3’ SEQ ID NO：  1  60bp  TCCCCAAGTCTGAAGCCA  55  1c  23  ACA TGG CTC CCC  GCT  56  2  9bp  GGAGGGGGCTGCAGTG  57  2c  34  GGC TGG TGC TGG  ACA G  58  [3]  12bp  AGAAAGGAGGCAGAAGGAA  59  3B 2002  46  CCCAGCTCCAGGACAGA  60  3c  GAA AGG AGG CAG  AAG GAA A  61  [4  2002]  18bp  TCGAGTTAACGGAGGAGA  62  [4A 2002]  23bp  AAACCTCGAGTTAACGGAG  63  [4B 2002]  36bp  AAATGCAGCAAAACCCTTC  64  4C 2002  83/78/73bp  GGGGCTCTCTTGGCAGG  65  4d 2003  86/81/76bp  TCC GGG GCT CTC TTG  G  66  4IVS  82/78/73bp  TGCTCCGGGGCTCTCTTGGCAGGA  67  4e  19/20  GAG TTA AAG GAG  GAG A  68  4f  58/63/65  CCC CCA GCA CCC  TTA TT  69  5  35bp  GCAAGCTGAGTCTCCCT  70  5c  24  GTC TCC CTA AGT  GGA CTC A  71  6  10bp  ACAAAGGCCCTAGAGTGG  72  6c  35  AAA CCC CAC AGG CAG  TAG  73  1双份  83  CGACCTCCTTTGCTGAG  74  2双份  79  GGCTGCAGACCCCAGA  75  3双份  80  CAGCGCAGACCAAGGA  76  4双份  Ca.145  TTGCCCCTCGTCTGTGT  77  5双份  84  CTTTCTTTCCTGACCTCCA  A  78  6双份  31bp  CCCACAGGCAGTAGCAG  79

用于V-D-J重排的DH引物

  IgH  多样性  基础序列  SEQ  ID NO：  编辑的序列  SEQ ID  NO：  D1.1标准  Ggtacaact  80  aacgacggccagtGgtacaact  129  D1.1较长  ggtacaactgga  81  aacgacggccagtggtacaactgga  130  D1.07标准  Ggtataactggaact  82  aacgacggccagtGgtataactggaact  131  D1.07较短  Ggtataactgga  83  aacgacggccagtGgtataactgga  132  D1.14标准  Ggtataacc  84  aacgacggccagtGgtataacc  133  D1.14较长  Ggtataacgga  85  aacgacggccagtGgtataaccgga  134  D1.20标准  ggTataactggaacg  86  aacgagccgcagtggTataactggaacg  135  D1.20较短  -用1.7较短  -用1.7较短  D1.26标准  Ggtatagtgggag  87  aacgacggccagtGgtatagtgggag  136  D1.26较长  Ggtatagtgggagctac  88  aacgacggccagtGgtatagtgggagctac  137  D2.02标准  Aggatattgtagtagtaccagc  89  aacgacggccagtggatattgtagtagtaccagc  138  D2.02较短  Aggatattgtagtagtacc  90  aacgacggccagtAggatattgtagtagtacc  139  D2.08标准  Aggatattgtactaatggtgta  91  aacgacggccagtAggatattgtactaatggtgta  140  D2.08较长  Aggatattgtactaatggtgtatgc  92  aacgacggccagtgatattgtactaatggtgtatgc  141  D2.15标准  Aggatattgtagtggtggtagc  93  aacgacggccagtgatattgtagtggtggtagc  142  D2.15较长  Aggatattgtagtggtggtagctg  94  aacgacggccagtatattgtagtggtggtagctg  143  D2.21标准  Agcataattgtggtg  95  aacgacggccagtAgcatattgtggtg  144  D2.21较长  Agcatattgtggtggtga  96  aacgacggccagtAgcatattgtggtggtga  145  D3.03标准  gTattacgatttttgga  97  aacgacggccagtgTattacgatttttgga  146  D3.03较长  gTattacgatttttggagtg  98  aacgacggccagtgTattacgatttttggagtg  147  D3.09标准  Gtattacgatattttgac  99  aacgacggccagtGtattacgatattttgac  148  D3.09较长  Gtattacgatattttgactg  100  aacgacggccagtGtattacgatattttgactg  149  D3.10标准  Gtattactatggttcgggga  101  aacgacggccagtGtattactatggttcgggga  150  D3.10较短  Gtattactatggttc  102  aacgacggccagtGtattactatggttc  151  D3.16标准  gTtatgattacgtttggg  103  aacgacggccagtgTtatgattacgtttggg  152  D3.16较长  gTtatgattacgtttggggga  104  aacgacggccagtgTtatgattacgtttggggga  153  D3.22标准  Gtattactatgatag  105  aacgacggccagtGtattactatgatag  154  D3.22较长  Gtattactatgatagtagtg  106  aacgacggccagtGtattactatgatagtagtg  155  D4.04&D4.11  标准  Tgactacagta  107  aacgacggccagtTgactacagta  156  D4.04&D4.11  longer较长  Tgactacagtaac  108  aacgacggccagtTgactacagtaac  157  D4.17标准  Tgactacggtg  109  aacgacggccagtTgactacggtg  158  D4.17较长  Tgactacgggtgact  110  aacgacggccagtTgactacggtgact  159  D4.23标准  Tgactacggtggt  111  aacgacggccagtTgactacggtggt  160  D4.23较长  Tgactacggtggtta  112  aacgacggccagtTgactacggtggtta  161  D5.05&D5.18  标准  Gtggataca  113  aacgacggccagtGtggataca  162  D5.05&D5.18  较长  Gtggatacagct  114  aacgacggccagtGtggatacagct  163  D5.12标准  Gtggatatagtggctac  115  aacgacggccagtGtggatatagtggctac  164  D5.12较长  Gtgggatatagtggctacgat  116  aacgacggccagtGtggatatagtggctacgat  165  D5.24标准  Gtagagatg  117  aacgacggccagtGtagagatg  166  D5.24较长  Gtagagatggctaca  118  aacgacggccagtGtagagatggctaca  167  D6.06标准  Gagtatagcagct  119  aacgacggccagtGagtatagcagct  168  D6.06较长  Gagtatagcagctgct  120  aacgacggccagtGagtatagcagctgct  169  D6.13标准  Gggtatagcagca  121  aacgacggccagtGggtatagcagca  170  D6.13较长  Gggtatagcagcagctg  122  aacgacggccagtGggtatagcagcagctg  171  D6.19标准  Gggtatagcagtgg  123  aacgacggccagtGggtatagcagtgg  172  D6.19较长  Gggtatagcagtggctgg  124  aacgacggccagtggtatagcagtggctgg  173  D6.25标准  Gggtatagcagcgg  125  aacgacggccagtGggtatagcagcgg  174  D7.27标准  Ctaactgg  126  aacgacggccagtCtaactgg  175  D7.27  Ctaactgggg  127  aacgacggccagtCtaactgggg  176  13碱基USP  适配子  aacgacggccagt  128  -

特异于单个V节段的TCRβ引物

  TCR V  家族节段  等位基因  矫正到T_m＝50℃的引物序列  引物位置  SEQ  ID  NO：  1^*  AGA CAG AAA GCT AAG AAA TCC  CDR2 49.3  177  2  CA AAT CTT GGG GCA GAA AG  CDR2 50.1  178  3-1  TA AGA AAT TTC TGA AGA TAA  TGT TTA G  CDR2 55.2  179  3-2^*  TC TAC AGT AAC AAG GAG CCA  CDR2 61.3  180  4-1  CT ATG AGA AAC TCT CTA TAA  ATG AA  CDR2 69.3  181  4-2  TGT CTA CAA CTT TAA AGA ACA  GAC  CDR2 66.2  182  4-3  TAC AGT CTT GAA GAA CGG GT  CDR2 66.2  183  5-1  TTT GAA TAC TTC AGT GAG ACA C  CDR2 61.1  184  5-3  GCT AAT GAG TTA AGG AGA TCA G  CDR2 68.1  185  5-4  AGT ATT ATA GGG AGG AAG AGA  AT  CDR2 66.3  _{dimer，but try it anyway}  186  5-5/5-7  TAT GAG AAA GAA GAG AGA GGA  CDR2 67.3  187  5-6  TGA GGA GGA AGA GAG ACA G  CDR2 67.3  188  5-7  用5-5  编辑序列中  无独特碱基  5-8  CCT TTG GTA TGA CGA GGG T  CDR2 59.1  189  6-1  GCT GAT TTA TTA CTC AGC TTC  CDR2 58.2  190  6-2/6-3  ACT CAG TTG GTG AGG GTA CA  CDR2 61.3  191  6-3  用6-2  -  6-4  AGA TGT ACC CAG GAT ATG AGA  CDR2 28.3  192  6-5  GGT GCT GGT ATC ACT GAC C  CDR2 68.1  193  6-6  CAG GCA TGG GGC TGA A  CDR2 51.2？5  loci  194  6-7  CAG TTG CTG CTG CTC T  CDR2 61.2  195  6-8  GCT GGT ACT ACT GAC AAA GA  CDR2 70.2  196  6-9  ATG GGG CTG AGG CGC  CDR2 52.3  ？redesign  197  7-1  AAT TTA CTT CCA AGG CAA GGA  CDR2 60.2  198  7-2  TAA TTT ACT TCC AAG GCA ACA G  CDR2 60.2  199  7-3  GGG TGC GGC AGA TGA C  CDR2 68.3  200  7-4  TGA CTT ACT CCC AGA GTG AT  CDR2 59.3  dimer，but try it.  201  7-5^*  GCT CAG TGA TCA ATT CTC CA  CDR2 78.1？2  loci  202  7-6/7-7  CTT CAA TTA TGA AGC CCA ACA  CDR2 66.2  203  7-7  用7-6 ^{Only 1 unigon to 7.7 conton 20 position 1}  7-8  GAT CGC TTC TTT GCA GAA  CDR2 79.3？2  loci  204  7-9  GAA GCT CAA CTA GAA AAA TCA A  CDR2 70.1；3′  错配，1 of 4  205  9  CGA TTC TCC GCA CAA CA  CDR2 80.2  206  10-1  ATT ACT CAT ATG GTG TTC ACG  AC  CDR2 61.3；-4  错配，1 of 3  207  10-2  TCA GCA GCT GCT GAT ATT  CDR2 61.3  208  10-3  CAC AGA GAC AGG AAC ACC A  CDR1 18.3  209  11-1  GTT CAA TTT CAG GAT GAG AGT  CDR2 60.3  210  11-2  GAT TCA GTT TCA GAA TAA CGG T  CDR2 60.3  211  11-3  GAT TCG ATA TGA GAA TGA GGA A  CDR2 60.3  212  12-1^*  CTG CAG CTG GAC CCT C  CDR2 61.3  213  12-2^*  GCA GGT ATG CCC ACA GAG  Cdr2 74.3  214  12-3  CCA ATT TCA GGC CAC AAC TC  CDR1 31.2  215  12-4  CCA ATT TCA GGA CAC GAC TA  CDR1 31.2 _{dimer - try in anyway}  216  12-5  TAC TTC CGC AAC CGG G  CDR2 60.1  217  13  CTC ATT TCG TTT TAT GAA AAG  ATG  CDR2 60.3  218  14  TGT TAC ATT TTG TGA AAG AGT  CT  CDR2 60.3  219  15  CCC TGA TAA CTT CCA ATC CAG  CDR2 79.2  220  16  AGG TCC TGA AAA ACG AGT TC  CDR2 50.3  221  17  CCT TCC AGT ACC AAA ACA TTG  CDR2 66.1  222  18  AAG GTC TGA AAT TCA TGG TTT  ATC  CDR2 56.1  223  19  TGA CTT TCA GAA AGG AGA TAT  AG  CDR2 72.1  224  20-1  GGG CTC CAA GGC CAC A  CDR2 68.3  225  21-1^*  AGA AAG CAG AAA TAA TCA ATG  AG  CDR2 74.3  226  23-1  TTT TGA TTT CCT TTC AGA ATG  AAC  CDR2 60.1  227  24-1  TTG ATC TAT TAC TCC TTT GAT  GTC  CDR2 59.3  228  25-1  GAG ATC TTT CCT CTG AGT CA  CDR2 76.3  229  26^*  CAC CTG GCA CTG GGA G  CDR2 61.2  230  27  GGC TGG GCT TAA GGC A  CDR2 52.2  231  28  ATC TAT TTC TCA TAT GAT GTT  AAA ATG  CDR2 61.3  232  29-1  TGA CAC TGA TCG CAA CTG  CDR2 56.1  233  30  ACA GGC TGC AGG CAG  CDR2 48.2，12_{loci，allele do’os won’t blod}  234

TCR β J节段特异性引物

  Jβ  节段  与J端  的距离  引物  SEQ ID  NO：  J1.1  TTT TCC CTG TGA CGG ATC T  235  J1.2  CAG GAC AGA GTC CTC CCT  236  J1.3  AGC CCC TTT TTG CAA GTT C  237  J1.4  AAC TCC GAC CTT ATG ATA CAC T  238  J1.5  TGC CTT CAA GGG ACA ATG G  239  J1.6  GAT CAT TGC AGT CAA ACC  240  J2.1  GGC TGG GCT GCT CAC  241  J2.2  ATC CCG CCC TCT CGG  242  J2.3  CAG TTC CGG GGC TTC AG  243  J2.4  GAG CGC AGT CTC GTC C  244  J2.5  CGC AAA AAC CAG ACC CAA  245  J2.6  CCG CCT TCC ACC TGA A  246  J2.7  GGG ACC GAG GGG CTG  247

本领域技术人员会认识到除了特别描述的外此处描述发明可能有变化和修饰。应当理解本发明包括所有这类变化和修饰。本发明也包括本说明书中涉及或指出的所有步聚、特征、组合物和化合物，单个地或集体地，和任何一个或所有由任何二个和多个所述步骤或特征的组合。

                                 序列表

<110>The Flinders University

     Flinders Medical Centre

<120>分析标志物核酸分子的方法

<130>12448300/TDO

<150>2003902299

<151>2003-05-13

<160>247

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>VH引物

<400>1

atcaacccta acagtggtgg                                            20

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>VH引物

<400>2

 gctggcaatg gtaacacaaa a                                         21

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>VH引物

<400>3

acctaacagt ggtaacacag g                                          21

<210>4

<211>17

<212>DNA

<213>VH引物

<400>4

gggatggatc agcgctt                                               17

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>VH引物

<400>5

tggaggtttt gatcctgaag a                                          21

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>VH引物

<400>6

 acacctttca atggtaacac c                                         21

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>VH引物

<400>7

gggaataatc aaccctagtg g                                          21

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>VH引物

<400>8

gataggatgg atcgtcgttg                                            20

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>VH引物

<400>9

tcatccctat ctttggtaca g                                          21

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>VH引物

<400>10

actcatttat tggaatgatg ataag                                      25

<210>11

<211>25

<212>DNA

<213>VH引物

<400>11

actcatttat tgggatgatg ataag                                      25

<210>12

<211>22

<212>DNA

<213>VH引物

<400>12

acacattttt tcgaatgacg aa                                         22

<210>13

<211>23

<212>DNA

<213>VH引物

<400>13

tgattgggat gatgataaat tct                                        23

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>VH引物

<400>14

agcaagatgg aagtgagaaa                                            20

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>VH引物

<400>15

ggaatagtgg tagcataggc                                            20

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>VH引物

<400>16

ttggaatagt ggtagcatag g                                          21

<210>17

<211>24

<212>DNA

<213>VH引物

<400>17

cattagtagt agtggtagta ccat                                       24

<210>18

<211>21

<212>DNA

<213>VH引物

<400>18

gaactagaga cattgagtgg a                                          21

<210>19

<211>19

<212>DNA

<213>VH引物

<400>19

tggtactgct ggtgacaca                                             19

<210>20

<211>19

<212>DNA

<213>VH引物

<400>20

tctcagctat tggtactgc                                             19

<210>21

<211>21

<212>DNA

<213>VH引物

<400>21

gcggtattaa aagcaaaact g                                          21

<210>22

<211>19

<212>DNA

<213>VH引物

<400>22

gaatggtggt agcacaggt                                             19

<210>23

<211>16

<212>DNA

<213>VH引物

<400>23

gctggagtgg gtctct                                                16

<210>24

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<212>DNA

<213>VH引物

<400>24

catccattag tagtagtagt agtt                                       24

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>VH引物

<400>25

gtgggtctca gctattagtg                                            20

<210>26

<211>20

<212>DNA

<213>VH引物

<400>26

agtgggtggc agttatatca                                            20

<210>27

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<212>DNA

<213>VH引物

<400>27

agtgggtggc agttatatgg                                            20

<210>28

<211>21

<212>DNA

<213>VH引物

<400>28

ggtctctctt attagttggg a                                          21

<210>29

<211>21

<212>DNA

<213>VH引物

<400>29

atggtgggac aacagaatac a                                          21

<210>30

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<212>DNA

<213>VH引物

<400>30

gtgggtctca gttatttata gc                                         22

<210>31

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<212>DNA

<213>VH引物

<400>31

agctggtgga gactgga                                               17

<210>32

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<212>DNA

<213>VH引物

<400>32

ctcagctatt agtagtaatg gg                                         22

<210>33

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<212>DNA

<213>VH引物

<400>33

aaacaaagct aacagttaca cc                                         22

<210>34

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<212>DNA

<213>VH引物

<400>34

aagcaaagct aacagttacg                                            20

<210>35

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<212>DNA

<213>VH引物

<400>35

tcacgtatta atagtgatgg ga                                         22

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<212>DNA

<213>VH引物

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tccattagtg gtggtagca                                             19

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<212>DNA

<213>VH引物

<400>37

ccatcagcag tagtaactgg                                            20

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<212>DNA

<213>VH引物

<400>38

gtggattggg cgtatctata c                                          21

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<212>DNA

<213>VH引物

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tagtaactgg tggagttggg                                            20

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<212>DNA

<213>VH引物

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tgcgctgtct ctggtta                                               17

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<212>DNA

<213>VH引物

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gcagtagtaa ctggtggg                                              18

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<212>DNA

<213>VH引物

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gctctgtgac cgccgt                                                16

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<212>DNA

<213>VH引物

<400>43

gactggtgaa gccttcaca                                             19

<210>44

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<212>DNA

<213>VH引物

<400>44

tgcaggagtc cggct                                                 15

<210>45

<211>21

<212>DNA

<213>VH引物

<400>45

accatatcag tagacacgtc t                                          21

<210>46

<211>19

<212>DNA

<213>VH引物

<400>46

tatggtgggt ccttcagtg                                             19

<210>47

<211>19

<212>DNA

<213>VH引物

<400>47

agggctcact gtgggtttt                                             19

<210>48

<211>20

<212>DNA

<213>VH引物

<400>48

agagtcgagt caccatatcc                                            20

<210>49

<211>19

<212>DNA

<213>VH引物

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<213>VH引物

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<213>VH引物

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<213>VH引物

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<210>54

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<211>16

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<213>JH引物

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<211>16

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cagcgcagac caagga                                                16

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<211>17

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ctttctttcc tgacctccaa                                            20

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<211>17

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<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>80

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<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>81

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<400>82

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<211>12

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<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>83

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<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>84

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<211>12

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<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>85

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<211>15

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<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>86

ggtataactg gaacg                                                 15

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<211>13

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<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>87

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<211>17

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<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>88

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<211>22

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<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>89

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<211>19

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<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>90

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<211>22

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>91

aggatattgt actaatggtg ta                                         22

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<211>25

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>92

aggatattgt actaatggtg tatgc                                      25

<210>93

<211>22

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>93

aggatattgt agtggtggta gc                                         22

<210>94

<211>24

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>94

aggatattgt agtggtggta gctg                                       24

<210>95

<211>14

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>95

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<211>18

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>96

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<211>17

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>97

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<211>20

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>98

gtattacgat ttttggagtg                                            20

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<211>18

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<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>99

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<210>100

<211>20

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>100

gtattacgat attttgactg                                            20

<210>101

<211>20

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>101

gtattactat ggttcgggga                                            20

<210>102

<211>15

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>102

gtattactat ggttc                                                 15

<210>103

<211>18

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>103

gttatgatta cgtttggg                                              18

<210>104

<211>21

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>104

gttatgatta cgtttggggg a                                          21

<210>105

<211>15

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>105

gtattactat gatag                                                 15

<210>106

<211>20

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>106

gtattactat gatagtagtg                                            20

<210>107

<211>11

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>107

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<210>108

<211>13

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>108

tgactacagt aac                                                   13

<210>109

<211>11

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>109

tgactacggt g                                                     11

<210>110

<211>14

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>110

tgactacggt gact                                                  14

<210>111

<211>13

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>111

tgactacggt ggt                                                   13

<210>112

<211>15

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>112

tgactacggt ggtta                                                 15

<210>113

<211>9

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>113

gtggataca                                                        9

<210>114

<211>12

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>114

gtggatacag ct                                                    12

<210>115

<211>17

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>115

gtggatatag tggctac                                               17

<210>116

<211>20

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>116

gtggatatag tggctacgat                                            20

<210>117

<211>9

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>117

gtagagatg                                                        9

<210>118

<211>15

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>118

gtagagatgg ctaca                                                 15

<210>119

<211>13

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>119

gagtatagca gct                                                   13

<210>120

<211>16

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>120

gagtatagca gctgct                                                16

<210>121

<211>13

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>121

gggtatagca gca                                                    13

<210>122

<211>17

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>122

gggtatagca gcagctg                                               17

<210>123

<211>14

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>123

gggtatagca gtgg                                                  14

<210>124

<211>18

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>124    

gggtatagca gtggctgg                                              18

<210>125

<211>14

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>125

gggtatagca gcgg                                                  14

<210>126

<211>8

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>126

ctaactgg                                                         8

<210>127

<211>10

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>127

ctaactgggg                                                       10

<210>128

<211>13

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>128

aacgacggcc agt                                                   13

<210>129

<211>22

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>129

aacgacggcc agtggtacaa ct                                         22

<210>130

<211>25

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>130

aacgacggcc agtggtacaa ctgga                                      25

<210>131

<211>28

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>131

aacgacggcc agtggtataa ctggaact                                   28

<210>132

<211>25

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>132

aacgacggcc agtggtataa ctgga                                      25

<210>133

<211>22

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>133

aacgacggcc agtggtataa cc                                         22

<210>134

<211>25

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>134

aacgacggcc agtggtataa ccgga                                      25

<210>135

<211>28

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>135

aacgacggcc agtggtataa ctggaacg                                   28

<210>136

<211>26

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>136

aacgacggcc agtggtatag tgggag                                     26

<210>137

<211>30

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>137

aacgacggcc agtggtatag tgggagctac                                 30

<210>138

<211>34

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>138

aacgacggcc agtggatatt gtagtagtac cagc                            34

<210>139

<211>32

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>139

aacgacggcc agtaggatat tgtagtagta cc                              32

<210>140

<211>35

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>140

aacgacggcc agtaggatat tgtactaatg gtgta                           35

<210>141

<211>36

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>141

aacgacggcc agtgatattg tactaatggt gtatgc                          36

<210>142

<211>33

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>142

aacgacggcc agtgatattg tagtggtggt agc                             33

<210>143

<211>34

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>143

aacgacggcc agtatattgt agtggtggta gctg                            34

<210>144

<211>27

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>144

aacgacggcc agtagcatat tgtggtg                                    27

<210>145

<211>31

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>145

aacgacggcc agtagcatat tgtggtggtg a                               31

<210>146

<211>30

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>146

aacgacggcc agtgtattac gatttttgga                                 30

<210>147

<211>33

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>147

aacgacggcc agtgtattac gatttttgga gtg                             33

<210>148

<211>31

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>148

aacgacggcc agtgtattac gatattttga c                               31

<210>149

<211>33

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>149

aacgacggcc agtgtattac gatattttga ctg                             33

<210>150

<211>33

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>150

aacgacggcc agtgtattac tatggttcgg gga                             33

<210>151

<211>28

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>151

aacgacggcc agtgtattac tatggttc                                   28

<210>152

<211>31

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>152

aacgacggcc agtgttatga ttacgtttgg g                               31

<210>153

<211>34

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>153

aacgacggcc agtgttatga ttacgtttgg ggga                            34

<210>154

<211>28

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>154

aacgacggcc agtgtattac tatgatag                                   28

<210>155

<211>33

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>155

aacgacggcc agtgtattac tatgatagta gtg                             33

<210>156

<211>24

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>156

aacgacggcc agttgactac agta                                       24

<210>157

<211>26

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>157

aacgacggcc agttgactac agtaac                                     26

<210>158

<211>24

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>158

aacgacggcc agttgactac ggtg                                       24

<210>159

<211>27

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>159

aacgacggcc agttgactac ggtgact                                    27

<210>160

<211>26

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>160

aacgacggcc agttgactac ggtggt                                     26

<210>161

<211>28

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>161

aacgacggcc agttgactac ggtggtta                                   28

<210>162

<211>22

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>162

aacgacggcc agtgtggata ca                                         22

<210>163

<211>25

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>163

aacgacggcc agtgtggata cagct                                      25

<210>164

<211>30

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>164

aacgacggcc agtgtggata tagtggctac                                 30

<210>165

<211>33

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>165

aacgacggcc agtgtggata tagtggctac gat                             33

<210>166

<211>22

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>166

aacgacggcc agtgtagaga tg                                         22

<210>167

<211>28

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>167

aacgacggcc agtgtagaga tggctaca                                   28

<210>168

<211>26

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>168

aacgacggcc agtgagtata gcagct                                     26

<210>169

<211>29

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>169

aacgacggcc agtgagtata gcagctgct                                  29

<210>170

<211>26

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>170

aacgacggcc agtgggtata gcagca                                     26

<210>171

<211>30

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>171

aacgacggcc agtgggtata gcagcagctg                                 30

<210>172

<211>27

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>172

aacgacggcc agtgggtata gcagtgg                                    27

<210>173

<211>30

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>173

aacgacggcc agtggtatag cagtggctgg                                 30

<210>174

<211>27

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>174

aacgacggcc agtgggtata gcagcgg                                    27

<210>175

<211>21

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>175

aacgacggcc agtctaactg g                                          21

<210>176

<211>23

<212>DNA

<213>用于V-D-J重排的DH引物

<400>176

aacgacggcc agtctaactg ggg                                        23

<210>177

<211>21

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>177

agacagaaag ctaagaaatc c                                          21

<210>178

<211>19

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>178

caaatcttgg ggcagaaag                                             19

<210>179

<211>27

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>179

taagaaattt ctgaagataa tgtttag                                    27

<210>180

<211>20

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>180

tctacagtaa caaggagcca                                            20

<210>181

<211>25

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>181

ctatgagaaa ctctctataa atgaa                                      25

<210>182

<211>24

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>182

tgtctacaac tttaaagaac agac                                       24

<210>183

<211>20

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>183

tacagtcttg aagaacgggt                                            20

<210>184

<211>22

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>184

tttgaatact tcagtgagac ac                                         22

<210>185

<211>22

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>185

gctaatgagt taaggagatc ag                                         22

<210>186

<211>23

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>186

agtattatag ggaggaagag aat                                        23

<210>187

<211>21

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>187

tatgagaaag aagagagagg a                                          21

<210>188

<211>19

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>188

tgaggaggaa gagagacag                                             19

<210>189

<211>19

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>189

cctttggtat gacgagggt                                             19

<210>190

<211>21

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>190

gctgatttat tactcagctt c                                          21

<210>191

<211>20

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>191

actcagttgg tgagggtaca                                            20

<210>192

<211>21

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>192

agatgtaccc aggatatgag a                                          21

<210>193

<211>19

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>193

ggtgctggta tcactgacc                                             19

<210>194

<211>16

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>194

 caggcatggg gctgaa                                               16

<210>195

<211>16

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>195

cagttgctgc tgctct                                                16

<210>196

<211>20

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>196

gctggtacta ctgacaaaga                                            20

<210>197

<211>15

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>197

atggggctga ggcgc                                                 15

<210>198

<211>21

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>198

aatttacttc caaggcaagg a                                          21

<210>199

<211>22

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>199

taatttactt ccaaggcaac ag                                         22

<210>200

<211>16

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>200

gggtgcggca gatgac                                                16

<210>201

<211>20

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>201

tgacttactc ccagagtgat                                            20

<210>202

<211>20

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>202

 gctcagtgat caattctcca                                           20

<210>203

<211>21

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>203

cttcaattat gaagcccaac a                                          21

<210>204

<211>18

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>204

gatcgcttct ttgcagaa                                              18

<210>205

<211>22

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>205

gaagctcaac tagaaaaatc aa                                         22

<210>206

<211>17

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>206

cgattctccg cacaaca                                               17

<210>207

<211>23

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>207

attactcata tggtgttcac gac                                        23

<210>208

<211>18

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>208

tcagcagctg ctgatatt                                              18

<210>209

<211>19

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>209

cacagagaca ggaacacca                                             19

<210>210

<211>21

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>210

gttcaatttc aggatgagag t                                          21

<210>211

<211>22

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>211

gattcagttt cagaataacg gt                                         22

<210>212

<211>22

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>212

gattcgatat gagaatgagg aa                                         22

<210>213

<211>16

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>213

ctgcagctgg accctc                                                16

<210>214

<211>18

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>214

gcaggtatgc ccacagag                                              18

<210>215

<211>20

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>215

ccaatttcag gccacaactc                                            20

<210>216

<211>20

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>216

ccaatttcag gacacgacta                                            20

<210>217

<211>16

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>217

tacttccgca accggg                                                16

<210>218

<211>24

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>218

ctcatttcgt tttatgaaaa gatg                                       24

<210>219

<211>23

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>219

tgttacattt tgtgaaagag tct                                        23

<210>220

<211>21

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>220

ccctgataac ttccaatcca g                                          21

<210>221

<211>20

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>221

aggtcctgaa aaacgagttc                                            20

<210>222

<211>21

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>222

ccttccagta ccaaaacatt g                                          21

<210>223

<211>24

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>223

aaggtctgaa attcatggtt tatc                                       24

<210>224

<211>23

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>224

tgactttcag aaaggagata tag                                        23

<210>225

<211>16

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>225

gggctccaag gccaca                                                16

<210>226

<211>23

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>226

agaaagcaga aataatcaat gag                                        23

<210>227

<211>24

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>227

ttttgatttc ctttcagaat gaac                                       24

<210>228

<211>24

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>228

ttgatctatt actcctttga tgtc                                       24

<210>229

<211>20

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>229

gagatctttc ctctgagtca                                            20

<210>230

<211>16

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>230

cacctggcac tgggag                                                16

<210>231

<211>16

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>231

ggctgggctt aaggca                                                16

<210>232

<211>27

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>232

atctatttct catatgatgt taaaatg                                    27

<210>233

<211>18

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>233

tgacactgat cgcaactg                                              18

<210>234

<211>15

<212>DNA

<213>用于单个V节段的TCR beta引物

<400>234

acaggctgca ggcag                                                 15

<210>235

<211>19

<212>DNA

<213>TCR beta J节段的特异性引物

<400>235

ttttccctgt gacggatct                                             19

<210>236

<211>18

<212>DNA

<213>TCR beta J节段的特异性引物

<400>236

caggacagag tcctccct                                              18

<210>237

<211>19

<212>DNA

<213>TCR beta J节段的特异性引物

<400>237

agcccctttt tgcaagttc                                             19

<210>238

<211>22

<212>DNA

<213>TCR beta J节段的特异性引物

<400>238

aactccgacc ttatgataca ct                                         22

<210>239

<211>19

<212>DNA

<213>TCR beta J节段的特异性引物

<400>239

tgccttcaag ggacaatgg                                             19

<210>240

<211>18

<212>DNA

<213>TCR beta J节段的特异性引物

<400>240

gatcattgca gtcaaacc                                              18

<210>241

<211>15

<212>DNA

<213>TCR beta J节段的特异性引物

<400>241

ggctgggctg ctcac                                                 15

<210>242

<211>15

<212>DNA

<213>TCR beta J节段的特异性引物

<400>242

atcccgccct ctcgg                                                 15

<210>243

<211>17

<212>DNA

<213>TCR beta J节段的特异性引物

<400>243

cagttccggg gcttcag                                               17

<210>244

<211>16

<212>DNA

<213>TCR beta J节段的特异性引物

<400>244

gagcgcagtc tcgtcc                                                16

<210>245

<211>18

<212>DNA

<213>TCR beta J节段的特异性引物

<400>245

cgcaaaaacc agacccaa                                              18

<210>246

<211>16

<212>DNA

<213>TCR beta J节段的特异性引物

<400>246

ccgccttcca cctgaa                                                16

<210>247

<211>15

<212>DNA

<213>TCR beta J节段的特异性引物

<400>247

gggaccgagg ggctg                                                 15