黑曲霉和反-香豆酸对虎杖愈伤组织的白藜芦醇影响及毛状根诱导研究

摘要

虎杖为蓼科萝属多年生草本植物，为常用中药。其主要活性成分自藜芦醇是一种天然抗毒素，是目前研究较为热门而被认为是最有希望的天然化学防癌剂之一。本研究以虎杖的幼嫩茎段为外植体，以其诱导出的愈伤组织为材料，通过添加黑曲霉诱导子和前体物质反-香豆酸研究了愈伤组织的生长和白藜芦醇含量的变化，并对虎杖毛状根的诱导方式进行了研究。主要研究结果如下： ⑴愈伤组织中的白藜芦醇和虎杖苷含量随着反-香豆酸而增加，A3处理下，白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量均达到最大值，分别为69．79μg·g-1和96．97μg·g-1，较对照高出50．6％和52．3％。各处理愈伤组织中的白藜芦醇含量在生长周期内呈现出先升高后降低的趋势，且白藜芦醇峰值的出现时间均在第20 d。由此可以看出，以白藜芦醇含量为标准，虎杖愈伤组织的最佳收获时间是20 d左右。 ⑵对黑曲霉诱导子浓度、诱导培养时间进行筛选。结果表明，当在接种后第15d加入100mg·L-1的黑曲霉诱导子，诱导5d的效果最好，可以使处理中自藜芦醇和白藜芦醇苷的含量分别比对照高63．7％，46．2％。 ⑶通过添加黑曲霉诱导子、反-香豆酸的不同组合，发现各组合对白藜芦醇的合成均有一定促进作用，黑曲霉诱导子-反-香豆酸的C2组合对白藜芦醇和白藜芦醇苷的积累效果最好，分别较对照提高了77％、55．30％。 ⑷反-香豆酸对这三种酶活性都有一定影响。处理中POD活性的测定结果表明，处理和对照的变化趋势较一致，各处理的变化趋势为升-降（A3、A4呈略降-升-降-升的趋势）在第10d达到高峰； SOD活性的测定结果表明，处理和对照的变化趋势一致，变化为升-降-升-降，在第5d达到高峰；BGL活性的测定结果表明，处理和对照的变化趋势一致，变化为升-降-升-降，在第15d达到最大高峰；H2O2含量测定结果表明，处理和对照的变化趋势较一致，趋势为升-降-升-降，在第5d、20d达到高峰。 ⑸黑曲霉诱导子对这三种酶活性都有一定影响。处理中POD活性的测定结果表明，处理与对照的变化趋势一致，各处理的变化趋势为升-降-升-降趋势，在第5d达到高峰；对SOD活性的测定结果表明，处理和对照的变化趋势较一致，趋势为降-升-降，处理在第7d达到最大高峰，而CK在第5d达到最大高峰；BGL活性的测定结果表明，处理和对照的变化趋势一致，各处理的变化趋势为降-升-降-升-降趋势，在第5d达到晟大高峰；H2O2含量测定结果表明，处理和对照的变化趋势较一致，趋势为升-降-升-降，在第3d达到最大高峰。 ⑹添加黑曲霉诱导子，反-香豆酸对这3种酶活性都有一定影响。对处理中POD活性的测定结果表明，处理和对照的变化趋势一致，各处理的变化趋势为升-降趋势，在第4d达到最大高峰； SOD活性的测定结果表明，处理和对照的变化趋势一致，趋势为降-升-降，在第4d达到最大高峰；BGL活性的测定结果表明，处理和对照的变化趋势一致，各处理的变化趋势为升-降趋势，在第4d达到最大高峰；H2O2含量测定结果表明，处理（C1、C2）和对照的变化趋势较一致，趋势为升-降-升-降，在第3d达到最大高峰。 ⑺经PCR检测，证实农杆菌Ri质粒中的rolB基因转入毛状根中，毛状根平均诱导率可达到40％，诱根密度为6．4；在加入诱发因子AS后，虎杖毛状根平均诱导率可提高到67，5％，诱根密度达到13．7。通过综合比较，AS的浓度以50～100mg·L-1为宜，共培养时间以2～3d为宜。 ⑻诱导出来的虎杖毛状根经HPLC测定，结果为虎杖毛状根中含有白藜芦醇和白藜芦醇苷，其含量分别为8．21μg·g-1、215．33μg'g-1。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略符号与中英文对照表

声明

1 前言

1.1 虎杖

1.2 白藜芦醇

1.2.1 白藜芦醇理化性质

1.2.2 白藜芦醇生物合成

1.2.3 白藜芦醇研究现状

1.3 前体物及真菌诱导子对组织培养中次生代谢的影响

1.3.1 前体物

1.3.2 诱导子

1.4 毛状根

1.4.1 毛状根概念

1.4.2 发根农杆菌的生物学特性

1.4.3 Ri 质粒的结构与功能

1.4.4 毛状根的特点

1.4.5 影响植物毛状根形成的因素

1.4.6 毛状根在药用植物中的应用

1.5 目的意义

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.2 试验设计

2.2.1 虎杖愈伤组织无菌体系的建立

2.2.2 反—香豆酸前体物对虎杖愈伤组织影响

2.2.3 黑曲霉诱导子对虎杖愈伤组织影响

2.2.4 反—香豆酸和黑曲霉协同对虎杖愈伤组织影响

2.3 影响因子对毛状根诱导影响

2.3.1 发根农杆菌的活化、培养及工程菌液的制备

2.3.2 毛状根的诱导

2.3 测定项目与方法

2.3.1 白藜芦醇及白藜芦醇苷含量的测定

2.3.2 β—葡萄糖苷酶(BGL)测定

2.3.3 POD测定

2.3.4 SOD测定

2.3.5 H2O2测定

2.4 毛状根的转化与检验

2.4.1 诱发因子、共培养时间对毛状根诱导计算

2.4.2 毛状根的形态学上的检验

2.4.3 分子生物学检验

2.5 数据分析与处理

3 结果分析

3.1 反—香豆酸对虎杖愈伤组织Res及PD含量和生理生化的影响

3.1.1 反—香豆酸对虎杖愈伤组织H2O2含量影响

3.1.2 反—香豆酸对虎杖愈伤组织的SOD活性影响

3.1.3 反—香豆酸对虎杖愈伤组织的POD影响

3.1.4 反—香豆酸对虎杖愈伤组织的β—葡萄糖苷酶(BGL)活性影响

3.1.5 反—香豆酸对虎杖愈伤组织的PD、Res含量影响

3.2 黑曲霉诱导子对虎杖愈伤组织Res和PD含量及生理生化影响

3.2.1 黑曲霉诱导子对虎杖愈伤组织H2O2含量影响

3.2.2 黑曲霉诱导子对虎杖愈伤组织的SOD影响

3.2.3 黑曲霉对虎杖愈伤组织的POD影响

3.2.4 黑曲霉诱导子对虎杖愈伤组织BGL活性影响

3.2.5 黑曲霉诱导子对虎杖愈伤组织的PD、Res含量影响

3.3反—香豆酸和黑曲霉诱导子协同作用对虎杖愈伤组织Res和PD含量及生理生化影响

3.3.1 反—香豆酸和黑曲霉诱导子协同作用对虎杖愈伤组织的H2O2含量影响

3.3.2 反—香豆酸和黑曲霉诱导子协同作用对虎杖愈伤组织的SOD活性影响

3.3.3 反—香豆酸和黑曲霉诱导子协同作用对虎杖愈伤组织POD影响

3.3.4 反—香豆酸和黑曲霉诱导子协同作用对虎杖愈伤组织BGL影响

3.3.5 反—香豆酸和黑曲霉诱导子协同作用对虎杖愈伤组织的PD、Res影响

3.4 乙酰丁香酮和培养时间对毛状根诱导影响

3.4.1 乙酰丁香酮和培养时间对毛状根的诱导率影响

3.4.2 乙酰丁香酮和共培养时间对毛状根的诱根密度

3.5 毛状根检测

3.5.1 形态检测

3.5.2 虎杖毛状根分子生物学检测

3.6 毛状根中的Res、PD含量

4 讨论

4.1 反—香豆酸和黑曲霉对虎杖愈伤组织中H2O2的影响

4.2 反—香豆酸和黑曲霉对虎杖愈伤组织中POD、SOD的影响

4.3 反—香豆酸和黑曲霉对虎杖愈伤组织的β—葡萄糖苷酶活性影响

4.4 反—香豆酸和黑曲霉与虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的关系

4.4.1 添加前体物反—香豆酸后对Res、PD的影响

4.4.2 添加黑曲霉诱导子后对Res、PD的影响

4.4.3 前体物反—香豆酸和黑曲霉诱导子协同作用对Res、PD的影响

4.5 乙酰丁香酮和共培养时间对毛状根诱导影响

4.6 虎杖毛状根中Res、PD含量

5 结论

参考文献

附 图

致 谢

作者在读期间参与课题及其发表论文