17aα－D－高炔雌二醇－3－乙酯及其合成制备方法和以该化合物为活性成分的药物组合物

摘要

本发明公开了17aα－D－高炔雌二醇－3－乙酯的合成、光谱分析结构确证、稳定性研究、雌活性研究、含17aα－D－高炔雌二醇－3－乙酯的药物组合物，以及该合成产物的药物用途。将原料雌酚酮，经乙酰化、扩环、乙炔化等反应得到目标化合物17aα－D－高炔雌二醇－3－乙酯。本发明17aα－D－高炔雌二醇－3－乙酯药理活性的研究表明，其具有明显的抗辐射和对保护造血功能等生物活性，以及明显的抗癌效价，对多种试验肿瘤具有明显的抑制活性。17aα－D－高炔雌二醇－3－乙酯可望研制成为低毒高效具有抗辐射及抗肿瘤等多种生物功效的抗辐射及肿瘤治疗新药。

说明书

技术领域：

本发明的17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯及其合成制备技术属于医药化工领域中化学合成药物单体成分的合成制备技术。特别是涉及17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯合成制备方法，以及其在制备辐射防护、抗肿瘤、保护造血功能等药物中的应用。

背景技术：

雌激素类化合物的研究已有几十年的历史，有一定的生物效价，但往往由于雌活力高、副作用大而使应用受到限制。雌激素类化合物对放射损伤有较好的预防和治疗作用。雌激素作为抗放药物的研究国外已有近60年的历史，国内从十九世纪七十年代开始发现炔雌醇与环戊醚-炔雌醇对放射病有较好的预防和治疗效果，做了大量的研究工作。炔雌醇是一种常用的强雌激素，用炔雌醇预防小白鼠的急性放射病，于8.50Gy、9.0Gy照射剂量下，可使三十天存活率提高50～70％；于3.0Gy照射下，对犬具有同等的预防效果。同时，用炔雌醇治疗犬的急性放射病也有较好的疗效，但它有较强的雌活性和对胃肠肝脏产生不良影响和毒副作用，以及使子宫基底膜增厚的副作用而怀疑其潜在的致癌活性，使其在相关领域的应用受到限制。雌激素的辐射防护效果与雌激素的化学结构类型有着密切的关系。因此在抗放射病药物研究的过程中，如何寻找一个有关雌激素结构的同系物，使其既有较强的辐射防护效果，又有较低的雌活力及毒副作用，是雌激素类抗放药物研究工作中的重要内容。

为了提高炔雌醇的辐射防护效价，降低毒副作用，我们对其进行结构改造，设计并合成了甾体激素结构中D-五员环扩为六员环的化合物——17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯，合成步骤较长。并进行了辐射防护生物效价、抗肿瘤和保护造血功能、雌活力的研究工作，取得了明显的效果。

发明内容：

鉴于上述原因，本发明人对17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯合成制备的工艺方法进行了大量的实验研究，通过2种方式不同的反应对雌酚酮的扩环，由五员环制成六员环的D-高雌酚酮而后再加炔制得17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯，并进行了结构分析确证和室温放置的稳定性实验研究。由于扩环作用，使得药物雌活力大大降低，比雌酚酮低10000倍左右，那么毒副作用也相应降低。完成17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯的合成及制备工艺的发明、和含有17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯的药物组合物，以及该组合物在制备抗辐射损伤、抗肿瘤、和保护造血功能药物中的应用。

本发明的一个目的在于，公开了1种新型雌激素药物17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯及其合成制备工艺。

本发明另一个目的在于，公开了17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯在用于制备抗辐射损伤、抗肿瘤、保护造血功能药物方面的应用。

本发明再一个目的在于，公开了含有治疗有效量的17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯，及与一种或一种以上药学上可接受的载体组成的药物组合物。

本发明进一步详细地公开了17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯的制备工艺方法。

本发明的2种技术方案通过以下内容予以实现：

以雌酚酮为原料，经乙酰化、扩环、乙炔化等反应得到目标化合物17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯。

技术方案1具体按以下工艺步骤进行：

(1)乙酰化：称取一定量的雌酚酮原料，以乙酸酐和吡啶，搅拌反应2-8小时，得到3-乙酰化雌酚酮；

(2)加氰：将乙酰化产物与氰化钾或氰化钠反应6-20小时，得到17位上加氰产物；

(3)氢化还原：以冰乙酸为溶剂，以PtO₂为催化剂，在氢化反应釜中进行催化加氢还原反应，得到17位上氰还原的产物；

(4)重氮化扩环：17位上氰还原产物，在10-40％乙酸的水溶液中冰浴低温冷却下搅拌，滴加NaNO₂水溶液进行重氮化重排反应，D-环由五员环扩环为六员环，生成3-乙酰-D-高雌酚酮；

(5)炔化反应：在氮气保护下，将金属钾加入叔丁醇和金属钠干燥的无水苯中反应生成叔丁醇钾，加入3-乙酰-D-高雌酚酮后通入干燥的乙炔气反应，生成17-aα-乙炔-D-高雌二醇；

(6)乙酰化：17-aα-乙炔-D-高雌二醇以乙酸酐和吡啶，搅拌反应2-8小时，得到目标化合物。

利用本工艺生产多批产品，工艺稳定，收率在20-30％。

技术方案2具体按以下工艺步骤进行：

(1)乙酰化：称取一定量的雌酚酮原料，以乙酸酐和吡啶，搅拌反应2-8小时，得到3-乙酰化雌酚酮；

(2)重氮甲烷制备：以亚硝基甲基尿素，氢氧化钾/乙醚滴加法反应2-6小时，得到重氮甲烷的乙醚液；

(3)重氮甲烷扩环：将3-乙酰化雌酚酮乙醇液与重氮甲烷的乙醚液，反应3-8小时，得到3-乙酰-D-高雌酚酮；

(4)炔化反应：在氮气保护下，将金属钾加入叔丁醇和金属钠干燥的无水苯中反应生成叔丁醇钾，加入3-乙酰-D-高雌酚酮后通入干燥的乙炔气反应，生成17-α-乙炔-D-高雌二醇；

(5)乙酰化：17-α-乙炔-D-高雌二醇以乙酸酐和吡啶，搅拌反应2-8小时，得到目标化合物。

利用本工艺生产多批产品，工艺稳定、重现性好，收率在30-36％。

17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯经元素分析、IR、MS、¹H-NMR、¹³C-NMR、熔点(Mp)及性状分析，确证了结构。

17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯具有如下理化特性：

分子式：C₂₃H₂₈O₃；分子量：352；M.p：151-152℃

结构式：

光谱分析：

元素分析：计算值C％＝78.37％；H％＝8.00％

          实测值C％＝78.36％；H％＝7.81％

IR(KBr)cm^-1：3473.8；3303.0；3034.0，2985.0，2934.4，2862.9；1747.1；1610.3；1579.7；1495.8；1370.7；1220.2；1061。

MS(m/z)：352(12)分子离子峰；310(60)；213(95)；159(24)；133(24)；115(15)；43(22)

¹H-NMR(CDCl₃)δ：0.92(s，3H，C₍₁₈₎H)；2.26(s，3H，CH₃-CO-)；2.55(s，1H，)；6.78(d，J＝5.24Hz，1H，C₍₄₎H)；6.83(d，J＝8.4Hz，1H，C₍₂₎H)；7.27(d，d J＝3.29Hz，8.4Hz，1H，C₍₁₎H)。

¹³C-NMR(CDCl₃)δ：1 126.209；2 116.454；3 148.285；4 120.996；5138.180；6 29.779；7 26.274；8 38.819；9 41.564；10 137.976；1126.015；12 32.906；13 43.080；14 45.680；15 22.895；16 35.005；17 22.971；17α75.826；18 11.784；19——；20 86.696；2174.491.

对产品进行室温放置的稳定性实验研究，结果发现其在室温下放置2年以上稳定、无分解，纯度及理化指标不变。技术指标达到一类新药报批的技术要求。

药物组合物：

本发明的以17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯为活性成分的药物组合物，含有治疗有效量的17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯，及一种或一种以上的药学上可接受的载体。其中，所述的17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯治疗有效量为10～200mg；较好为15～150mg；最佳25～100mg。

所述的组合物包括口服制剂、注射液体制剂，其中口服制剂为片剂、各种胶囊或缓释片；注射液体制剂为注射用油制剂。

所述的药学上可接受的载体，包括制剂中常规的稀释剂、填充剂(如甘露醇、乳糖、聚乙二醇)，粘合剂(淀粉、微晶纤维素)，崩解剂(如羧甲基纤维素、低取代的羟丙基纤维素)，润滑剂(如滑石粉、硬脂酸镁)，湿润剂(如丙二醇、乙醇)，稳定剂(EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、乙醇胺、碳酸氢钠、烟酰胺)等等。上述辅料可以是常用剂量，以常用的配比与17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯混合，当17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯用量确定后，各药用辅料之间的配比可以根据需要适当调节。

压片制成片剂的使用，用作赋型剂的辅料有MgSO₄、玉米淀粉、滑石粉，规格有：25mg、50mg、100mg、150mg、200mg。

17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯油剂：将17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯溶于注射用茶油、豆油等配成注射油剂。

各种药物制剂的制备具体操作如下：

(1).按配置总量计称取含10～70％17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯，加入30～90％的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂等，充分搅拌混合制成颗粒，在60～70℃干燥2～4小时压制成片，使每片含17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯25～200mg。

(2).将制成的湿颗粒直接在60～70℃干燥2～4小时，然后充填入空胶囊壳中，使每粒胶囊含17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯50～200mg。

(3).油剂的制备：是称取1％～10％的17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯与注射用油，如茶油配制成油剂，分装灭菌，制得。

(4).按配置总量计，称取10％～60％的17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯，加入40％～90％的填充剂、抗氧剂等，加热熔融温度(40～90℃)，使原料和辅料充分混熔，滴制成丸，使每粒滴丸含17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯5～25mg。

本发明的施药量可根据用药途径、患者年龄、体重、疾病类型和严重程度等诸多因素加以调整，日剂量一般为10～200mg/kg；较好为15～150mg/kg；最佳为25～100mg/kg。可根据临床的病例表现适当加以改变。

本发明还公开了17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯在用于制备抗辐射损伤、抗肿瘤、保护造血功能方面药物的应用。其中，所述的抗肿瘤活性包括：制备治疗宫颈癌、白血病、肺癌药物方面的应用。例如17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯对乳腺癌、淋巴细胞白血病、宫颈癌U14、肺腺癌L795，以及对环磷酰胺所致小鼠造血功能损伤的保护作用。

药效学研究包括如下几个方面的研究内容：

(1)辐射防护作用实验研究

(2)体外抗肿瘤实验研究

(3)体内抗肿瘤实验研究

(4)体内抑瘤增效实验研究

(5)升高白细胞实验研究

(6)小鼠雌活性实验研究

一、辐射防护作用的实验研究：

(一)、17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯对小鼠辐射防护作用的研究：

材料和方法

1.动物及分组：昆明种小鼠，由中国医学科学院实验动物研究所提供。动物按体重随机分5组，对照组和实验组，体重为25±26g，雌雄各半。每组59只。

2.药物及配制：将17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯、EE2将药物滴加注射用茶油(天津氨基酸公司提供)配制成25μg/0.2ml，EE3和E3配制成100μg/0.2ml剂量。

3.给药方法：实验小鼠在照射前连续3d，每天1次腹腔注射给药，给药剂量17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯和EE2组剂量为每只小鼠25μg/0.2ml，EE3和E3剂量组为每只小鼠100μg/0.2ml。按每组小鼠30d存活数/每组小鼠总数×100％公式，计算30d存活率。

4.照射条件：利用¹³⁷Csγ-射线对动物进行全身照射，动物受照射量为8.0Gy，剂量率为0.87Gy/min，考察30d存活率。

结果：见表1

                 表1 4种雌激素照射前3、2、1d给药30d存活率

  组别  动物数量  (只)        30天存活数  平均生存天数  χ±SD  比对照组提高  (％)  (只)  (％)  对照  59  2/59  3.4  14.3±6.2  药物  59  22/59  37.3  12.1±2.0  33.9  E E3  60  9/60  15.0  11.0±3.0  11.6  E 3  59  3/59  5.1  12.7±4.3  1.7  E E2  59  13/59  21.7  9.9±2.8  18.3

17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯实验组动物存活22只，存活率比对照组提高33.9％，E E2组动物存活13只，比对照组提高18.3％，E E3组动物存活9只，比对照组提高11.6％，E3组动物存活3只，比对照组提高1.7％。17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯对受γ射线照射小鼠有明显的防护作用。

(二)、17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯对IRM-2和ICR小鼠的辐射防护作用：

1.1材料

IRM-2小鼠是我所自己培育的近交系辐射抗性小鼠，ICR小鼠由北京维通利华实验动物中心提供，两种品系小鼠各100只。动物按体重(24-26g)随机分5组，每组20只，雌雄各半，第1组为空白对照组，第2组为阳性对照组，3、4、5组为实验组。

1.2药物及配制

17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯、炔雌醇(EE2)、尼尔雌醇(523)。17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯加注射茶油配制成25μg/0.2ml、50μg/0.2ml、75μg/0.2ml、100μg/0.2ml、150μg/0.2ml、200μg/0.2ml六个不同浓度组，EE2配制成最佳有效剂量25μg/0.2ml，523配制成最佳有效剂量100μg/0.2ml。

1.3方法

实验小鼠在照射前3、2、1d连续3次分别腹腔注射17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯、IRM-2小鼠的阳性对照组给予EE2 0.2ml/只，对照组腹腔注射茶油0.2ml/只。最后一次腹腔注射给药后24h进行照射。ICR小鼠的阳性对照组在照射前7d、3d分2次给予523 0.2ml/只，最后一次腹腔注射给药后72h进行照射。

1.4照射条件

¹³⁷Csγ-射线一次性全身照射8.0Gy，剂量率为0.87Gy/min。

1.5观察指标

小鼠30d存活率、保护指数、小鼠活动表现、小鼠平均生存天数。30d存活率＝每组小鼠30d存活数/每组小鼠总数×100％。保护指数＝[(ab+30c)/n]/[(a′b′+30c′)/n′]。a、a′分别为给药组与对照组死亡鼠平均存活天数；b、b′分别为给药组与对照组死亡鼠数；c、c′分别为给药组与对照组的30d存活只数；n、n′分别为给药组与对照组总鼠数。

2结果

见表2、3。

表2 IRM-2小鼠8.0Gyγ-射线照射后30d存活率及保护指数

  组别  动物  数  存活数  存活率  平均生存天数  保护指数  对照组  20  0  0  10.85±3.61  EE₂25μg/0.2ml  20  6  30  15.80±10.53  1.76  100μg/0.2ml  20  11  55  21.60±9.40*  1.99  150μg/0.2ml  20  17  85  27.75±5.47*  2.56  200μg/0.2ml  20  15  75  26.75±6.16*  2.46

注：给药组与对照组相比*p＜0.001

从结果可以看出，17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯100μg/0.2ml、150μg/0.2ml、200μg/0.2ml三个不同剂量组，存活率分别比对照组提高55％、85％、75％，平均生存天数与对照组比较，差异有极显著性，(p＜0.001)，保护指数分别为1.99、2.56、2.46。EE2组存活率比对照组提高30％，保护指数为1.76，17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯与EE2比较，150μg/0.2ml、200μg/0.2ml两个剂量组差异有极显著性，(p＜0.001)。

从结果可以看出，17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯100μg/0.2ml、150μg/0.2ml、200μg/0.2ml三个不同剂量组，存活率分别比对照组提高20％、35％、30％，100μg/0.2ml剂量组平均生存天数与对照组比较，差异有显著性(p＜0.05)；150μg/0.2ml、200μg/0.2ml剂量组与对照组比较，差异有极显著性(p＜0.001)，保护指数分别为1.78、2.17、1.89。523组存活率比空白对照组提高25％，保护指数为1.82。平均生存天数与对照组比较差异有极显著性(p＜0.001)。实验结果显示，17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯能显著提高受照射小鼠30d存活率和保护指数。

表3 ICR小鼠8.0Gyγ-射线照射后30d存活率及保护指数

  组别剂量  动物数  (只)  存活数  (只)  存活率  (％)  平均生存  天数  保护指数  对照组  20  0  0  8.85±    2.81  523  100μg/0.2ml  20  5  25  16.0±    8.59**  1.82  药物  100μg/0.2ml  20  4  20  13.35±    8.47*  1.78  药物  150μg/0.2ml  20  7  35  17.8±    9.10**  2.17  药物  200μg/0.2ml  20  6  30  16.7±    8.78**  1.89  注：E₈₃₈与对照组相比*p＜0.05：**p＜0.001

二、体外抗肿瘤实验：

实验方法：实验采用MTT检验方法。

(1)接种细胞：取对数生长期细胞，经0.02％的EDTA消化后加入含有10～15％胎牛血清的RPMI-1640溶液，将细胞稀释成单细胞悬液，计数并调整细胞数并接种于96孔板。将接种后的细胞置37℃二氧化碳培养箱内培养24小时。

(2)加药：将样品分设1.55～200ug/ml等不同浓度，每浓度设4个复孔，对照设8个以上复孔。被检样品用RPMI-1640稀释，用DMSO助溶。加药后仍将细胞置37℃二氧化碳培养箱内继续培养72小时。

(3)加MTT：MTT以RPMI-1640溶解，每孔加50ul。再置37℃继续培养4小时后取出。

(4)测OD值：弃除96孔板内的上清液，每孔加入DMSO 150ul。在酶标仪630nm处测定OD值。

评价指标：细胞生长抑制率。抑制率＝(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100％。以直线回归方法计算IC₅₀。

结果：17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯对人乳腺癌肿瘤细胞增殖的抑制作用，测定其IC₅₀为5.6ug/ml；对培养的小鼠淋巴细胞白血病L1210细胞抑制作用IC₅₀为3.42ug/ml。

三、体内抗肿瘤活性研究：

(一)、对小鼠宫颈癌U14的治疗研究

1材料与方法

1.1将17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯配制成5mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg三个不同剂量组。环磷酰胺(CY)用前用无菌生理盐水配为25mg/kg。

1.2瘤种及动物  小鼠宫颈癌U14细胞，由天津市药物研究所提供。IRM-2小鼠是我所自己培育的近交系小鼠。

1.3抑瘤实验  将小鼠随机分为5组，每组8只，体重为22～23g，实验设对照组、17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯低、中、高剂量组和阳性对照CY组，给药途径采用腹腔注射。取U14细胞在IRM-2小鼠接种7-9d的腹水，用生理盐水稀释约5×10⁷/ml瘤细胞。取细胞悬液0.2ml/只接种于小鼠腋部皮下。第2d开始给药0.2ml/只，每日1次，共7次。CY于接种肿瘤后第2d开始给药，0.2ml/只、隔日1次，共4次。实验中逐日观察各组动物的肿瘤体积，用游标卡尺测量肿瘤长径a和短径b，并绘制肿瘤生长变化曲线，体积根据公式V＝ab2/2(a-长径，b-短径)计算。实验进行10d后颈椎脱臼处死小鼠，称量体重、瘤重、脾脏和胸腺重量，计算抑瘤率，抑瘤率＝(对照组瘤重-给药组瘤重)/对照组瘤重×100％。

1.4股骨有核细胞的测定  处死小鼠后，取出一侧股骨，去除肌肉组织，用白细胞稀释液冲洗骨髓细胞，观察骨髓有核细胞数。

1.5统计学处理  数据统计结果用x±S表示，两组比较用t检验。

2.药物对小鼠移植性肿瘤U14细胞的治疗实验结果：见表4。

             表4药物对小鼠移植性肿瘤U14的治疗实验结果

  组别  剂量  (mg/kg)  开始体重(g)  结束体重(g)  瘤重(g)  瘤重抑制  率(％)  对照组  23.33±1.11  27.13±2.25  1.71±0.60  环磷酰胺  25  23.04±1.24  26.87±2.53  0.50±0.14  70.8***  低剂量  5  24.33±2.05  27.06±2.22  1.08±0.46  36.8  中剂量  7.5  24.17±2.11  28.38±3.12  0.61±0.27  64.3**  高剂量  10  24.33±2.05  27.23±2.80  0.86±0.54  49.7*

注：与对照组相比，*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001

17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯对小鼠U14肿瘤的治疗实验结果见表4。三个不同浓度组对小鼠U14肿瘤的生长均有明显的抑制作用，5mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg对小鼠U14的瘤重抑制率分别为36.8％、64.3％和49.7％，其中10mg/kg剂量组与对照组有显著性差异(P＜0.05)，7.5mg/kg剂量组与对照组有显著性差异(P＜0.01)，对U14抑瘤作用明显。阳性对照药物环磷酰胺对小鼠U14肿瘤生长有明显的抑制作用，对小鼠U14的瘤重抑制率为70.8％。

3.17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯治疗后U14荷瘤鼠免疫系统指标变化：

17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯治疗后U14荷瘤鼠胸腺、脾脏及骨髓有核细胞数变化结果见表5，三个不同浓度组小鼠的胸腺重量及骨髓有核细胞的数量均高于对照组。中剂量组最明显。

             表5药物治疗后U14荷瘤鼠胸腺、脾脏、BMC的变化

  组别  剂量  (mg/kg)  胸腺/体重(％)  脾重/体重(％)  骨髓有核细胞数  (×106)/股骨  对照组  1.88±0.13  17.33±1.37  13.70±4.38  环磷酰胺  25  0.85±0.22*  9.72±1.64*  6.77±2.76*  低剂量  5  1.85±0.88  16.92±3.75  14.04±2.51  中剂量  7.5  2.64±0.64  12.00±3.63  14.9±3.59  高剂量  10  1.42±0.11  16.04±3.65  13.97±3.81

注：*与对照组比较，P＜0.01。

结果17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯5mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg三个剂量对小鼠U14的抑瘤率分别为36.8％、64.3％、BMC数均高于对照组，肿瘤生长也较对照组慢。17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯对小鼠U14肿瘤的生长有明显的抑制作用和刺激骨髓细胞增殖功能。

(二)、17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯对小鼠肺腺癌LA795的治疗研究：

1材料与方法

1.1药物将17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯配制成5mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg三个不同剂量组。环磷酰胺(CY)配为25mg/kg。

1.2瘤种及动物小鼠肺腺癌LA795细胞，由天津市药物研究所提供。IRM-2小鼠是我所自己培育的近交系小鼠。

1.3抑瘤实验  将小鼠随机分为5组，每组8只，体重为22～23g，实验设对照组、17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯低、中、高剂量组和阳性对照CY组，给药途径采用腹腔注射。取LA795细胞在IRM-2小鼠接种，取第2代瘤块1～2mm，无菌环境在小鼠腹股沟皮下包埋。接种后第2d开始按17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯药物的三个不同剂量给药0.2ml/只，对照组注射茶油0.2ml/只，每日1次，共7次。CY于接种肿瘤后第2d开始给药，0.2ml/只、隔日1次，共4次。10d后颈椎脱臼处死小鼠，称量体重、瘤重、脾脏和胸腺重量，计算抑瘤率，抑瘤率＝(对照组瘤重-给药组瘤重)/对照组瘤重×100％。

1.4股骨有核细胞的测定  处死小鼠后，取出一侧股骨，去除肌肉组织，用白细胞稀释液冲洗骨髓细胞，观察骨髓有核细胞数。

2结果：

见表6

17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯对小鼠LA795的治疗实验结果见表1。三个不同浓度组对LA795肿瘤的生长均有明显的抑制作用，5mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg对LA795的瘤重抑制率分别为46.0％、60.0％，58.0％，其中7.5mg/kg、10mg/kg与对照组有显著性差异(P＜0.01)。阳性对照药物环磷酰胺对小鼠LA795肿瘤生长有明显的抑制作用，对LA795的瘤重抑制率为68％。

              表6药物对小鼠移植性肿瘤LA795的治疗实验结果

  组别  剂量  (mg/kg)  开始体重(g)  结束体重(g)  瘤重(g)  瘤重抑制  率(％)  对照组  23.20±1.30  27.83±2.89  0.50±0.31  环磷酰胺  25  22.90±0.93  24.85±1.48  0.16±0.10  68*  低剂量  5  23.50±1.68  27.55±2.38  0.27±0.16  46  中剂量  7.5  23.30±1.77  27.35±1.57  0.20±0.12  60*  高剂量  10  23.50±1.68  28.32±1.84  0.21±0.10  58*

注：与对照组相比*P＜0.01。

3.17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯治疗后LA795荷瘤鼠免疫系统指标变化：

17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯治疗后LA795荷瘤鼠胸腺、脾脏及骨髓有核细胞数变化结果见表7，三个不同浓度组小鼠的胸腺重量及骨髓有核细胞的数量均高于对照组。中剂量组最明显。

           表7药物后LA795荷瘤鼠胸腺、脾脏、BMC的变化

  组别  剂量  (mg/kg)  胸腺/体重(％)  脾重/体重(％)  骨髓有核细胞数  (×106)/股骨  对照组  1.26±0.35  7.43±1.71  14.77±3.48  环磷酰胺  25  1.12±0.51*  3.74±0.87*  6.23±1.83*  低剂量  5  1.93±0.83  6.18±0.52  16.00±4.10  中剂量  7.5  1.52±0.22  8.50±0.93  15.97±1.86  高剂量  10  1.54±0.36  7.17±1.11  16.10±1.95

注：与对照组相比*P＜0.01

从实验结果可以看到，17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯三个剂量组5mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg对肺腺癌的抑瘤率达分别为46.0％、60.0％、58.0％，而7.5mg/kg、10mg/kg剂量组与对照组相比均有显着性差异(P＜0.01)。胸腺重量及骨髓有核细胞的数量均高于对照组。说明17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯对小鼠免疫功能有明显的保护作用。17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯药物不仅有直接的抗肿瘤作用，更主要的还能增强机体免疫功能，调动机体自身的抗癌能力。

四、体内对小鼠S180瘤株放射增效作用：

1材料与方法

1.1药物  将17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯配制成5mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg三个不同剂量组。环磷酰胺(CY)配为25mg/kg。

1.2瘤种及动物  小鼠S180瘤株，由天津市药物研究所提供。IRM-2小鼠是我所自己培育的近交系小鼠。

1.3抑瘤增效实验  将小鼠随机分为11组，每组8只，体重为22～23g，给药途径采用腹腔注射。取S180腹水瘤用生理盐水1∶3稀释接种0.2ml/只，第2d开始按17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯药物的三个不同剂量给药0.2ml/只，对照组注射茶油0.2ml/只，每日1次，共7次。CY于接种肿瘤后第2d开始给药，0.2ml/只、隔日1次，共4次。接种后第4d开始用¹³⁷Csγ-射线一次性全身照射1.0Gy，剂量率为0.84Gy/min。连续5d。

10d后颈椎脱臼处死小鼠，称量体重、瘤重、脾脏和胸腺重量，计算抑瘤率，抑瘤率＝(对照组瘤重-给药组瘤重)/对照组瘤重×100％。观察骨髓有核细胞数。

2.117aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯对小鼠S180的治疗实验结果见表8。三个不同浓度组对S180肿瘤的生长均有明显的抑制作用，5mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg对S180的瘤重抑制率分别为39.9％(与对照组相比有显著性差异P＜0.01)、54.81％(与对照组相比有极显著性差异P＜0.001)，53.85％(与对照组相比有显著性差异P＜0.05)，照射组对瘤重的抑制率分别为52.12％、59.62％，59.62％，其中5mg/kg、7.5mg/kg与对照组相比有极显著性差异(P＜0.001)，10mg/gk剂量组与对照组相比有显著性差异(P＜0.01)阳性对照药环磷酰胺对S180的瘤重抑制率为72.49％。

                  表8药物对小鼠肉瘤S180瘤株放疗增效作用研究结果

  组别  剂量  mg/kg  开始体重  (g)  结束体重  (g)  瘤重(g)  瘤重  抑制率  (％)  P值  对照组  22.34±5.35  30.73±5.76  2.08±0.33  r射线  21.96±5.52  26.30±4.64  1.20±0.58  42.33  P＜0.05  环磷酰  胺  25  22.56±4.52  25.72±4.12  0.57±0.21  72.49  P＜0.001  低剂量  5  21.70±4.29  29.38±5.56  1.25±0.18  39.90  P＜0.01  低剂量  +r  5  21.93±4.76  29.78±5.26  1.00±0.14  52.12  P＜0.001  中剂量  7.5  22.28±4.28  27.88±4.59  0.94±0.14  54.81  P＜0.001  中剂量  +r  7.5  21.65±4.36  29.60±4.75  0.84±0.34  59.62  P＜0.001  高剂量  10  22.17±4.37  27.72±6.52  0.96±0.39  53.85  P＜0.05  高剂量  +r  10  22.07±4.59  26.40±4.64  0.86±0.35  59.62  P＜0.01

结果表明，17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯和1Gy的r射线照射合用，对IRM-2小鼠的S180抑制与对照组相比差异显著。

五、对小鼠造血功能保护作用的研究：

材料与方法

1.药物  将17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯配制成5mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg三个不同剂量组，茜草双酯配为100mg/kg，环磷酰胺配为100mg/kg。

2.动物  IRM-2小鼠是我所自己培育的近交系小鼠，体重22-23g。

3.实验方法：动物随机分为5组，每组10只，17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯药物的三个不同剂量及阳性对照组给药，0.2ml/只，对照组注射茶油0.2ml/只，每日1次，共5次。CY于实验第3d开始给药，腹腔注射0.2ml/只，连续3天。

4.观察指标：造血功能三项指标，第9d颈椎脱臼处死小鼠，脾指数、胸腺指数，电子显微镜下记骨髓有核细胞数，脾结节数。

结果：见表9。

表9 IRM-2小鼠第9天股骨有核细胞数、脾结节数和脾脏指数

  组别  BMC×10⁶  股骨/根  胸腺/体  重(％)  脾重/体  重(％)  CFU-S  个/脾  P值(BMC)  对照组  7.57±2.67  0.87±0.32  3.82±    0.95  1.33±0.47  茜草双  酯  13.03±   2.40   0.83±0.19  4.63±    1.06  4.33±2.75  P＜0.01  5mg/kg  12.60±    2.33  1.03±0.29  4.03±    0.54  1.67±0.75  P＜0.01  7.5mg/  kg  12.93±    2.99  0.99±0.20  4.08±    0.62  2.75±1.79  P＜0.05  10mg/kg  11.20±    1.11  0.83±0.19  4.47±    1.01  4.00±1.26  P＜0.01

17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯5mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg三个不同剂量组BMC经统计学处理与对照组相比有显著性差异。CFU-S系代表一类多向性的造血干细胞群，它们具有自我更新和向骨髓红系、粒系和巨核细胞分化的能力，CFU-S是促进造血恢复的主要成分。BMC是骨髓中的有核细胞成分。CFU-S和BMC的变化代表机体造血组织恢复的能力。从本实验中可以看出，17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯具有保护小鼠的造血功能作用。

六、药物雌活性的研究：

材料和方法

1.动物及分组：昆明种小白鼠，由中国医学科学院实验动物研究所提供。实验用出生后18d的雌性小鼠70只，按体重随机分7组，每组10只。

2.药物及配制：将17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯、EE2将药物滴加注射用油配制成25μg/0.2ml。

给药方法：17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯和EE2组剂量为每只小鼠25μg/0.2ml，在照射前连续3d，每天1次腹腔注射给药，最后1次给药后24h，将小鼠颈椎脱臼处死，取出子宫迅速称重。

按公式求值比较。子宫重量百分率＝子宫湿重/每100克体重×100％。

3.观察指标：子宫重量百分率。

结果：

见表10。

17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯与炔雌醇雌活性测定结果见表10，从结果中可以看出，17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯的雌活性低，仅为炔雌醇的1/10000。因此17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯具有疗效高、毒副作用小的特点。

表10 17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯与E E2雌活性测定比较

  药物浓度  (mg/ml)  动物数  (只)  药物  与对照组比  值(％)  E E₂  与对照组比  值(％)  对照组  10  1.47±0.22  100.00  1.47±0.22  0.448±    0.113  101  10  0.483±0.095  328.60*  0.612±    0.141  416.30  102  10  0.297±0.06  202.04  0.603±    0.162  410.20  103  10  0.257±0.043  174.80  0.503±    0.127  342.20  10⁴  10  0.188±0.021  127.90  0.496±    0.100  337.40  105  10  0.170±0.016  115.60  0.477±    0.110  324.50*  10⁶  10  0.150±0.022  102.00  0.448±    0.113  304.80

本发明的新型雌激素化合物17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯及制备方法具有如下的优点：

(1).17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯，具有雌活性低，副作用小的特点。

(2)。17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯同时具有辐射防护、抗肿瘤和保护造血等多种功效的特点

(3).利用本工艺制备的17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯，具有收率较高工艺稳定的特点，总收率在20-36％之间。

(4).本发明的17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯有效成分确切，具有稳定性好，药效稳定的特点。

(5).由于有效成分确切，具有药物质量稳定可控制的特点。

具体实施方式：

为了更充分的解释本发明的实施，提供下述制剂实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。制剂可以采用本发明中的任意一批的化合物活性成分。下面通过实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1：

(1)雌酚酮-3-乙酯(I)的合成：

将100g雌酚酮，66ml吡啶，66ml醋酐于25℃恒温搅拌6hr，外加干燥管，缓慢倾入600ml水中，析出白色固体，放置2hr，抽滤，以大量热水洗至无吡啶味，于60℃干燥，重量110.0g，mp：119-121℃，经薄层层析监测为单一成份。产率94.8％。

(2)17-氰基雌二醇-3-乙酯(II)的合成：

将110.0g(0.352mole)雌酚酮-3-醋酸酯，220g KCN，1830ml 95％乙醇，950ml的冰乙酸于25℃恒温搅拌24hr，而后于75℃恒温1hr，移出放冷，倾入6000ml水中，析出白色沉淀，抽滤，水淋洗干净，抽干，60℃干燥，重110.5g。TLC显示为二组份，反应不完全，仍含少量原料点。乙酸乙酯、正己烷重结晶，重84.7g，收率71％。

(3)D-高雌酚酮-3-乙酯(III)的合成：

将25g(0.074)17-氰基雌二醇-3-醋酸酯，8.3g PtO₂和1300ml冰乙酸于25-30℃恒温，至不再吸收氢气为止，共加氢6hrs。过滤除去PtO₂，减压蒸除大部分冰乙酸，蒸至还有约200ml体积时，转移至另一反应瓶中，冷却下加入水1000ml，冰浴冷却搅拌，维持在0-2℃，滴加25g亚硝酸钠(NaNO₂)溶于250ml水中的稀溶液，加毕搅拌6hr，放置过夜。每次用700ml乙醚萃取，共3次，合并提取液，饱和NaHCO₃液洗2次，水洗二次，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发至干，重27g。经丙酮、环己烷重结晶得21g纯品，mp：116-118℃，收率87％。

(4)17aα-D-高炔雌二醇(IV)的合成：

反应瓶装置以回流冷凝器，于其内放入237.5ml(0.235mol)叔丁醇和100ml用金属钠干燥的无水苯，将18.8g金属钾(0.048mol)加入其中。加金属钾前，仪器系统先通N₂气，并于55-60℃，在N₂气流下使钾溶解(约需2小时)。

外用热水浴使温度升至35-40℃，于搅拌下通入干燥乙炔气约2小时，反应液成为糊状物。将6.5g(0.020mol)D-高雌酚酮(mp 253-257℃)放在60ml无水四氢呋喃和75ml无水苯的溶液中，全部溶解。用等压漏斗于0.5小时滴入至上述炔钾的溶液中，搅拌下继续通入乙炔气反应10小时，反应液呈碱性(pH＞10-11)。冰浴冷却下，用30％H₂SO₄中和至酸性(约用60ml)，反应液中析出粘稠固体，用95％的乙醇洗出，于40℃水浴中，旋转蒸发去除溶剂，得白色固体，用水洗至中性。固体于红外灯下干燥，粗产物重：4.6g，mp：90.7-98.8℃。用乙醇和水重结晶，干燥后重3.9g，收率62.9％。

(5)17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯(V)的合成：

将上步制得的17aα-D-高炔雌二醇2.0g(0.0064mol)，加入吡啶10ml溶解，加入5ml(0.0053mol)醋酸酐，于室温(25-28℃)搅拌2小时，反应混和物倒入冰水中，用乙醚提取，乙醚提取液用水洗2次，无水硫酸镁干燥。滤去干燥剂，滤液旋转蒸发去除溶剂，残余物为粘稠固化物，重1.95g，产率85％。以苯和正己烷重结晶，加入苯刚好使其溶解，而后滴加正己烷至混浊，析出白色固体，放入冰箱过夜，次日过滤得白色固体，重：1.7g，mp：125.3-127.6℃。收率75.5％。五步总收率27.8％。

实施例2：

(1)雌酚酮-3-乙酯(I)的合成：

将100g(0.37mole)雌酚酮，66ml吡啶，66ml醋酐于25℃恒温搅拌6hr，外加干燥管，缓慢倾入600ml水中，析出白色固体，放置2hr，抽滤，以大量热水洗至无吡啶味，于60℃干燥，重量112.0g，mp：119-121℃，产率96.5％。

(2)重氮甲烷的制备：

在500ml的烧瓶中加入60ml 50％的NaOH溶液及200ml的乙醚，混合物冷却到5℃，并且加入20.6g(0.2mole)的亚硝基甲基尿，并加搅拌子轻轻搅拌反应4小时，醚层呈浅黄色，以分液漏斗将醚层，直接进行下一步反应。

(3)D-高雌酚酮-3-乙酯(III)的合成：

将62.4g(0.20mole)加入1000ml的烧瓶中，加乙醇300ml搅拌溶解，以冰浴冷却至5℃，滴加重氮甲烷的乙醚液，在0.5小时滴加完，继续搅拌3小时，室温搅拌3小时，终止反应，蒸除溶剂，得固体64g。经丙酮、环己烷重结晶得51g纯品，收率78.2％，mp：117-118℃。

(4)17aα-D-高炔雌二醇(IV)的合成：

反应瓶装置以回流冷凝器，于其内放入245ml(0.242mole)叔丁醇和120ml用金属钠干燥的无水苯，将20g金属钾(0.051mole)加入其中。加金属钾前，仪器系统先通N₂气，并于55-60℃，在N₂气流下使钾溶解(约需2小时)。

外用热水浴使温度升至35-40℃，于搅拌下通入干燥乙炔气约2小时，反应液成为糊状物。将7.5g(0.023mol)D-高雌酚酮-3-乙酯(mp 253-257℃)放在70ml无水四氢呋喃和85ml无水苯的溶液中，全部溶解。用等压漏斗于0.5小时滴入至上述炔钾的溶液中，搅拌下继续通入乙炔气反应10小时，反应液呈碱性(pH＞10-11)。冰浴冷却下，用30％H₂SO₄中和至酸性(约用75ml)，反应液中析出粘稠固体，用95％的乙醇洗出，于40℃水浴中，旋转蒸发去除溶剂，得白色固体，用水洗至中性。固体于红外灯下干燥，粗产物重：5.2g，mp：90.5-98.6℃。用乙醇和水重结晶，干燥后重4.3g。收率59.9％。

(5)17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯(V)的合成：

将上步制得的17aα-D-高炔雌二醇2.5mg(0.0080mol)，加入吡啶14ml溶解，加入7.5ml(0.0080mol)醋酸酐，于室温(25-28℃)搅拌2小时，反应混和物倒入冰水中，用乙醚提取，乙醚提取液用水洗2次，无水硫酸镁干燥。滤去干燥剂，滤液旋转蒸发去除溶剂，残余物为粘稠固化物，重2.0g，产率87.2％。以苯和正己烷重结晶，加入苯刚好使其溶解，而后滴加正己烷至混浊，析出白色固体，放入冰箱过夜，次日过滤得白色固体，重2.1g；mp：125.3-127.6℃。收率74.6％。五步总收率33.7％

实施例3：

取17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯50.0g，药用淀粉50.0g，50％乙醇适量，制粒，整粒，烘干，装2#胶囊，每粒含17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯0.1g。

实施例4：

取17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯50.0g，药用淀粉30.0g，糊精30.0g，50％乙醇适量，将上述原料充分搅拌混合制成颗粒，在60～70℃干燥2～4小时，制成1000片，每片含17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯0.05g。

实施例5：

无菌条件下取17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯25g，加入到注射用茶油5000ml中，搅拌约30分钟溶解，灌封、灭菌，即得注射油剂。

在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受限于说明书中所举实例的实施方式。