一种支链淀粉酶型淀粉去分支酶基因启动子及其应用

摘要

本发明公开了一种支链淀粉酶型淀粉去分支酶基因启动子及其应用。该启动子具有下述核苷酸序列：序列表中SEQ ID №：1或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。本发明的支链淀粉酶型淀粉去分支酶基因启动子可启动报告基因gusA基因在种子中特异性表达，说明它能使目的基因在植物的种子中特异性表达，该启动子将在玉米种子改良和植物生物反应器中发挥重要作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种支链淀粉酶型淀粉去分支酶基因启动子及其应用。

背景技术

随着植物分子生物学的飞速发展、植物遗传分析和遗传工程技术的不断革新，转基因植物在基础研究和生产实践上都具有重要意义。尤其是转基因植物生物反应器的研究和开发使植物能以极低的成本大量生产外源蛋白，为人类提供了一个更加安全和廉价的生产体系，与微生物发酵、动物细胞和转基因动物等生产系统相比，它具有许多潜在的优势和极大的商业价值。

植物生物反应器是指以植物悬浮细胞、某一组织和器官或整株植物为工厂大量生产具有重要功能的蛋白。自1986至1990年间，人们建立了植物表达系统成功地表达了人类生长激素融合蛋白，干扰素和人血清白蛋白。之后，随着技术的发展，科学家对于植物生物反应器的研究渐趋深入，主要表现在三个方面：首先是应用的广泛性。从生产植物抗体到口服疫苗到重要的药用蛋白，其分子的复杂程度和修饰度都在提高。自十几年前转基因烟草成功地表达免疫球蛋白的重链和轻链基因并组装成功能抗体以来，植物已经能够生产完整的IgG和IgA分子，分泌型IgG和IgA分子，双特异性抗体，膜锚定抗体等不同类型抗体。目前已经实现的口服疫苗包括细菌疫苗、病毒疫苗、寄生虫疫苗等；第二是可用做反应器的植物种类的扩展。从最初的模式植物烟草，到现在的马铃薯、番茄，玉米，油菜，大豆，拟南芥，香蕉，番木瓜，豇豆，菠菜，苜蓿、芜青等。Elizabeth E Hood报道的用转基因玉米生产的重组抗生素蛋白的表达量占种子中抽提的总可溶蛋白的2％，在目前表达外源蛋白的所有转基因玉米中表达量最高；第三实现植物生物反应器的技术改良。如，提高蛋白表达水平，人们在叶绿体内合成复杂的需要翻译后加工的或亚基装配的真核蛋白质，如sIgA；整合到烟草叶绿体基因组中的外源基因拷贝数能够达到每个细胞10000个拷贝，相应的重组蛋白占全部可溶性蛋白的比例也提高到47％。

转基因植物生物反应器研究使农业这一概念大大拓宽，突破了传统农业范畴，但要使外源基因在植物中稳定的整合，并且能够在特定的器官或细胞中特异性表达，一个很重要的前提条件是要有合适的启动子。植物基因工程中常用的启动子按其作用方式及功能可分为三类：组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。组织特异性启动子，可以使基因的表达仅限于某些特定的器官或组织部位，并降低对植物的负面影响。

目前，在植物中发现的种子特异性启动子主要有：谷醇溶蛋白基因启动子、花生种子豆球蛋白legA基因启动子、水稻谷蛋白gluA和gluB基因启动子和玉米醇溶蛋白基因启动子等。

玉米淀粉的合成途径中有许多相关酶，其中玉米淀粉去分支酶有两种类型：一种是支链淀粉酶型去分支酶(the pullulanase-type DBEs)，一种是异淀粉酶型去分支酶(the isoamylase-type DBEs)。ZPU1是一种支链淀粉酶型淀粉去分支酶，在不同玉米组织中检测Zpu1基因转录的mRNA，发现在玉米授粉20天后种子胚乳中大量存在，而在胚和穗中只有微量的表达，但在叶和根中没有表达。说明调控Zpu1基因的调控序列可能是胚乳特异性或种子特异性的。而且该基因只在胚乳、幼胚和穗中表达，也即只在生殖组织中表达，表明该基因的调控序列可能存在与生殖相关的功能区域。

发明内容

本发明的目的是提供一种支链淀粉酶型淀粉去分支酶基因启动子。

本发明所提供的支链淀粉酶型淀粉去分支酶基因启动子，是玉米淀粉合成途径中的支链淀粉酶型淀粉去分支酶Zpu1基因的启动子，具有下述核苷酸序列：序列表中SEQ ID №：1或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为杂交后用含1×SSC、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。

具有序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列的启动子名称为zpu1P-4，由516个碱基组成。

含有本发明的支链淀粉酶型淀粉去分支酶基因启动子的载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增本发明启动子任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

实验证明，本发明的支链淀粉酶型淀粉去分支酶基因启动子可启动报告基因gusA基因在种子中特异性表达，说明它能使目的基因在植物的种子中特异性表达，该启动子将在玉米种子改良和植物生物反应器中发挥重要作用。

附图说明

图1为RT-PCR扩增得到的用于筛库的片段的电泳图谱

图2A为第一轮筛选玉米基因组文库的杂交显影的X光片扫描图

图2B为第二轮筛选玉米基因组文库的杂交显影的X光片扫描图

图2C为第三轮筛选玉米基因组文库的杂交显影的X光片扫描图

图2D为第四轮筛选玉米基因组文库的杂交显影的X光片扫描图

图2E为验证第三轮和第四轮筛选得到的单克隆杂交显影的X光片扫描图

图3A为lambda DNA的酶切电泳图谱

图3B为lambda DNA酶切后的杂交图谱

图4为用PCR扩增得到的Zpu1基因启动子序列zpu1P-4

图5为zpu1P-4片段构建到真核表达载体pBI121上的图谱示意图

具体实施方式

材料与方法

1、菌株与质粒

大肠杆菌(E.coli)DH5α、农杆菌LBA4404均购自博大公司、λ噬菌体的宿主菌LE392购自Clontech公司。

2、工具酶及生化试剂

各种限制性内切酶、pGEM^@T-Easy载体试剂盒购自Promega公司；普通Taq酶和Trizol RNA小量提取试剂盒购自天为时代公司，ExTaq酶购自Takara公司；dNTP混合物购自上海生工；T₄DNA连接酶购自Takara公司和BioLabs公司；萘乙酸(NAA)、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Km)、链霉素(Sm)和噻孢霉素(Cef)购自欣经科公司；同位素α-³²P dCTP购自北京亚辉生物公司；硝酸纤维素膜购自Amersham公司。4-甲基伞型酮(4-MU)、4-甲基伞型酮酰-β-葡萄糖醛酸酐酶(4-MUG)均购自上海生工。

3、培养基

LB液体培养基(1升)：10g NaCl，5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，pH7.0

LB固体培养基(1升)：1升液体LB培养基加15g琼脂

YEB液体培养基(1升)：1g酵母提取物，10g蛋白胨，0.5g MgSO₄·7H₂O，5g蔗糖，pH 7.5

YEB固体培养基(1升)：1升YEB液体培养基加15g琼脂

MS基本培养基(1升)：MS大量元素，MS微量元素，MS有机物，各组份的基本成分参照Murashige，T&Skoog，F.在1962发表的MS培养基成分(Murashige，T&Skoog，F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissueculture.Physiol.Plant.1962，15：473-497)

MS盐溶液：只含有MS大量元素和微量元素

MS固体培养基：1升MS基本培养基中加30g蔗糖，8g琼脂，pH5.6-5.8

烟草分化固体培养基：1升MS基本培养基中加30g蔗糖，8g琼脂，3mg 6-BA，0.2mgNAA，pH 5.6-5.8

烟草诱导生根培养基：1升MS基本培养基加30g蔗糖，8g琼脂，pH5.6-5.8

4.筛选基因组文库所需溶液

1)20×SSC

          175.3g    NaCl(3.0M)

          88.2g     柠檬酸三钠(0.3M)

          用NaOH调pH至7.0，定容至1升，室温保存备用。

2)20×SSPE

          175.3g    NaCl(3.0M)

          27.6g     磷酸二氢钠(0.2M)

          40ml      0.5M EDTA(终浓度0.02M)

          用NaOH调pH至7.4，定容至1升，室温保存备用。

3)50×Denhardt’s solution

          5.0g      聚蔗糖(Ficoll)

          5.0g      聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone)

          5.0g      BSA(组分V)

          加水定容至500ml，-20℃保存备用。

4)20％SDS

5)10×lambda稀释缓冲液

          58.3g   NaCl(0.1M)

          24.65g  MgSO₄·7H₂O(0.1M)

          350ml   1.0M Tris-HCl(pH7.5)(终浓度0.35M)

5.PCR引物

P277：5’CGCACAGGGGTTCTTGTTGGA 3’

P950：5’CAACCAACCAAGTTCGTGTGC 3’

P37F：5’AAGCTTGTGTGACATAGTTATCCACGAACC 3’

P38R：5’GGATCCTTGCGTCCGCGTTTGGATTC 3’

P45F：5’CAGGAAGTGATGGAGCATCAG 3’

P46R：5’TCGTGCACCATCAGCACGTTA 3’

以上引物均由上海生工合成。

实施例1、玉米支链淀粉酶型淀粉去分支酶Zpu1基因5`侧翼序列的克隆

一、探针的制备

根据GenBank中Zpu1基因的cDNA序列(Accession no.AF080567)设计一对引物(P277和P950)。用Trizol RNA提取试剂盒提取授粉后28天的玉米种子总RNA，提取步骤按试剂盒内提供的方法操作。以提取的玉米种子总RNA为模板，进行反转录。

取1μL Oligo(dT)₁₈加到10μL浓度为200ng/uL的总RNA溶液中，70℃，5分钟后置于冰上冷却5分钟，然后加入以下成分：

试剂                                    体积

5×反转录缓冲液                         5μL

dNTP混合物(每种10mM)                    2.5μL

RNasin核糖核酸酶抑制剂(浓度为50U/uL)    1μL

AMV反转录酶(30U/μL)                    3μL

DEPC处理水                              定容至25μL

参照Promega公司AMV Reverse Transcriptase使用说明书设定如下的反应条件：室温10min，42℃ 60min，70℃ 10min，冰浴2min。然后以合成的cDNA第一链为模板，以P277和P950为引物进行PCR扩增。

反应体系为：

试剂                                    体积

10×缓冲液                              5μL

dNTP混合物(每种10mM)                    1μL

引物P277(浓度为10μM)                   1μL

引物P950(浓度为10μM)                   1μL

Ex-Taq(5U/μL)                          1μL

反转录产物(浓度为10ng/uL)               5μL

灭菌水                               定容至50μL

反应条件：

94℃5min；

94℃1min，55℃30s，72℃1min(10个循环)；

94℃1min，59℃30s，72℃1min(30个循环)；

72℃10min；

4℃保存。

将得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，表明扩增得到一条600bp左右的片段，将此片段作为筛选玉米基因组文库的探针。图1中，M为1kb laddermarker；1为目的片段(箭头所示)。

二、筛选玉米基因组文库得到Zpu1基因5`侧翼序列

1、玉米基因组文库

玉米基因组文库购自Clontech公司，目录号为FL1032D。

2、文库滴度的测定

1)、挑取一个宿主菌(LE392)的单斑于10ml LB液体培养基(含10mM MgSO₄、0.2％麦芽糖)中，在200rpm、37℃条件下振荡过夜，使OD₆₀₀达2.0左右。

2)、文库噬菌体的稀释

a.从购买的玉米基因组文库中取2μLλ噬菌体原种加到1ml 1×lambda稀释缓冲液中(Dilution1＝1∶500)。

b.从Dilution1中取出20μL加到980μL 1×lambda稀释缓冲液中(Dilution2＝1∶25000)。

c.在六只试管加入100μL 1×lambda稀释缓冲液，200μL宿主菌，然后分别加入稀释噬菌体Dilution2：0μL、5μL、10μL、50μL、100μL和250μL。

3)、将上述六管在37℃水浴20分钟左右。

4)、然后加4ml溶解的0.7％LB顶层培养基(50℃左右)，充分混匀后铺到15％LB固体平板上，快速旋转培养皿使顶层培养基均匀分布于整个平板。

5)、室温静置10分钟，待顶层培养基凝固后，在37℃倒置培养6-7hr。

6)、统计每个平板上长出的噬菌斑，根据下面的公式计算文库的滴度(pfu/ml)。

将六个平板测得的滴度求平均值为：1.22×10⁸pfu/ml。文库的滴度大于10⁸pfu/ml，所以该文库可以用于筛选。

3、用DNA探针筛选文库

1)铺板宿主菌的准备；

接种λ噬菌体的宿主菌LE392单菌落于LB液体培养基(MgSO₄ 10mM，麦芽糖0.2％)，37℃，200rpm，振荡培养至OD₆₀₀为2.0，取出备用。

2)λ噬菌体侵染宿主菌及铺板

取15ml溶化的顶层培养基加到侵染后的噬菌体和宿主菌的混合物中，充分混匀，迅速均匀地铺在预先准备好的1.5％LB固体平板上。室温静置10分钟，待顶层培养基凝固后，在37℃倒置培养3-8hr。当噬菌体长到不同噬斑间边缘刚彼此接触时，取出平板放于4℃，以备后面的转膜。

3)噬菌斑原位吸附固定至硝酸纤维素膜

a.剪取适当大小(比培养皿略小)的硝酸纤维素膜。在每张膜上剪三个不对称的缺口，并用铅笔在膜上标号。

b.将与平板编号相同的膜轻轻放到平板培养基上，尽量不产生气泡。

c.用灭菌牙签插在预先在膜上剪好的三个不对称缺口处，作为膜回位标记。2分钟后用无菌镊子小心地揭起硝酸纤维素膜，吸附有噬菌体的一面朝上，放于干净滤纸上，室温晾干。

d.将晾干的膜分别在变性液(1.5M NaCl、0.5M NaOH)和中和液(1.5M NaCl、0.5M Tris-HCl PH8.0)中分别放5min。然后转到2×SSC(0.3M NaCl，0.03M柠檬酸三钠)中漂洗一下，把膜放到干净滤纸上，室温晾干。

e.80℃，烘膜2hr，用保鲜膜包好后放于4℃备用。

4)预杂交

按以下成分配制预杂交液：

  成分  终浓度  甲酰胺  SSPE  Denhardt’s solution  SDS  变性鲑鱼精DNA  50％  5×    5×    0.1％  100μg/ml

预杂液配制好后，将保存于4℃的膜取出放入预杂液中，42℃，40rpm，预杂交4hr以上。

5)标记探针

取4μL浓度为20ng/μL的DNA探针加入26μL水中，在沸水中变性5min，接着冰浴5min，然后依次加入以下成分：

          5×标记缓冲液                         10μL

          dATP、dGTP、dTTP(每种1.5mM)           2μL

          BSA(10mg/ml)                          2μL

          Klenow片段(5U/μL)                    1μL

          α-³²P-dCTP(10μCi/μL)              5μL。

加入上述成分后，在37℃标记4hr左右。其中，5×标记缓冲液的成分如下：

250mM Tris-HCL(pH8.0)、25mM MgCl₂、10mM DTT、1M HEPES(pH6.6)和26 A₂₆₀u/ml随机6碱基脱氧核苷酸。

6)杂交

将标记好的探针在沸水中变性10min，在冰上迅速冷却后加入预杂交液中。在42℃，40rpm条件下杂交16-20小时。

7)洗膜和压X光片以及阳性克隆的挑选

杂交结束后，加入洗膜buffer 1(2×SSC，0.5％SDS)，42℃，40rpm洗1hr。然后再分别用buffer 2(1×SSC，0.1％SDS)和buffer 3(0.2×SSC)，65℃，40rpm各洗1hr。洗膜结束后，用干净滤纸吸去膜上的大部分液体，然后用保鲜膜将膜包裹后压在X光片之下。根据X光片上影像在膜上标出阳性斑的位置。然后再将膜放入对应编号的培养平板上，缺口和平板上的牙签对齐。根据膜上的标号挑出含阳性斑的培养基放入1.5ml离心管中，加入1ml灭菌1×lambda稀释液，室温放置1-2hr，使噬菌体从培养基上扩散出来，然后12000rpm离心10分钟，收集上清液，用于下一轮筛选。经过5轮筛选和验证，共得到10个阳性单克隆(图2A-图2E)。

4、λ噬菌体DNA提取

1)将10个阳性单克隆分别铺板，每个阳性克隆铺两个200mm平板。当每个平板的表面几乎完全被噬菌斑覆盖时，取出平板并直接加入15ml的lambda稀释缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.4，100mM NaCl，10mM MgSO₄)，室温放置1-2hr，使噬菌体从上层培养基中扩散出来。

2)将lambda稀释缓冲液从培养皿中移入50ml离心管中，4℃，8000rpm离心20min，除去细菌碎片。

3)将上清移入一新的离心管中，加入RNaseA(终浓度为2μg/ml)，DNase(终浓度为1μg/ml)，37℃消化30min。

4)加PEG8000(终浓度为10％)，NaCl(终浓度为1M)于lambda稀释缓冲液中，充分混匀，冰浴1hr以上。

5)4℃，11000rpm，离心10min。弃上清，收集管壁上噬菌体颗粒。

6)加1ml 1×lambda稀释缓冲液重悬噬菌体，并将重悬后噬菌体分装到1.5ml离心管中(500μL/管)。向每管中加RNaseA至终浓度1ug/ml，DNaseI至终浓度5ug/ml，37℃消化20min。

7)加EDTA至终浓度20mM，终止酶反应；然后加入蛋白酶K至终浓度为100μg/ml，破坏噬菌体外壳蛋白，同时将RNase A和DNase消化掉，加SDS至终浓度0.5％，65℃水浴1小时。

8)等体积苯酚、氯仿抽提两次，氯仿抽提一次。

9)上清加入等体积的异丙醇，沉淀lambda DNA。

10)70％乙醇洗涤沉淀，抽干后溶于适量TE，取少量电泳检测，其余-20℃保存备用

5、Lambda噬菌体DNA酶切分析与亚克隆片段测序

取10个阳性克隆中1个的λ噬菌体DNA用多种酶进行单酶切和双酶切分析，它们的组合如下：1.HindIII+BamHI，2.HindIII+EcoRV，3.EcoRV，4.HindIII+SmaI，5.SmaI，6.HindIII+PstI，7.PstI，8.HindIII+PvuII，9.EcoRI，10.HindIII，11.HindIII+SalI，12.HindIII+EcoRI。

单酶切体系：

      10×缓冲液                5μL

      Lambda DNA                30μL

      限制性内切酶              6μL

      灭菌水               定容至50μL。

双酶切体系：

      10×缓冲液                5μL

      Lambda DNA                30μL

      限制性内切酶I             5μL

      限制性内切酶II            5μL

      灭菌水               定容至50μL。

将酶切产物电泳、转膜后用筛选文库的探针进行杂交，具体步骤如下：

1、电泳及转膜

1)将酶解完全的DNA每管加入5μl 10×loading buffer(70％甘油，0.5×TBE，0.2％SDS，20mM EDTA，0.2％溴酚蓝)，混匀。样品于1×TAE(40mM Tris-乙酸，1mMEDTA)电泳缓冲液，0.8％琼脂糖凝胶，在40cm电泳槽中100v电压下使得所有样品从点样孔进入凝胶，然后在30v恒压下，电泳16h。

2)将电泳后的凝胶切去多余胶边，并切一小角以表明方向，置于0.25M HCl中轻摇15min。

3)将一磁盘加入0.4M NaOH溶液，架上一块玻璃板，上放4层宽于凝胶的吸水纸，两头浸于液体中，滤纸间不能有气泡。

4)胶用蒸馏水冲洗后，点样孔向下置于滤纸之上，排尽其间气泡，胶块四周放好隔水条。

5)剪长宽比胶块大1mm的硝酸纤维素膜(Hybond-N+，Amersham)，置于0.4MNaOH中均匀浸透后铺于胶上，再铺上四张与膜相同大小的滤纸，其间均不能有气泡。

6)加数层纸巾，其上压一块玻璃板及750g重物，吸印20～24小时。

7)吸印完毕后，用铅笔做标记，2×SSC(0.3M NaCl，0.03M柠檬酸，pH7.0)浸泡10分钟。

8)将膜移至滤纸上，超净台吹干。

9)将膜夹于滤纸和两块玻璃之间，于80℃烘箱中烘1～2小时，用保鲜膜包裹，4℃保存备用。

2、杂交

转膜完毕之后的杂交方法与筛选玉米基因组文库时所用的杂交方法完全相同，杂交所用的探针也是筛选文库时所用的探针。杂交结果如图3B所示。

酶切结果如图3A所示，酶切结果表明所用的几种限制性内切酶对λ噬菌体DNA的酶切都比较完全，不同大小的条带基本都已分开。酶切片段的杂交结果如图3B所示，表明由HindIII、EcoRV、SmaI、HindIII+SalI、HindIII+PvuII和EcoRI酶切的产物中能杂出信号的片段都比较大，包含有较长的启动子区域，可以选择其中一个酶的酶切片段回收，进行亚克隆分析。(图3A和图3B中，M为1kb ladder marker；1.HindIII+BamHI，2.HindIII+EcoRV，3.EcoRV，4.HindIII+SmaI，5.SmaI，6.HindIII+PstI，7.PstI，8.HindIII+PvuII，9.EcoRI，10.HindIII，11.HindIII+SalI，12.HindIII+EcoRI)。

根据已知的cDNA序列可知在探针的下游距离zpu1基因的起始密码子约1kb的区域有一个HindIII切点，在探针之中有一个EcoRI的酶切位点，探针距离zpu1基因的起始密码子约300bp左右。由图3A和图3B的酶切杂交结果可知HindIII单酶切产物中有信号的片段比较大，虽然可能包含较长的启动子区域，但是不易连接到测序载体上。由HindIII和EcoRI双切及EcoRI单切的结果可知EcoRI单切的得到的片段约3～5kb左右，这样的长度易于连接且包含启动子的区域也比较长。虽然其他内切酶酶切的片段长度也有适宜的，但是与测序载体上的酶切位点不一致。因此决定回收由EcoRI酶切的片段。然后又用EcoRI酶切了λDNA几次，确定目标条带约在3.7kb左右，最后回收该片段将其连接到测序载体pGEM-3zf上，送上海联众公司测序。测序结果表明该3.7kb片段全长为3603bp，其中有2267bp是Zpu1基因ATG上游的5`侧翼序列，另外的1332bp序列为Zpu1基因组序列。将3603bp的序列提交GenBank中进行比对，其中1332bp序列中外显子序列与cDNA序列同源性为100％。说明所得到的2267bp序列确为Zpu1基因的5`侧翼序列。

实施例2、zpu1P-4启动子的克隆及其真核表达载体的构建及转化烟草

一、zpu1P-4启动子的克隆及其真核表达载体的构建

1、从Zpu1基因5`侧翼序列中扩增zpu1P-4启动子

根据测序得到的Zpu1基因的5`侧翼序列设计了2条引物P37F和P38R。以连接在测序载体上的3.7kb序列为模板，通过PCR扩增方法从Zpu1基因5`侧翼序列中扩增出一条500bp左右的片段。

扩增体系：

        10×buffer               5μL

        dNTP混合物(每种10mM)     1μL

        P37F(10μM)              1μL

        P38R(10μM)              1μL

        Taq酶(5U/μL)            0.5μL

        模板(浓度为10ng/μL)     0.5μL

        灭菌水                  定容至50μL

扩增条件为：

94℃10min

94℃1min，55℃30s，72℃1min(30个循环)

72℃10min

4℃保存。

结果如图4所示，将用引物P37F与P38R扩增得到的片段命名为zpu1P-4(序列1，516bp)。图4中，M为1kb ladder marker；1为zpu1P-4(箭头所示)。

将扩增出的zpu1P-4片段连接到pGEM^@T-Easy测序载体上，送上海联众公司测序。测序结果与所得的2267bpZpu1基因的5`侧翼序列比较，一致性为100％，表明扩增没有出现错配。

2、真核表达载体的构建

根据引物P37F和P38R两端设计的酶切位点，用HindIII和BamHI将zpu1P-4片段从pGEM^@T-Easy载体切下，把酶切后回收的zpu1P-4片段与经HindIII和BamHI酶切的pBI121载体片段相连。将连接产物转化DH5a菌株中，提取质粒DNA，用HindIII和BamHI酶切鉴定、利用引物P37F与P38R PCR鉴定zpu1P-4片段与pBI121载体的连接物。将构建好的载体命名为：pBI121-zpu1P-4(其示意图如图5所示)。

二、转化烟草

大量提取构建的表达载体(pBI121-zpu1P-4)的质粒DNA，取20μL(约1ug)转化农杆菌LBA4404感受态细胞，在28℃、YEB培养基(含卡那霉素Km 100ug/ml，链霉素Sm 125ug/ml)上培养两天。各挑选两个克隆做菌液PCR鉴定，均扩增出目标条带。

将含有表达载体的农杆菌接种于YEB培养基(含卡那霉素Km 100ug/ml，链霉素Sm 125ug/ml)，28℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，室温离心10分钟(4000rpm)。沉淀用MS盐溶液(pH7.0)悬浮，并稀释至原体积的20-50倍。取烟草无菌苗叶片，切去叶片边缘和主脉，将叶片切成约0.4×0.6cm²左右大小，放入制备好的菌液中浸泡5-10min，用无菌滤纸吸干表面菌液，转入表面铺有一层滤纸的MS固体培养基(含3mg/L 6-BA，0.2mg/L NAA，pH 5.8)中，28℃暗培养。三天后，转入MS筛选培养基(含3mg/L 6-BA，0.2mg/L NAA，含卡那霉素100ug/ml，噻孢霉素250ug/ml，pH5.8)中，28℃光照培养，每日光照12-16小时。每2周继代一次，每次将变黄的叶片和愈伤组织丢掉，大的愈伤组织切割成小块，经2-3次继代后，培养的愈伤组织陆续分化出幼苗。将幼苗转移入罐头瓶装的MS固体培养基(含卡那霉素Km 100ug/ml，链霉素Sm 125ug/ml，pH 5.8)中，28℃光照培养，待其根系发育完全后，移栽到温室中。

实施例3、烟草转基因后代的分子检测及zpu1P-4启动子活性的检测

一、烟草转基因后代的分子检测

1、烟草总DNA小量提取

取烟草幼嫩叶片150mg左右于1.5ml离心管中，研成粉末。加800μL 65℃预热的SDS裂解缓冲液(0.1M Tris-HCl，0.05M EDTA，0.5M NaCl，1％SDS)，振荡混匀。65℃水浴20分钟，加入250μL 5M KAc，冰浴5分钟，4℃、12000rpm离心10分钟。取上清于另一1.5ml离心管中，4℃、12000rpm再离心5分钟。将上清转入另一干净离心管，加入600μL异丙醇，充分混匀，4℃12000rpm离心15分钟。最后用70％乙醇清洗沉淀2次，真空干燥后，加80μL灭菌重蒸水溶解DNA。

2、PCR检测

根据gusA基因的序列设计一对引物P45F和P46R，用这对引物检测用SDS法提取的转基因烟草DNA。其中，PCR反应体系组成如下：

      10×缓冲液                          2.5μL

      dNTP混合物(每种10mM)                0.5μL

      P45F(浓度为10uM)                    0.5μL

      P46R(浓度为10uM)                    0.5μL

      Taq酶(浓度为5U/uL)                  0.5μL

      转基因烟草总DNA(浓度为20ng/uL)      1μL

      灭菌水                        定容至25μL。

PCR检测结果表明阳性烟草植株与待检测烟草植株的株数比为72％。

二、支链淀粉酶型淀粉去分支酶基因的启动子活性的检测

将PCR检测结果为阳性的烟草植株，提取其茎、叶和种子的总蛋白，定量检测gusA基因编码蛋白β-葡萄糖苷酸酶(β-Glucuronidase)的活性，具体步骤如下：

1、标准曲线的制作

用反应终止液(0.2mol/L Na₂CO3)将4-MU(4-甲基伞形酮)配制成0.00、6.25、12.50、50.00、100.00、250.00、500.00、1000.00pmol的系列标准浓度，通过测定它们的荧光强度，作出一条标准曲线。

2、总蛋白提取与蛋白浓度的测定

1)取0.1g材料于1.5ml离心管中，加入液氮，研成粉末。

2)加600μL酶提取液(0.05M PH7.0磷酸缓冲液，0.1％SDS，0.01M PH8.0EDTA，20％甲醇，0.1％Triton X-100，0.1％巯基乙醇)，在13000rpm 4℃离心10min，取上清于一新的离心管中，-20℃保存备用。

3)取上清，用考马斯亮蓝G250法测定蛋白的含量。

3、β-葡萄糖苷酸酶的酶促反应及其荧光定量

1)取50μL含GUS的上清，加入到450μL 37℃预热的检测液(2mmol/L 4-MUG溶液)中，迅速充分混匀。

2)立刻取出50μL加入到950μL反应终止液(0.2mol/L Na₂CO3)，将该管作为酶促反应的0点。

3)分别在10min、20min、30min、45min和60min从反应液中取出50μL，转入950μL的反应终止液中。

4)酶促反应结束后，用荧光分光光度计在激发波长365nm、发射波长455nm下，测定不同时间点的荧光值。

5)根据测定的荧光值以及参与反应的总蛋白，求出GUS活性，GUS活性＝单位时间内反应生成的MU/蛋白量(单位：pmol 4-MU.min^-1.mg^-1蛋白)。

β-葡萄糖苷酸酶(β-Glucuronidase)活性测定结果如表1，表2和表3所示，表明：(1)Zpu1基因起始密码子ATG上游516bp的序列(zpu1P-4)足以启动报告基因gusA表达。(2)gusA基因在种子中的表达量比在叶中的表达量高9倍，比茎中高20倍，充分说明zpu1P-4启动子是种子特异性启动子。

          表1、zpu1P-4启动子驱动gusA基因在烟草叶中表达

  载体                                   GUS activity(pmol 4-MU.mg^-1.min^-1)  10min  20min  30min  45min  60min           平均值  pBI121-zpu1P-4  1  4.098  3.917  5.514  5.068  4.999  4.719  11.302  2  7.710  9.993  8.015  11.537  11.471  9.745  3  23.154  31.206  33.344  33.600  29.438  30.148  4  0.330  0.514  0.397  1.358  0.379  0.596

                    表2、zpu1P-4启动子驱动gusA基因在烟草茎中表达

  载体                       GUS activity(pmol 4-MU.mg^-1.min^-1)  10min  20min  30min  45min  60min          平均值  pBI121-zpu1P-4  1  10.41  16.26  17.17  18.43  17.84  16.022  5.108  2  0.00  5.55  4.22  4.57  2.29  3.326  3  0.00  1.41  1.38  1.72  0.90  1.084  4  0.00  0.00  0.00  0.00  0.00  0.000

表3、zpu1P-4启动子驱动gusA基因在烟草种子中的表达

  载体                         GUS activity(nmol 4-MU.mg-1.min-1)  10min  20min  30min  45min  60min  mean  pBI121-zpu1P-4  1  7.22  12.41  10.36  10.08  14.45  10.902  100.955  2  250.20  273.01  237.49  282.12  293.05  267.173  3  45.53  55.52  62.86  62.54  68.55  59.000  4  65.86  70.32  64.34  65.66  67.54  66.744

                    序列表

<160>1

<210>1

<211>516

<212>DNA

<213>玉米属玉米(Zea mays L.)

<400>1

gtgtgacata gttatccacg aaccaaacag acctttaatg gtgttttgaa tagttttagt    60

ccataaacca aacatgatag ggactaaatt ttagtctcct aactaaatgt tagtcattga    120

actaaaggaa ccaaacggat accaatactc aatgtatgga aaagacgaga aatcaataac    180

tttatcaaat atgagaacca gccgtgaaga catggcagaa taaaaaaaac aaagcaaaag    240

agctggatat accttaacgg ggaagtcttg acgaaaacaa cattacgtgt atagaaatga    300

gaagataaag aaaagagata agatggccac ggtagctatt agccaaacaa gcactcttct    360

agttcttccg tttctcactt tctcttcctg agaatctccc ctttatatga ataatataaa    420

tgtcacataa gtaaataaac aaataaatca atcaatatta ctacgaagct gtcctcaccg    480

ccttctctct ccctccgaat ccaaacgcgg acgcaa                              516