组培诱导虎杖毛状根制备虎杖苷的方法

摘要

本发明提供一种利用组培技术和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogene)生根质粒上的一段T－DNA对虎杖外植体进行遗传转化诱导培养所产生的毛状根来生产虎杖苷的方法。它包括如下步骤：A、野生虎杖组培；B、发根农杆菌的活化培养；C、虎杖毛状根的诱导培养；D、虎杖毛状根优化培养；E、虎杖毛状根中虎杖苷的提取。本发明的技术进步效果表现在：与从野生虎杖根及根茎中提取虎杖苷和白藜芦醇的现今生产方式相比，利用毛状根来生产以根入药为主的药用植物的某些有效成分，具有生产周期短、质量和产量稳定、不占用耕地等优点，而且天然药物的生产是在可控和可重复条件下进行，不会受到病虫害和自然环境等因素的影响。

说明书

技术领域

本发明涉及到一种组培诱导虎杖毛状根制备虎杖苷的方法，属于植物生物技术领域。

背景技术

虎杖苷(polydatin)和白藜芦醇(resVeratrol)均为植物体内天然产生的二苯乙烯类多酚物质，是具有明确的化学结构和确切疗效的单体化合物，对人体具有强心扩血管、抑制血小板凝集、降血脂、抗病毒和增强机体免疫力等作用，更为重要的是其特异性地针对癌细胞具有杀伤力而不影响正常细胞，被誉为“二十一世纪最有前途的抗癌药物之一”，因此广泛应用于临床医疗及保健业，国内外市场需求量很大。

虎杖苷和白藜芦醇在自然界的很多植物中都存在，例如葡萄、花生、藜芦、虎杖、欧洲云杉等，其中以在虎杖中的含量最为丰富，远远超过其他植物。目前制药工业主要依靠从大量采挖的野生虎杖根及根茎中提取虎杖苷和白藜芦醇，据统计提取10吨白藜芦醇需要消耗5000吨虎杖原料。虎杖苷和白藜芦醇在植物体内的含量不仅普遍较低，而且还明显受到产地、采收季节以及生长环境等因素的影向，例如云南地区的虎杖根茎中虎杖苷的含量为3.24％，而广东一带仅为0.64％；同一产地的虎杖八月份采收时其根茎中含有白藜芦醇0.30％，到十月份采收时就降为0.04g％，所以单纯依靠从植物原料中提取的方法，不仅质量难以控制，而且生产周期长、成本高、产品得率低，更为严重的是长期掠夺式地采挖还会加快野生资源的灭绝速度，不符合我国经济可持续发展的战略要求。如何在不破坏自然资源的条件下，生产出质量可控、纯度较高的白藜芦醇及其苷类，是当前研究的热点问题。

生物合成(biosynthesis)，即通过对植物高产细胞、组织或器官的筛选与优化培养，将植物体作为一个“药物加工厂”，在特定的生物反应器内达到目标成分的高效产出，对于解决中草药资源的可持续利用及天然药物的生产问题具有重要意义。目前，利用生物合成途径生产虎杖苷或白藜芦醇的研究主要集中在细胞培养物方面，例如专利00113914.2公开了利用葡萄细胞株生产白藜芦醇的技术方案。但是利用细胞培养物进行次生代谢物的大规模生产存在许多不足，例如细胞普遍生长缓慢且依赖激素维持、含量低下、遗传稳定性差和放大培养时对剪切力敏感等。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是利用组培技术和发根农杆菌(Agrobacter ium rhizogene)生根质粒上的一段T-DNA对虎杖外植体进行遗传转化诱导培养所产生的毛状根来生产虎杖苷的方法。

本发明的技术方案是这样实现的：组培诱导虎杖毛状根制备虎杖苷的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

A、野生虎杖组培：选取发育良好的野生虎杖植株茎段顶部的幼芽，消毒处理后经分化培养，壮苗培养，生根培养形成发育完整的幼苗，切取无菌组培苗的茎段、叶片、叶柄及幼芽等外植体作为感染材料备用；

B、发根农杆菌的活化培养：取出冰箱保存的发根农杆菌菌株ATCC11325室温平衡20～30min，然后在超净工作台上吸取500～800μl菌液于已灭菌的100～150ml新鲜YEB培养液中，于23～27℃、120～160r·min^-1、黑暗振荡培养20～24h即可；

C、虎杖毛状根的诱导培养：划伤受体材料表面以形成伤口，放入步骤B的农杆菌菌液中浸泡5sec～15min使之充分接触，取出感染材料用无菌吸水纸轻轻蘸干多余菌液，24～27℃、黑暗条件下置于MS₀中进行共培养。7～15天后在感染材料的伤口部位可见毛状根的萌生；

D、虎杖毛状根优化培养：经分子鉴定后采用1/2MS₀液体培养基，附加3％蔗糖作为碳源，在pH值为6.0～6.5，温度22～27℃，摇床转速：120～140r·min^-1，黑暗或弱光条件下6～30天获得大量增殖的毛状根株系；

E、虎杖毛状根中虎杖苷的提取：从培养液中取出毛状根、烘干、研磨成粉末，用50％(V∶V)乙醇结合30～40min超声波处理进行提取，之后于3000r/min离心15～20min，取上清液减压浓缩，再经过柱层析分离、浓缩、结晶、冷冻干燥，即可得到纯度较高的虎杖苷产品。

所述的组培诱导虎杖毛状根制备虎杖苷的方法，步骤A中对野生材料的消毒方法是采用流水冲洗干净后置于超净工作台上，75％(V∶V)酒精浸泡10～30sec，无菌水漂洗三次后再置于0.1％(W∶V)升汞溶液中表面消毒3～8min，无菌水充分漂洗后即可接种；诱导丛生芽分化的培养基是指MS+0.05mg/LTDZ+0.5mg/L NAA+0.1mg/L 6-BA；壮苗生长的培养基是指MS+0.1mg/LCPPU+1.0mg/L NAA，生根培养基是指MS+1.0mg/L NAA+0.5％活性炭；上述培养条件均为白天27±1℃，夜晚20±1℃湿度60～70％，光强28μmol/m².s，光照时间：13～17h/d。

所述的组培诱导虎杖毛状根制备虎杖苷的方法，提高步骤G所述的虎杖毛状根诱导率的方法包括：

a、发根农杆菌与根癌农杆菌双感染；b超声波振荡辅助感染；c，微波辐射辅助感染；d、选取成熟叶的叶片部分作为感染材料；e、感染叶片不经预培养且共培养时叶片上表皮向上放置；或f、黑暗、室温环境下诱导根的发生。

所述的组培诱导虎杖毛状根制备虎杖苷的方法，步骤D所述的分子鉴定是指：切取从感染材料上产生的毛状根根段，分离成单根后转接至MS₀固体培养基中生长，10～15天继代培养一次；从大量的单克隆毛状根系中筛选生长迅速、外形粗壮、分枝较多的毛状根进行PCR分子鉴定，证实具有转发根农杆菌T-DNA性质的毛状根进入下一步操作。

所述的组培诱导虎杖毛状根制备虎杖苷的方法，步骤D所述的培养周期6～24天内采取每7天更换培养液一次。

所述组培诱导虎杖毛状根制备虎杖苷的方法，将步骤D得到虎杖毛状根进行固体种质保存以用于工业化生产。

所述组培诱导虎杖毛状根制备虎杖苷的方法，将生长迅速、含量较高且遗传稳定的优良虎杖毛状根单克隆系，保存于添加有1％活性碳并提高蔗糖含量至5％的MS固体培养基中。

所述组培诱导虎杖毛状根制备虎杖苷的方法，将步骤D得到的虎杖毛状根在优化条件下扩大培养以便定期收获毛状根，继代培养时接种量控制在0.5～1.0g鲜重毛状根：100～150ml培养液。

所述组培诱导虎杖毛状根制备虎杖苷的方法，可同时制备白藜芦醇提取物。

本发明的技术进步效果表现在：

(1)与从野生虎杖根及根茎中提取虎杖苷和白藜芦醇的现今生产方式相比，利用毛状根来生产以根入药为主的药用植物的某些有效成分，具有生产周期短、质量和产量稳定、不占用耕地等优点，而且天然药物的生产是在可控和可重复条件下进行，不会受到病虫害和自然环境等因素的影响。

(2)与化学合成的方法相比，利用毛状根培养物生物合成途径除了可提供虎杖苷和白藜芦醇外，还可直接生产出前体及其他具有药理活性结构而化学手段很难合成的化合物，此外产物可无限、连续、均匀的生产，分离、提取操作简单，节约人力物力。

(3)与利用其他组织培养物(如自然根、愈伤组织、悬浮细胞等)生产方式相比，毛状根中由于导入了发根农杆菌Ri质粒上的T-DNA，具有不依赖激素自主快速生长的特性，而其他培养物必须添加昂贵或对人体有毒害的外源激素来维持其生长。在本发明具体实施例中筛选获得的优质虎杖毛状根株系，在30d培养期内干重增长率可达到8.29，是相同条件下悬浮培养细胞的192.8倍，是自然根培养物的8.4倍。此外，毛状根遗传性能稳定，继代操作简单，生长不需要光照，成本低廉，更适于工厂化生产。

(4)本发明利用野生型发根农杆菌和根癌农杆菌双菌共感染的方式，不仅可以明显提前出根，而且有效提高了毛状根的诱导率及诱根密度，毛状根平均诱导率可达到97.1％，诱根密度达到15.8，远远高于同属其他植物。此外，与以往文献报道不同的是，本项技术中感受材料不需预培养，划伤后直接浸泡于活化好的菌液中，在叶片生根及毛状根继代培养过程中均不需要繁杂的除菌工作，节省了人力物力，也使得毛状根的诱导与培养操作更为简便。

附图说明

图1感染7d后从叶片上开始出现毛状根

图2感染20d后形成大量生长迅速的毛状根系

图3虎杖毛状根的液体扩大培养

图4虎杖毛状根中rolb基因引物经PCR扩增后产物的琼脂糖电泳图谱

图中：从左向右依次为：①空白(无模板DNA)；②Ri质粒；③感染叶片；④未感染叶片；⑤Marker；⑥毛状根；⑦自然根。

图5虎杖毛状根中tms基因引物经PCR扩增后产物的琼脂糖电泳图谱

图中：从左向右依次为：①Marker；②毛状根；③自然根；④空白(无模板DNA)。

图6虎杖苷对照品的HPLC色谱图

图7白藜芦醇对照品的HPLC色谱图

图8虎杖毛状根样品的HPLC色谱图

图中：虎杖苷对照品0.101mg·mL^-1白藜芦醇对照品0.0300mg·mL^-1

1、虎杖苷  2、白藜芦醇

具体实施方式

实施例1

1、选取生长健壮、发育良好，无病虫害及霉菌侵染的野生虎杖植株茎段顶部的幼芽，常规消毒处理后置于诱导丛生芽分化的培养基中：MS+0.05mg/LTDZ+0.5mg/L NAA+0.1mg/L 6-BA。培养条件为白天温度：27±1℃，夜晚温度：20±1℃；湿度：60-65％，光强：28μmol/m².s，光照时间：14h/d。15d后将丛生苗分离成单株，置于壮苗生长培养基中：MS+0.1mg/L CPPU+1.0mg/LNAA，培养条件同上。1周后移植单株组培苗于生根培养基中：MS+1.0mg/L NAA+0.5％活性炭，培养条件同上。以此不定芽器官增殖途径可持续进行快繁，每株芽的繁殖系数为5～7，2周内即可获得发育良好的完整植株。

2、切取虎杖无菌组培苗的叶片外植体作为感染材料备用。

3、野生型发根农杆菌菌株ATCC11325通常于添加有20％甘油的YEB液体培养基中-20℃避光保存。从冰箱中取出发根农杆菌菌株ATCC11325平衡30min，然后在超净工作台上吸取500μl菌液于已灭菌的100ml新鲜YEB培养液中，25℃、140r·min^-1、黑暗振荡培养22h即可使用。

4、用无菌解剖刀小心划伤叶片表面以形成伤口，放入活化好的农杆菌菌液中浸泡10min，轻轻摇动使之充分接触。取出感染材料，用无菌吸水纸轻轻蘸干多余菌液，使叶片上表皮向下放置于MS₀培养基中，25℃、黑暗条件下进行共培养。感染一周左右叶片表面划伤处开始出现密集丛生的毛状根(图1)，向下扎入培养基中迅速生长。持续共培养20～30d即可形成大量丰富的毛状根系(图2)。其间未出现农杆菌生长情况，因此省去除菌环节。

5、毛状根的分子鉴定：毛状根转基因性质的鉴定采用聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction，PCR)，设计发根农杆菌Ri质粒中T_L-DNA或T_R-DNA上与生根有关的基因引物，提取毛状根基因组DNA进行扩增，对扩增的产物通过琼脂糖电泳进行分析鉴定，确定得到的特异性基因片段。rolb基因是发根农杆菌Ri质粒T_L-DNA(T-DNA左臂)上与生根密切相关的一个基因，而tms基因则位于T_R-DNA(T-DNA右臂)上，参与编码生长素的合成，如果所诱导的毛状根具有转发根农杆菌T-DNA性质，则通过设计T_L-DNA或T_R-DNA上特异的基因引物，与提取的毛状根基因组DNA进行PCR扩增。具体操作参照王关林等编《植物基因工程原理及技术》(1998年科学出版社)。

从图4、图5显示的结果可见，利用rolb及tms的PCR引物，能从感染后的虎杖叶片及毛状根总DNA中分别扩增到期望的422bp和910bp左右的特异性DNA片段，而从未转化的自然根及未感染的叶片总DNA中扩增不到任何片段。这说明，发根农杆菌ATCC11325Ri质粒的T_L-DNA和T_R-DNA部分已在虎杖毛状根基因组中得到整合与表达。

6、对筛选的毛状根进行优化培养，采用1/2MS₀液体培养基，不添加其他植物生长调节剂(如 NAA、CPPU、TDZ或乙烯利)，调节pH值为6.0～6.5，并附加3％蔗糖作为碳源。温度：22～27℃，摇床转速：120～140 r·min^-1，黑暗或弱光下进行培养。继代培养时接种量控制在0.5～1.0g(鲜重)毛状根：100～150ml培养液较适宜。在毛状根生长最快的指数期(6～24天)采取补液培养的方式，能够最大程度地收获培养物。毛状根在液体培养基中能够自主快速增殖如图3，培养过程中日增长量平均为0.214～0.275g干重/天，30天的生长量(鲜重)为接种量的7～9倍，干重增长率可达到8.29，是相同条件下悬浮培养细胞的192.8倍，是自然根培养物的8.4倍。

7、从培养液中取出毛状根，低温(45℃)干燥至恒重后，用研钵研成细粉，过60目筛，用50％(V∶V，以下同)乙醇结合30～40min超声波处理进行提取，之后3000r/min离心15～20min，取上清液减压浓缩，再经过柱层析分离、浓缩、结晶、冷冻干燥，即可得到纯度较高的虎杖苷和白藜芦醇。

8、利用高效液相色谱法(HPLC)检测毛状根中虎杖苷和白藜芦醇含量，与标准品图6、图7比对发现，虎杖毛状根中含有虎杖苷和白藜芦醇成分如图8所示。用本发明提供的毛状根系与培养方法，毛状根日增长量平均为0.214～0.275g干重/天，虎杖苷含量可达培养物干重的0.18～0.22％，白藜芦醇含量可达培养物干重的0.05～0.0g％。

9、将优良毛状根株系转接于添加有适量活性碳，如1-2％，并提高蔗糖含量如5-10％的MS固体培养基中进行固体种质保存，用于工业化生产在优化条件下扩大培养以便定期收获毛状根。

实施例2

在步骤(2)中切取虎杖无菌苗的茎段作为感染材料。步骤(3)中，同时加入根癌农杆菌C58菌液500μl于100ml YEB培养液中，和发根农杆菌ATCC11325在25℃、140r·min^-1、黑暗共培养22h后使用。步骤(4)中，茎段外植体在双菌活化液中浸泡10min，黑暗条件下置于MS₀中共培养。步骤(5)中，对茎段诱导获得的毛状根分离培养后进行PCR分子鉴定；步骤(6)中，对茎段诱导获得的毛状根进行优化培养，获得大量增殖的毛状根株系。步骤(7)中，从茎段诱导获得的毛状根中提取、分离、纯化虎杖苷和白藜芦醇产品。步骤(8)中，利用HPLC法对茎段诱导获得的毛状根中虎杖苷和白藜芦醇的含量进行检测。步骤(9)中，对茎段诱导获得的毛状根筛选后直接进行液体扩大培养，采用1/2MS₀液体培养基，在优化的条件下培养，收获得到的大量毛状根培养物用来提取虎杖苷和白藜芦醇产品，其他同实施例1。

实施例3

在步骤(2)中切取虎杖无菌苗的幼芽作为感染材料。步骤(3)中，发根农杆菌ATCC11325在26℃、150r·min^-1、黑暗共培养24h后使用。步骤(4)中，幼芽外植体浸泡于100ml活化菌液中，在超声波振荡器中处理5～10sec，取出吸干多余菌液后，黑暗条件下置于MS₀中共培养。步骤(5)中，对幼芽诱导获得的毛状根分离培养后进行PCR分子鉴定；步骤(6)中，对幼芽诱导获得的毛状根进行优化培养，获得大量增殖的毛状根株系。步骤(7)中，从幼芽诱导获得的毛状根中提取、分离、纯化虎杖苷和白藜芦醇产品。步骤(8)中，利用HPLC法对幼芽诱导获得的毛状根中虎杖苷和白藜芦醇的含量进行检测。步骤(9)中，对幼芽诱导获得的毛状根筛选后直接进行液体扩大培养，采用1/2MS₀液体培养基，在优化的条件下培养，收获得到的大量毛状根培养物用来提取虎杖苷和白藜芦醇产品，其他同实施例1。

实施例4

在步骤(2)中切取虎杖无菌苗的成熟叶片(叶长≥1.5cm)作为感染材料。步骤(3)中，发根农杆菌ATCC11325在27℃、140r·min^-1、黑暗共培养20h后使用。步骤(4)中，叶片外植体浸泡于100ml活化菌液中，在微波炉中辐射处理5～10sec，取出吸干多余菌液后，黑暗条件下置于MS₀中共培养。步骤(5)中，对叶片诱导获得的毛状根分离培养后进行PCR分子鉴定；步骤(6)中，对叶片诱导获得的毛状根进行优化培养，获得大量增殖的毛状根株系。步骤(7)中，从叶片诱导获得的毛状根中提取、分离、纯化虎杖苷和白藜芦醇产品。步骤(8)中，利用HPLC法对叶片诱导获得的毛状根中虎杖苷和白藜芦醇的含量进行检测。步骤(9)中，对叶片诱导获得的毛状根筛选后直接进行液体扩大培养，采用1/2MS₀液体培养基，在优化的条件下培养，收获得到的大量毛状根培养物用来提取虎杖苷和白藜芦醇产品，其他同实施例1。

实施例5

在步骤(2)中切取虎杖无菌苗叶片的叶柄部分作为感染材料。步骤(3)中，发根农杆菌ATCC11325在24℃、130r·min^-1、黑暗共培养23h后使用。步骤(4)中，叶柄外植体浸泡于100ml活化菌液中8min，取出吸干多余菌液后，黑暗条件下置于MS₀中共培养。步骤(5)中，对叶柄诱导获得的毛状根分离培养后进行PCR分子鉴定；步骤(6)中，对叶柄诱导获得的毛状根进行优化培养，获得大量增殖的毛状根株系。步骤(7)中，从叶柄诱导获得的毛状根中提取、分离、纯化虎杖苷和白藜芦醇产品。步骤(8)中，利用HPLC法对叶柄诱导获得的毛状根中虎杖苷和白藜芦醇的含量进行检测。步骤(9)中，对叶柄诱导获得的毛状根筛选后直接进行液体扩大培养，采用1/2MS₀夜体培养基，在优化的条件下培养，收获得到的大量毛状根培养物用来提取虎杖苷和白藜芦醇产品，其他同实施例1。

实施例6

在步骤(2)中切取虎杖无菌苗的成熟叶片(叶长≥1.5cm)作为感染材料。步骤(3)中，发根农杆菌ATCC11325在23℃、130r·min^-1、黑暗共培养23h后使用。步骤(4)中，叶片外植体浸泡于100ml活化菌液中15min，取出吸干多余菌液后，使叶片上表皮向上放置于MS₀培养基中，弱光条件下进行共培养。步骤(5)中，对叶片诱导获得的毛状根分离培养后进行PCR分子鉴定；步骤(6)中，对叶片诱导获得的毛状根进行优化培养，获得大量增殖的毛状根株系。步骤(7)中，从叶片诱导获得的毛状根中提取、分离、纯化虎杖苷和白藜芦醇产品。步骤(8)中，利用HPLC法对叶片诱导获得的毛状根中虎杖苷和白藜芦醇的含量进行检测。步骤(9)中，对叶片诱导获得的毛状根筛选后直接进行液体扩大培养，采用1/2MS₀液体培养基，在优化的条件下培养，收获得到的大量毛状根培养物用来提取虎杖苷和白藜芦醇产品，其他同实施例1。

本发明列举的实施例旨在更进一步地阐明这种组培诱导虎杖毛状根制备虎杖苷的方法，而不对本发明的范围构成任何限制，用本发明实施例得到的产品和经由本发明权利要求书所述均可得到组培诱导虎杖毛状根制备虎杖苷及白藜芦醇产品。需要说明的是白藜芦醇及其苷在植物体内可以相互转化，因此对其含量需要有全面的评价。

实施例中涉及的缩写术语、培养基及统计方法说明：

1、菌种：发根农杆菌ATCC11325和根癌农杆菌C58购自中国科学院微生物研究所菌种保存中心。

2、农杆菌活化培养基：YEB(yeast e×tract bacto)培养基，是基因工程领域常用的培养农杆菌的培养基，其配方可在基因工程的实验指导手册中获得。

3、植物培养基：MS(Murashige & Skoog，1962)培养基，是植物组织培养领域常用的基本培养基，在组织培养方面的教科书或实验指导手册中均可获得其配方。MS₀指未添加任何生长调节剂的MS基本培养基；1/2MS₀指大量元素成分减半的MS₀培养基。

4、标准品：白藜芦醇(resveratrol，纯度99％)购自Sigma公司；虎杖苷(polydatin，纯度98％)购自天津尖峰天然产物研究开发有限公司。

6、干重增长率＝(收获干重-接种干重)/接种干重；毛状根诱导率＝产生毛状根外植体数/总外植体数×100％；诱根密度＝毛状根产生的条数/生根外植体数。有效成分含量(％)＝有效成分质量(g)/100g培养物干重。