一种利用蛋白质芯片研究蛋白质相互作用的方法

摘要

本发明提供了一种以具有共同结构特性的一类蛋白质的融合蛋白文库为基础的用于多种蛋白质相互作用分析研究的蛋白质芯片、该芯片的制备方法及其检测技术。该芯片是首先制备具有共同结构特性的一类蛋白质的融合蛋白文库，按照预先设计的顺序将取自该文库的融合蛋白点印到芯片的基片上，使融合蛋白通过物理吸附作用固定在芯片基片上。待检测的蛋白质或蛋白质片段也制成具有免疫学标签的融合蛋白，将待测蛋白质与蛋白质芯片进行杂交，检测杂交结果，即在一张芯片表面即可筛选检测出文库中能与待测蛋白相互作用的蛋白质或蛋白质片段。该芯片在检测时使用抗免疫学标签的单一抗体，运用通用的试剂，即可对多种能够发生相互作用的蛋白质进行研究，达到高通量、简便快速的要求。

说明书

技术领域

本发明属于生命科学领域，特别涉及一种利用蛋白质芯片研究蛋白质相互作用的方法。

背景技术

蛋白质芯片是一种在固态基底上有序排布的蛋白质或多肽阵列，可对蛋白质样品进行检测、识别和鉴定，应用于生物学、医学及其相关领域。

蛋白质与蛋白质的相互作用是生物调控的基本单元，对于理解生物调控机制具有重要意义，是后基因组时代生命科学与其它学科交叉研究的热点。蛋白质-蛋白质相互作用和识别在诸如生物催化、转运、信号传导、免疫、细胞调控等多种生命过程中起着重要的作用。研究蛋白质相互作用的方法很多，目前较普遍的生物化学与分子生物学方法包括：免疫共沉淀(co-immnol precipitation，co-IP Moon and Lazarides 1983)、GST-pull down、Far Western分析、噬菌体展示和酵母双杂交(Fields and Song 1989)等。这些技术的发展为蛋白质相互作用的研究提供了非常有效的手段。

但是，免疫共沉淀、GST-pull down和Far Western分析都是针对某一种蛋白质相互作用的分析和鉴定，远远无法满足当今蛋白质组学研究中高通量的要求；同时，免疫共沉淀和GST-pull down还需要针对目的蛋白质特异性的抗体，因此在实践上有许多限制；噬菌体展示和酵母双杂交技术虽然可以对蛋白相互作用组进行大规模的筛选，但噬菌体展示技术更适合筛选较短的肽段，而较大蛋白质分子由于很难得到噬菌体展示库，因此对于筛选与其相互作用的蛋白质有很大的局限性；酵母双杂交是检验在细胞内蛋白质与蛋白质的相互作用的一种方法，它的局限性在于所研究的蛋白质必须能够进入细胞核同时该蛋白质不是细胞核转录调控因子。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的利用蛋白质芯片研究蛋白质相互作用的方法，使待测蛋白质与多种蛋白质的相互作用仅用一张芯片即可筛选鉴定，实现高通量、简便快速的要求。

本发明的技术方案如下：

一种利用蛋白质芯片研究蛋白质相互作用的方法，首先制备具有共同结构特性的一类蛋白质的融合蛋白文库，所述融合蛋白为带有免疫学标签的融合蛋白。按照预先设计的顺序将取自该文库的融合蛋白点印到芯片的基片上，使融合蛋白通过物理吸附作用与基片相连接，从而将融合蛋白固定在芯片基片上。待检测的蛋白质或蛋白质片段也制成具有免疫学标签的融合蛋白，将待测蛋白质与蛋白质芯片进行杂交，检测杂交结果，将显示蛋白质的相互作用情况，即在一张芯片表面即可筛选检测出文库中能与待测蛋白相互作用的蛋白质或蛋白质片段。

一种利用蛋白质芯片研究蛋白质相互作用的方法，其所涉及的蛋白质芯片的制备方法，采取下列步骤：

(1)将一类具有共同结构特性的蛋白质或蛋白质的片段分别制备成带有免疫学标签的融和蛋白，组成融合蛋白质文库；

(2)将所制备的各种融合蛋白按照预先设计的顺序点印到芯片的基片上，使融合蛋白与基片相连接；

(3)室温放置24小时，待其自然干燥，密封包装后存放于4℃待用。

一种利用蛋白质芯片研究蛋白质相互作用的方法，其所涉及的检测方法为使用抗免疫学标签的单一抗体可同时对多种能够发生相互作用的蛋白进行研究，其步骤为：

(1)在大肠杆菌中表达并纯化待测蛋白质或蛋白质片段与免疫学标签的融合蛋白；

(2)将蛋白质芯片放入封闭液中，封闭芯片基片上剩余的活性基团；

(3)将待测蛋白质或蛋白质片段的融合蛋白加入封闭液中，使其终浓度为1nM-1uM，在温度为4-25℃，相对湿度为70-85％的条件下轻摇孵育至反应平衡；

(4)洗涤芯片；

(5)加入作为第一信号物质的可与芯片捕获蛋白的免疫学标签配对的检测抗体，使两个可相互作用的蛋白质与抗体形成复合物；

(6)洗涤芯片；

(7)加入与酶连接的第二信号物质，使其与前述复合物实现连接形成复合物；

(8)洗涤芯片；

(9)干燥后进行检测。

本发明是在固态基片上有序排布融合蛋白质或融合蛋白质片段阵列，可对蛋白质样品问的相互作用进行检测、筛选和鉴定。现有的研究蛋白质相互作用的方法有的只是针对某一种蛋白质相互作用的分析和鉴定；有的需要针对目的蛋白质特异性的抗体；有的只适合筛选较短的肽段；有的对被研究蛋白质的定位及性质有所限定。总之均不能满足蛋白质组学研究中简便、快速、高通量的要求。而采用本发明的研究方法，则可以把大量的具有共同结构特性的一类蛋白质或蛋白结构域片段同时点阵于一张芯片上，经过简单的检测操作即可筛选鉴定出有相互作用的一对蛋白质，大大提高了筛选鉴定的速度和效率，适用于多种蛋白质相互作用的研究。

本发明的制备工艺简单，操作安全快捷，尤其是每次检测过程仅使用针对于免疫学标签的一种抗体即可完成操作，大大降低了研究成本，经济实用性强。

附图说明

图1是芯片上PDZ蛋白结构域的排布情况

图2是利用蛋白质芯片研究筛选与betal-肾上腺素受体相互作用的PDZ蛋白结构域的结果图

图3是芯片上PDZ蛋白结构域的排布情况

图4是利用蛋白质芯片研究筛选与P2Y1R相互作用的PDZ蛋白结构域的结果图

图5是芯片上WW蛋白结构域的排布情况

图6是利用蛋白质芯片研究筛选与Sam68相互作用的WW蛋白结构域的结果图

具体实施方式

实施例1

利用蛋白质芯片研究筛选与betal-肾上腺素受体相互作用的PDZ蛋白结构域

(1)制备PDZ结构域的融合蛋白质文库。将若干PDZ结构域分别构建到His融合蛋白表达载体pET30a上，分别表达并纯化His-PDZ融合蛋白；

(2)在作为芯片基片的硝酸纤维素膜上按照96孔板的的排列方式画上96个方格，将所制备的各种融合蛋白(0.1M-1mM)按照预先设计的顺序点印到膜上的各方格内，使融合蛋白与硝酸纤维素膜相连接；

(3)室温放置24小时，待其自然干燥，密封包装后存放于4℃待用。

(4)将betal-肾上腺素受体的羧基末端约30个氨基酸所对应的核酸序列片段装入蛋白质表达载体pGEX-4T-1内，在大肠杆菌BL21中表达并纯化GST融合蛋白GST-β1-AR-ct；

(5)将蛋白质芯片放入封闭液中于室温轻摇30分钟，封闭芯片基片上剩余的活性基团；封闭液包含：2％脱脂奶粉，100mM NaCl，10mM Tris pH7.4，0.1％Tween 20；

(6)将融合蛋白GST-β1-AR-ct加入封闭液中，使其终浓度为100nM，于4℃轻摇过夜孵育；

(7)封闭液洗涤芯片3次，每次5分钟；

(8)加入与酶连接的可与芯片捕获蛋白的免疫学标签GST配对的检测抗体，即辣根过氧化物酶标记的抗GST抗体，室温孵育1h；

(9)封闭液洗涤芯片3次，每次5分钟；

(10)ECL化学发光试剂盒处理蛋白质芯片3分钟；

(11)干燥后进行X-光片成像检测。

芯片上各PDZ蛋白结构域的排布情况如图1所示。

结果如图2所示：格子A5、A6、A10、B8、B10、C3、E10和G2内的点代表阳性结果，其所对应的PDZ结构域融合蛋白即为与β1-AR-ct有相互作用的PDZ蛋白结构域。斑点的大小和深浅可反映相互作用的强弱。

实施例2

利用蛋白质芯片研究筛选与P2Y1R相互作用的PDZ蛋白结构域

(1)制备PDZ结构域的融合蛋白质文库。将众多PDZ结构域分别构建到His融合蛋白表达载体pET30a上，分别表达并纯化His-PDZ融合蛋白；

(2)在作为芯片基片的硝酸纤维素膜上按照96孔板的的排列方式画上96个方格，将所制备的各种融合蛋白(0.1M-1mM)按照预先设计的顺序点印到膜上的各方格内，使融合蛋白与硝酸纤维素膜相连接；

(3)室温放置24小时，待其自然干燥，密封包装后存放于4℃待用。

(4)将P2Y1R的羧基末端所对应的核酸序列片段装入蛋白质表达载体pGEX-4T-1内，在大肠杆菌BL21中表达并纯化GST融合蛋白GST-P2Y1R-CT；

(5)将蛋白质芯片放入封闭液中于室温轻摇30分钟，封闭芯片基片上剩余的活性基团；封闭液包含：2％脱脂奶粉，100mMNaCl，10mM Tris pH7.4，0.1％Tween 20；

(6)将融合蛋白GST-P2Y1R-CT加入封闭液中，使其终浓度为100nM，于4℃轻摇过夜孵育；

(7)封闭液洗涤芯片3次，每次5分钟；

(8)加入与酶连接的可与芯片捕获蛋白的免疫学标签GST配对的检测抗体，即辣根过氧化物酶标记的抗GST抗体，室温孵育1h；

(9)封闭液洗涤芯片3次，每次5分钟；

(10)ECL化学发光试剂盒处理蛋白质芯片3分钟；

(11)干燥后进行X-光片成像检测。

芯片上蛋白的排布情况如图3所示。

结果如图4所示：格子B5、B11内的点代表阳性结果，其所对应的PDZ结构域融合蛋白即为与P2Y1R-CT有相互作用的PDZ蛋白结构域。斑点的大小和深浅可反映相互作用的强弱。

实施例3

利用蛋白质芯片研究筛选与Sam68相互作用的WW蛋白结构域

(1)制备WW结构域的融合蛋白质文库。将众多WW结构域分别构建到His融合蛋白表达载体pET30a上，分别表达并纯化His-WW融合蛋白；

(2)在作为芯片基片的硝酸纤维素膜上按照96孔板的排列方式画上96个方格，将所制备的各种融合蛋白(0.1M-1mM)按照预先设计的顺序点印到膜上的各方格内，使融合蛋白与硝酸纤维素膜相连接；

(3)室温放置24小时，待其自然干燥，密封包装后存放于4℃待用。

(4)将编码Sam68的核酸序列装入蛋白质表达载体pGEX-4T-1内，在大肠杆菌Top10中表达并纯化GST融合蛋白GST-Sam68；

(5)将蛋白质芯片放入封闭液中于室温轻摇30分钟，封闭芯片基片上剩余的活性基团；封闭液包含：2％脱脂奶粉，100mM NaCl，10mM Tris pH7.4，0.1％Tween 20；

(6)将融合蛋白GST-Sam68加入封闭液中，使其终浓度为100nM，于4℃轻摇过夜孵育；

(7)封闭液洗涤芯片3次，每次5分钟；

(8)加入与酶连接的可与芯片捕获蛋白的免疫学标签GST配对的检测抗体，即辣根过氧化物酶标记的抗GST抗体，室温孵育1h；

(9)封闭液洗涤芯片3次，每次5分钟；

(10)ECL化学发光试剂盒处理蛋白质芯片3分钟；

(11)干燥后进行X-光片成像检测。

芯片上蛋白的排布情况如图5所示。

结果如图6所示：格子A12和C11内的点代表阳性结果，其所对应的WW结构域融合蛋白即为与Sam68有相互作用的WW蛋白结构域。斑点的大小和深浅可反映相互作用的强弱。