重组人成骨蛋白－1的复性及其制剂制备方法

摘要

本发明公开了一种重组人成骨蛋白－1的复性及其制剂制备方法，是通过层析获得95％以上纯度的rhOP－1单体蛋白，在2M－6M尿素或1M－4M盐酸胍缓冲液中透析进行复性，复性缓冲液的pH值是8.0－10，复性温度室温或者4度，复性时间24－96小时；之后再经过进一步层析纯化使目的蛋白二聚体的纯度达到90％以上，以常规方式经透析、除菌、分装和冷冻干燥后得到rhOP－1成熟肽的基因工程产物的冻干粉或将层析纯化的目的蛋白液体直接与胶原蛋白、吸收性明胶海绵、壳聚糖或珊瑚粉类材料或合成高分子骨组织工程材料复合，灭菌，制得重组人成骨蛋白－1的复性制剂。所述制剂可用于骨缺损的修复、矫形及用于口腔拔牙创齿槽骨的维持和恢复等，也可以用于中风、肾脏疾病等的治疗。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种成骨蛋白-1的复性及其制剂制备方法，尤其涉及一种重组人成骨蛋白-1(rhOP-1)的复性及其制剂制备方法。是利用基因工程手段，利用大肠杆菌表达及大量生产重组人成骨蛋白-1成熟肽的方法，对重组人成骨蛋白-1进行复性及其制剂制备。本发明制备的制剂灭菌后临床上可用于骨缺损的修复、矫形及用于口腔拔牙创齿槽骨的维持和恢复等。属生物技术制药领域。

背景技术：

随着基因工程技术的迅猛发展，人们越来越多地通过蛋白质的异源表达为临床和工业生产提供一些蛋白质多肽产品。迄今为止，E.coli以其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高等优点，依然是生产重组蛋白的首选表达系统。但是在E.coli中表达的蛋白常常以包涵体的形式沉积于细胞内，表现为无活性的不溶性聚集物，如何高效地复性蛋白是基因工程蛋白生产过程中最关键和最困难的一步，已成为产业化的瓶颈之一

成骨蛋白-1(Osteogenic protein-1，OP-1)，又名骨形成蛋白-7(Bonemorphogenetic protein-7，BMP-7)，是TGF-β超家族中的一员。OP-1是一种多用途的蛋白：治疗骨及软骨的缺损及在矫形和整形外科的应用；在骨折方面的治疗作用已被大量的临床试验所证明是非常有效的，它能治愈现有的所有技术无法治愈的骨不连和骨缺损；在治疗牙周病方面：rhOP-1还能促进牙周重建、牙槽嵴骨密度增高，促进牙本质的形成和牙骨质的形成，这对义牙的种植具有重大的应用前景(Giannobile WV et al.，J Periodontol.，1998，69：129；)。研究还发现，OP-1在骨质疏松症、肾衰和神经组织的再生等疑难疾病的治疗中也有广阔的应用前景。

研究表明，天然提取的BMP具有诱骨及修复软骨的活性，但有成本高、获得量低(1μg/kg)、活性难以保持等缺点；利用基因工程技术制备的重组人骨形态发生蛋白克服了天然来源的BMP提取和纯化的局限性，其临床应用价值越来越受到关注。目前用于基因工程药物生产的表达系统主要有真核表达系统和原核表达系统，前者虽有活性高的优点，但其表达载体构建复杂、细胞转染率低、细胞克隆挑选繁琐、蛋白表达量极低且纯化较困难。上述不足限制了临床上的推广应用。原核表达系统具有操作简便、基因稳定、可大量生产的优点。OP-1成熟肽有三个糖基化位点，BMP-3有两个糖基化位点，有作者报道成功用大肠杆菌表达BMP-2、BMP-3成熟肽，经复性后具有良好的诱骨活性。

利用基因工程技术在原核表达生物体系可以获得大量的目的蛋白，但是，原核表达OP-1的复性却一直是一个具有挑战性的难题。原核基因工程产品有生产成本低，表达量高，包涵体蛋白易于纯化等优点。但包涵体的复性工作却是一个难点和关键环节，如果这一问题得不到很好解决，所复性的蛋白质活性不好、复性率不高，那么原核基因工程产品就谈不上经济有效，即使表达量再高也毫无意义。

克隆到OP-1的成熟蛋白基因并在宿主菌建立rhOP-1高效表达体系为目前的常规技术，在国内外BMP-2、BMP-3已经在大肠杆菌系统表达成功。OP-1是一种比较特别的蛋白质，曾在真核细胞CHO中成功表达复性，但产量低，成本高。利用大肠杆菌系统表达人OP-1的产品，虽然有大量的评价文章，但是均因为其令人生畏的复性(David CRueger，Biochenistry of bone morphogeneti proteins，in Bone MorphogeneticProteins From Laboratory To Clinical Practice/Slobodan Vukicevic，KuberT.Sampath ed Basel.Bosdton.Berlin：Birkhauser.2002，1-18)而使其使用受到限制。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种rhOP-1的复性及其制剂制备方法。此方法可以在可以获得具有临床应用价值的rhOP-1。复性后的rhOP-1经过纯化后直接与载体复合，能够制备成的可用于骨缺损的修复、矫形及用于口腔拔牙创齿槽骨的维持和恢复等制剂应用于临床。

本发明利用基因工程常规技术设计引物，从人胚胎组织中获得了目的基因；利用基因工程技术构建表达质粒，通过宿主菌转化实验筛选、建立了rhOP-1高效表达体系，构建了含有目的蛋白OP-1成熟肽基因(即人OP-1成熟肽基因序列，其核苷酸序列为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，公开的SEQ ID NO.1：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db＝nucleotide&val＝4502426公开序列：mat_peptide    999---1415/gene＝″BMP7″；所述核苷酸序列SEQ ID NO.1表达的蛋白质序列为SEQ ID NO.2(139氨基酸，其序列为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？val＝4502427&itemID＝7&view＝gpwithparts公开序列)表达系统；宿主菌为常规技术使用的BL21系列、DH5α大肠杆菌(①李邦印；庄玉辉：人成骨蛋白-1成熟肽基因在大肠杆菌中的克隆与表达生物技术通讯1999.03.30；10(1)：17-19；②陈文；史俊南；付士红；孙叶芳；梁国栋；侯云德：人成骨蛋白-1成熟肽基因5’端的修饰及其在大肠杆菌中的表达牙体牙髓牙周病学杂志1998.03.30；8(1)：3-6，)。

本发明利用热诱导表达，获得了目的蛋白质的高表达，目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的30％左右。rhOP-1在大肠杆菌中以包涵体的形式存在，经过裂菌、洗涤、离心获得包涵体，8摩尔l/L尿素或6摩尔/升的盐酸胍溶解包涵体，离心收集上清后首先对变性蛋白溶液纯化。rhOP-1的复性是在通过柱层析获得高纯度的rhOP-1单体蛋白后(95％以上)再进行复性，并且rhOP-1的复性可在6M尿素或者4M盐酸胍缓冲液中进行，复性温度室温或者4度，并且rhOP-1复性缓冲液的pH值是在8.0～10之间。本方法的优点是：复性蛋白质浓度可以是较高蛋白质浓度，100～1000ug/ml。此可以大大提高复性效率，方便后续纯化。

rhOP-1的复性也可在2M尿素或者1M盐酸胍缓冲液中进行，但是此时rhOP-1的复性缓冲液必须添加L-精氨酸，并且要将rhOP-1的浓度稀释至10～100μg/ml，其pH值是在8.0～10之间，否则复性效果不佳，甚至出现蛋白质聚集沉淀。

本发明涉及的rhOP-1的复性及其制剂制备方法，其特征在于通过层析获得95％以上纯度的rhOP-1单体蛋白，在2M～6M尿素或/和1M～4M盐酸胍缓冲液中透析进行复性，复性温度室温或者4度，复性缓冲液的pH值是8.0～10，并间隔6～12小时取样，用非还原性的SDS-PAGE检测二聚体形成的情况，复性时间24～96小时；之后再经过进一步层析纯化使目的蛋白二聚体的纯度达到90％以上，以常规方式经透析、除菌、分装和冷冻干燥后得到rhOP-1成熟肽的基因工程产物的冻干份或以常规方式将目的蛋白与胶原蛋白、吸收性明胶海绵、壳聚糖或珊瑚粉类材料或合成高分子骨组织工程材料复合，灭菌，制得rhOP-1的应用制剂。

上述层析是离子交换层析或/和疏水层析、反相层析、亲和层析、分子排阻层析。

上述复性步骤中，可加入表面活性剂，氧化还原体系，复性添加剂。

在上述的方法中，所述表面活性剂是Triton100、Triton114、吐温20、吐温80、十二烷基肌氨酸钠、十六烷基溴化铵、NP40之一，其用量浓度是体积百分比0.05％～1％。

在上述的方法中，所述氧化还原体系是0.1微摩尔/升～0.1毫摩尔/升的铜离子或/和比例为摩尔比从10∶1到1∶2的还原剂/氧化剂体系，其中还原剂的浓度范围是0.05～10毫摩尔/升。

其中，所述还原剂是：还原型谷胱甘肽、半胱氨酸及其盐酸盐、巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤癣糖醇之一。

其中，所述氧化剂是：氧化型谷胱甘肽、氧化型的二硫苏糖醇和二硫赤癣糖醇、胱氨酸及其盐酸盐之一。

在上述的方法中，所述复性添加剂是0.05～10克/升的聚乙二醇4000或聚乙二酵6000或聚乙二醇8000或聚乙二醇10000；0.02～1.0摩尔/升的精氨酸或其盐酸盐或其它碱性氨基酸或其盐酸盐或三(羟甲基)氨基甲烷，体积百分比为1％～30％的甘油。

其中，所述复性添加剂优选的是0.05～10克/升的聚乙二醇4000或聚乙二酵6000，0.4～1.0摩尔/升的精氨酸，或三(羟甲基)氨基甲烷，及体积百分比为1％～20％的甘油。

在上述的方法中，所述复性采用在低浓度变性剂2M尿素或/和1M盐酸胍缓冲液中透析进行复性时，0.2～1.0摩尔/升的精氨酸是必须的。

在上述的方法中，所述制的rhOP-1的复性制剂是临床上用于骨缺损的修复、矫形及用于口腔拔牙创齿槽骨的维持和恢复的rhOP-1的复性制剂。

下面就上述内容展开来进一步说明：

本发明在工程菌经过常规发酵、裂菌、洗涤后获得以包涵体形式表达的目标产物，包涵体经过7～8摩尔/升的尿素或5～6摩尔/升的盐酸胍变性溶解；再离子交换层析(或/和疏水层析、反相层析)纯化达到95％以上的纯度后，在含有相对低浓度变性剂4～6摩尔/升的尿素或/和2～4摩尔/升盐酸胍，或加入低浓度(体积百分比0.05-1％)的表面活性剂(如Triton100、Triton114、吐温20、吐温80、十二烷基肌氨酸钠、十六烷基溴化铵、NP40之一)、合适的氧化还原体系(如0.1微摩尔/升～0.1毫摩尔/升的铜离子或/和还原剂/氧化剂比例为摩尔比从10∶1到1∶2，其中还原剂的浓度范围在0.05～10毫摩尔/升，所使用的还原剂可以是：还原型谷胱甘肽、半胱氨酸及其盐酸盐、巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤癣糖醇之一，所使用的氧化剂可以是：氧化型谷胱甘肽、氧化型的二硫苏糖醇和二硫赤癣糖醇、胱氨酸及其盐酸盐之一)；以及其它复性添加剂(如：0.05-10克/升的聚乙二醇4000或聚乙二酵6000或聚乙二醇8000或聚乙二醇10000，0.02～1.0摩尔/升的精氨酸及其盐酸盐或其它碱性氨基酸及其盐酸盐或三(羟甲基)氨基甲烷，1～30％的甘油及一定量的肝素)的偏碱性(pH8.0～10.0)复性液中，复性温度室温或者4度，复性24～96小时(间隔6～12小时用非还原性的SDS-PAGE检测二聚体形成的情况)，再经过进一步层析纯化(离子交换、反相、疏水、非特异亲和及分子排阻)使目的蛋白的纯度达到90％以上，然后①经透析、除菌、分装和冷冻干燥后得到rhOP-1成熟肽的基因工程产物的冻干份。②目的蛋白与胶原蛋白、吸收性明胶海绵、壳聚糖或珊瑚粉类材料、其他人工工程材料复合，可用于骨缺损的修复、矫形及用于口腔拔牙创齿槽骨的维持和恢复等。

或者将经过离子交换层析(或/和疏水层析、反相层析)纯化达到95％以上纯度的rhOP-1单体，将其用2摩尔/升的尿素或1摩尔/升盐酸胍稀释至10～100μg/ml，并在其中添加0.2～1.0摩尔/升的精氨酸，优选0.3～0.8摩尔/升精氨酸，且其pH值应是在8.0～10之间，复性24～60小时(见图3)，再经过进一步层析纯化(离子交换、反相、疏水、非特异亲和及分子排阻)使目的蛋白二聚体的纯度达到90％以上，然后①经透析、除菌、分装和冷冻干燥后得到rhOP-1成熟肽的基因工程产物的冻干份。②目的蛋白与胶原蛋白、吸收性明胶海绵、壳聚糖或珊瑚粉类材料、脱钙骨基质及其他人工组织工程材料复合，可用于骨缺损的修复、矫形及用于口腔拔牙创齿槽骨的维持和恢复等。

本发明提供了一种rhOP-1的复性方法，此方法可以在可以获得具有临床应用价值的rhOP-1。复性后的rhOP-1经过纯化后直接与载体复合，本发明制备的制品灭菌后在临床上可用于骨缺损的修复、矫形及用于口腔拔牙创齿槽骨的维持和恢复等，也可以制备成为其他制剂用于中风、肾脏疾病等的治疗。

本实验的纯化、复性工艺简便易行，获得了实验室水平的rhOP-1分离纯化、复性工艺方案，为rhOP-1的大规模生产、结构和功能的进一步研究及rhOP-1早日应用于临床奠定了基础。

附图说明

图1：为rhOP-1复性前的SDS-PAGE图。

复性前样品，均为单体，其中：2泳道为标准蛋白质Marker(分子量标准从上到下依次为97.4，66，43，31，20.1和14.4Kd)。

图2：为rhOP-1不同复性条件下的复性效果的还原性SDS-PAGE图。

其中：1-7泳道为相同样品的不同条件复性，3泳道为本发明最优方法，复性率约有40％。10泳道为标准蛋白质Marker，分子量标准从上到下依次为97.4，66，43，31，20.1和14.4Kd。

图3：低浓度变性剂不同条件下的复性结果。

其中：1-6泳道为pH＜8时的复性结果；7泳道.pH8.0复性  8泳道.pH8.0复性(含L-Arg)  9泳道.pH9.0复性  10泳道.pH9.0复性(含L-Arg)。

具体实施方式：

实施例1：

rhOP-1工程菌经过发酵，离心收集菌体、裂菌、洗涤获得包涵体，包涵体经过8摩尔/升的尿素变性溶解，再离子交换(或/和疏水、亲和及分子排阻)层析收集纯化达到95％以上的纯度后，将其稀释至200～600μg/ml。后装入经过常规处理的透析袋(截留分子量为10000)中，在6摩尔/升的尿素、0.05克/升的聚乙二醇4000、0.4～0.6摩尔/升的精氨酸、20毫摩尔/升磷酸盐缓冲液的复性液中(pH8.0～9.5)室温空气氧化复性24～96小时，再经过进一步离子交换层析、分子排阻纯化使目的蛋白的二聚体纯度达到90％以上。再5摩尔/升的尿素、4摩尔/升的尿素、2摩尔/升的尿素、1摩尔/升的尿素透析至20毫摩尔/升磷酸盐缓冲液，冷冻干燥获得rhOP-1冻干粉。环氧乙烷灭菌后-20℃保存备用。

或者(一)：将二聚体纯度达到90％以上的目的蛋白(6摩尔/升的尿素)以1mg：5～20mg的比例，直接与一定量的吸收性明胶海绵材料复合。复合时在真空系统中反复抽、放气，至几乎完全驱除明胶海绵材料内的气泡，复合完成。再经5摩尔/升的尿素、4摩尔/升的尿素、2摩尔/升的尿素、1摩尔/升的尿素透析至20毫摩尔/升磷酸盐缓冲液。冷冻干燥后分装于聚乙烯袋或者其他合适的容器中，环氧乙烷灭菌，即得可用于骨缺损的修复、矫形及用于口腔拔牙创齿槽骨的维持和恢复等的制剂。

(二)、将上述冷冻干燥后的rhOP-1冻干粉，6摩尔/升的尿素溶解，以1mg：1～20mg的比例，与用打孔器制备成为直径5mm左右的市售吸收性明胶海绵材料复合。反复抽、放气，至几乎完全驱除明胶海绵材料气泡，复合完成。再逐级尿素透析至20毫摩尔/升磷酸盐缓冲液。冷冻干燥后分装于适宜容器中，环氧乙烷灭菌50分钟后的制剂可用于口腔拔牙创齿槽骨的维持和恢复等。

实施例2：

rhOP-1工程菌经过发酵，离心收集菌体、裂菌、洗涤获得包涵体，包涵体经过6摩尔/升的盐酸胍变性溶解；再离子交换(或/和疏水、亲和及分子排阻)层析收集纯化达到95％以上的纯度后，在4摩尔/升的盐酸胍、以及0.2～0.5摩尔/升的精氨酸、0.1微摩尔/升～0.1毫摩尔/升的铜离子(氯化铜或硫酸铜)；20毫摩尔/升磷酸盐的复性液(pH8.0～9.0)中室温复性24～96小时，再经过进一步离子交换层析纯化(或/和反相、疏水、非特异亲和及分子排阻)使目的蛋白的纯度达到90％以上。获得的样品直接与载体材料(胶原蛋白、吸收性明胶海绵、壳聚糖或珊瑚粉类、合成高分子骨组织工程材料之一)复合，复合时反复真空抽、放气，然后再透析至20毫摩尔/升磷酸盐缓冲液，置于冷冻干燥机中冻干，环氧乙烷灭菌后-20℃保存备用。

实施例3：

将包涵体经过8摩尔/升的尿素变性溶解，再离子交换层析收集纯化达到95％以上的纯度后，将其稀释至100～600μg/ml。后装入经过常规处理的透析袋(截留分子量为10000)中，直接在6摩尔/升的尿素、20毫摩尔/升磷酸盐缓冲液的复性液中(pH9.0～9.5)室温空气氧化复性24～96小时，再经过进一步离子交换层析、分子排阻纯化使目的蛋白的二聚体纯度达到90％以上。再5摩尔/升的尿素、4摩尔/升的尿素、2摩尔/升的尿素、1摩尔/升的尿素透析至20毫摩尔/升磷酸盐缓冲液，冷冻干燥获得rhOP-1冻干粉。环氧乙烷灭菌后-20℃保存备用。或者将二聚体纯度达到90％以上的目的蛋白以1mg：5～10mg的比例，直接与一定量的吸收性明胶海绵材料复合。复合时在真空系统中反复抽、放气，至几乎完全驱除明胶海绵材料内的气泡，复合完成。再经梯度尿素透析至蒸馏水。冷冻干燥后分装于聚乙烯袋或者其他合适的容器中，环氧乙烷灭菌，即得可用于骨缺损的修复、矫形及用于口腔拔牙创齿槽骨的维持和恢复等的制剂。

实施例4：

将包涵体经过8摩尔/升的尿素变性溶解，再离子交换层析收集纯化达到95％以上的纯度后，将其稀释至200～600μg/m1。后装入经过常规处理的透析袋(截留分子量为10000)中，在6摩尔/升的尿素、加入低浓度(体积百分比0.1-1％)的表面活性剂吐温20、氧化还原体系(如0.1微摩尔/升～0.1毫摩尔/升的铜离子或/和还原剂/氧化剂比例为摩尔比从10∶1到1∶2，其中还原剂的浓度范围在1～10毫摩尔/升，所使用的还原剂可以是：还原型谷胱甘肽、半胱氨酸及其盐酸盐、巯基乙醇、半胱氨、二硫苏糖醇、二硫赤癣糖醇，所使用的氧化剂可以是：氧化型谷胱甘肽、氧化型的二硫苏糖醇和二硫赤癣糖醇、胱氨酸及其盐酸盐)；以及其它复性添加剂(如：0.5～10克/升的聚乙二醇4000或聚乙二酵6000或聚乙二醇8000或聚乙二醇10000，0.2～1.0摩尔/升的精氨酸及其盐酸盐或其它碱性氨基酸及其盐酸盐或三(羟甲基)氨基甲烷，1～20％的甘油及一定量的肝素)的偏碱性(pH8.0～9.5)复性液中复性，还原性SDS-PAGE检测复性效果。再经过进一步离子交换层析、分子排阻纯化使目的蛋白的二聚体纯度达到90％以上。再5摩尔/升的尿素、4摩尔/升的尿素、2摩尔/升的尿素、1摩尔/升的尿素透析至20毫摩尔/升磷酸盐缓冲液，冷冻干燥获得rhOP-1冻干粉。环氧乙烷灭菌后-20℃保存备用。

实施例5：

将经过离子交换层析(或/和疏水层析、反相层析)纯化达到95％以上纯度的rhOP-1单体，将其用2摩尔/升的尿素或1摩尔/升盐酸胍稀释至50～100μg/ml，并在其中添加0.4～0.6摩尔/升精氨酸，调其pH值在8.0～10之间，室温下复性24～60小时(还原性SDS-PAGE检测复性效果，图3)。复性样品再经过进一步层析纯化(离子交换、反相、疏水、非特异亲和及分子排阻)使二聚体纯度的纯度达到90％以上，然后①经透析、除菌、分装和冷冻干燥后得到rhOP-1成熟肽的基因工程产物的冻干份。②目的蛋白与胶原蛋白、吸收性明胶海绵、壳聚糖或珊瑚粉类材料、其他人工工程材料复合，可用于骨缺损的修复、矫形及用于口腔拔牙创齿槽骨的维持和恢复等。